Citometría de flujo fotoacústica in vitro: una técnica fotoacústica de flujo no invasiva para detectar células de cáncer de ovario circulantes portadoras de nanopartículas

Arquitectura del sistema de flujo

1. Construcción de la cámara de flujo

1. Con el archivo Solid Works proporcionado, imprima en 3D el tanque de flujo con termoplástico ABS o plástico PLA. A continuación se proporcionan las dimensiones si SolidWorks no está disponible. La figura 1A muestra una representación de este modelo. El cuerpo del tanque de flujo mide 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Los extremos del tanque de flujo incluyen orificios de aproximadamente 5 mm de diámetro para permitir la entrada de la tubería que contiene el tubo capilar.
   nota: El tanque de flujo tiene un orificio de 1 cm, perpendicular a la orientación del tubo capilar, para la colocación del transductor de ultrasonidos. Una extrusión cilíndrica con el mismo diámetro interior que el orificio se extiende 6 mm en el tanque. Para obtener imágenes en tiempo real, el tanque de flujo tiene una ranura de 1 mm x 3 mm directamente debajo del tubo capilar.
2. Después de imprimir el tanque de flujo en 3D, limpie y ensamble el sistema para su uso.
3. Coloque cubreobjetos de vidrio sobre la ranura de 1 mm x 3 mm y el orificio de 1 cm en el sistema de flujo.
4. Selle cuidadosamente con silicona para evitar fugas.
5. Coloque el tubo capilar en los tubos curados con silicona. Inserte los tubos en la cámara de flujo a través del costado del tanque de flujo de modo que el tubo capilar de vidrio quede directamente encima y delante de la ranura de 3 mm y el orificio de 1 cm.
6. Selle el tubo con silicona para evitar fugas.

>2. Configuración del sistema de flujo fotoacústico

NOTA: Las figuras 1B y 1C muestran un ejemplo de la arquitectura del sistema de flujo.

1. Conecte el transductor a un emisor/receptor de ultrasonido. Amplifica la señal con una ganancia de 59 dB.
2. Conecte la salida del filtro a un osciloscopio reconfigurable multipropósito equipado con un conjunto de puertas programables en campo incorporado.
3. Conecte uno de los tubos que salen de la cámara de flujo a una unión en T, conectada a dos bombas de jeringa en cada rama.
4. Llene una de las bombas de jeringa con aire y la otra bomba con la muestra a analizar. Ajuste la bomba que contiene aire a un caudal de 40 μL/min y la bomba que contiene la muestra a un caudal de 20 μL/min. El flujo bifásico resultante producirá volúmenes de muestra de 1 μL. A este caudal, el sistema analizará aproximadamente 6,4 muestras por minuto.
   nota: Para mantener una distribución uniforme de las células, agite ligeramente cada muestra inmediatamente antes de ser analizada. Además, gire la jeringa cada pocos minutos para evitar que las células se depositen en la solución.
5. Conecte el tubo restante que sale del sistema de flujo a un recipiente con 10% de lejía, para desechar las celdas después de que salgan del sistema de flujo.
   nota: Antes de utilizar el sistema de flujo, verifique si hay fugas, ya que pueden afectar el flujo. Las células deben estar contenidas dentro de un sistema cerrado para mantener la seguridad biológica durante el procedimiento.
6. El diseño del tanque impreso en 3D permite una alineación consistente y repetible entre el transductor y la luz láser con una calibración mínima. Cuando se coloca correctamente dentro del tanque personalizado, el tubo capilar de cuarzo garantiza que el transductor y el láser estén alineados directamente.
7. Coloque la sección del tubo capilar de cuarