Mediciones de flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células vivas y permeabilizadas

1. Adición de células HEK 293T a la cámara de respirometría de alta resolución

1. Agregue el medio de respiración mitocondrial MiR05 en la cámara limpia de Oroboros. Cierre la cámara insertando el tapón y extrae el exceso de medio del receptáculo del tapón utilizando el sistema de succión.
2. Para agregar células HEK 293T a la cámara mediante reemplazo parcial de volumen, calcule el volumen de la suspensión de células requeridas para alcanzar una concentración de células experimentales de 1 millón / ml.
3. Retire el tapón de la cámara.
4. Retire un volumen de MiR05 de la cámara correspondiente al volumen calculado de la suspensión madre celular con una pipeta.
5. Vuelva a suspender la suspensión de células a fondo con una pipeta.
6. Agregue el volumen calculado de la suspensión de células a la cámara.
   NOTA: La cámara de respirometría debe estar limpia y llena de MiR05, el sensor de oxígeno polarográfico debe calibrarse a temperatura estable y se debe cargar previamente un protocolo de titulación de inhibidor de desacoplamiento de sustrato (SUIT) en el software DatLab. La concentración de muestra/célula experimental puede variar según la muestra específica o el tipo de célula. La Figura 1 muestra un ejemplo de respirometría de alta resolución de células HEK 293T.
7. Cierre la cámara insertando el tapón y asegurándose de que no queden burbujas atrapadas dentro de la cámara.
   1. Extrae cualquier exceso de líquido del receptáculo del tapón.
8. Espere a que se estabilice el flujo de oxígeno, lo que generalmente demora unos 15 minutos.

2. Manipulación de microjeringas

1. Prepara las microjeringas.
   1. Seleccione y limpie la microjeringa adecuada según el tipo de producto químico y el volumen a valorar. Coloque la microjeringa en la rejilla de la jeringa.
   2. Llene la jeringa, teniendo cuidado de no incluir burbujas de gas.
      NOTA: Si se forman burbujas de gas, elimínelas moviendo el émbolo lentamente hacia arriba y rápidamente hacia abajo varias veces.
2. Verifique el protocolo SUIT para conocer el volumen requerido del producto químico a valorar.
   1. Llene la jeringa con al menos 1 μl más del volumen requerido.
   2. Presione el émbolo hasta alcanzar la marca deseada en el cilindro de vidrio, asegurándose de que aparezca una pequeña gota en la punta de la aguja (cebado).
   3. Limpie la gota en la pared del vial químico antes de continuar con la valoración.

3. Titulación de productos químicos siguiendo el protocolo SUIT

1. Valorar los productos químicos indicados por el protocolo SUIT.
   NOTA: Abra la ventana de eventos de DatLab haciendo clic en el evento en la barra lateral del protocolo antes de valorar.
   1. Inserte la aguja completamente a través del capilar del tapón hasta que la terminación del cilindro de vidrio esté en contacto con el tapón.
   2. Inyecte el producto químico en la cámara rápidamente. ​
      NOTA: Después de una inyección, un artefacto de titulación rápida y transitoria puede aparecer como un pico en el flujo de O₂ (Figura 2A).
   3. Agregue digitonina a una concentración final de 5 μg / ml.
      CAUTELA: La digitonina es tóxica si se ingiere.
   4. Haga clic en Aceptar en la ventana del evento para configurar el evento correspondiente.
   5. Extrae el exceso de líquido del receptáculo del tapón.
   6. Espere a que se estabilice el flujo de oxígeno y registre durante al menos 2 min.
   7. Agregue piruvato a la cámara para alcanzar una concentración final de 5 mM. Haga clic en Aceptar en la ventana del evento para configurar el evento correspondiente.
      NOTA: Realice la siguiente valoración sin demora.
   8. Agregue malato inmediatamente después del piruvato para alcanzar una concentración final de 2 mM. Haga clic en Aceptar en la ventana del evento para configurar el evento correspondiente.
   9. Extrae el exceso de líquido del receptáculo del tapón, espera a que se estabilice el fundente y graba durante unos 2 min.
   10. Agregue difosfato de adenosina (ADP) a una concentración final de 2,5 mM. Haga clic en Aceptar en la ventana del evento para configurar el evento correspondiente.
   11. Extrae el exceso de líquido del receptáculo del tapón, espera a que se estabilice el fundente y graba durante unos 2 min.
       NOTA: Después de la adición de ADP, el flujo puede continuar aumentando lentamente, tardando hasta 20 minutos en estabilizarse.
   12. Agregue cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (CCCP) en incrementos de 0,5 μM para alcanzar el flujo máximo. Haga clic en Aceptar en la ventana de eventos para establecer el evento correspondiente después de cada valoración.
       CAUTELA: CCCP es tóxico si se ingiere.
       NOTA: Realice valoraciones CCCP en una serie rápida (intervalos de aproximadamente 1,5 minutos). Detenga la valoración cuando la adición posterior no aumente aún más el flujo. Modifique el nombre de cada valoración de CCCP en la ventana de eventos sustituyendo * por la concentración acumulada de CCCP.
   13. Extrae el exceso de líquido del receptáculo del tapón y graba durante unos 2 min.
   14. Agregue antimicina A para alcanzar una concentración final de 2,5 μM.
       CAUTELA: La antimicina A es mortal si se ingiere.
       NOTA: El tiempo de respuesta puede variar según la muestra.
   15. Extrae el exceso de líquido del receptáculo del tapón y graba durante unos 2 min.
   16. Haga clic en el botón Detener medición.

4. Análisis de datos

1. Analice los datos.
   1. Establezca marcas en secciones estables y representativas del gráfico de flujo.
      NOTA: Evite incluir artefactos de valoración en el análisis de las trazas (Figura 2B).
2. Selecciona Marcas en el menú superior y, a continuación, selecciona Marcar estadísticas. Seleccione el modo de estadísticas deseado y haga clic en Copiar al portapapeles para transferir los datos para su posterior análisis.

Figura 1: Respirometría de alta resolución de células HEK 293T. Trazas de concentración de O2 [μM] (líneas azules) y flujo de O2 específico del volumen [pmol∙s-1∙mL-1] (líneas rojas; corregido por flujo de O2 de fondo instrumental; se eliminaron los picos causados por las valoraciones). SUIT-002_O2_ce-pce_D007 es un protocolo extenso e incluye la adición de células ce1, respiración rutinaria R de células vivas. +Dig, digitonina 10 μg·mLL-1; permeabilización de membranas plasmáticas (CE a PCE), respiración endógena residual Ren. +D, ADP 2,5 mM estimulando el consumo de sustrato endógeno residual. +M.1, malato 0,1 mM y 1Oct, octanoilcarnitina 0,5 mM; capacidad OXPHOS de la vía F, 1c, citocromo c 10 μM; prueba de integridad de la membrana externa mitocondrial, 2M2, malato 2 mM que apoya la vía N anaplerósica; F(N)P. 3P y 4G, piruvato 5 mM y glutamato 10 mM, activación progresiva a FNP. 5S, succinato 10 mM, FNSP. 6Gp, glicerofosfato 10 mM, FNSGpP. 7U4.5, valoraciones del desacoplador a una concentración óptima de CCCP de 4,5 μM; FNSGpE. 8Rot, rotenona 0,5 μM SGpE. 9Ama, antimicina A 2,5 μM, rox. 10AsTm, ascorbato 2 mM y TMPD 0,5 mM, O2 flujo fuera de escala 121 pmol·sL-1·mLL-1. 11Azd, azida 200 mM, fondo químico chb. Concentración celular 1 millón por mL, medio MiR05, temperatura 37 °C. La concentración de oxígeno se mantuvo por encima de 60 μM mediante reoxigenaciones intermitentes (aire, cámara abierta, tono azul).

Figura 2: Protocolo simplificado de sustrato-desacoplador-inhibidor-titulación (SUIT) con células HEK 293T para resaltar el momento adecuado de las titulaciones químicas. (A) muestra los picos causados por las valoraciones, que se eliminan en (B). Trazas superpuestas de flujo de O2 por volumen [pmol∙s-1∙mL-1] para la cámara A (línea magenta) y la cámara B (línea verde). Adición de células (ce1) y medición de la respiración rutinaria R. +Dig, titulación de digitonina 5 μg·mL-1 para permeabilizar la membrana plasmática (ce a pce) y medir la respiración endógena residual. 1PM, adición en la secuencia cercana de piruvato (5 mM) y malato (2 mM) para estimular la respiración de la vía N FUGA NL. 2D, adición de ADP 2,5 mM; Capacidad de OXPHOS de la vía NP. 3U5, valoraciones rápidas del desacoplador en pasos de 0,5 μM a la concentración óptima de CCCP; Capacidad ET vinculada al NADH NE. 4Ama, titulación de antimicina A 2,5 μM para evaluar el consumo de oxígeno residual rox. Concentración celular 1 millón/ml, medio MiR05, temperatura 37 °C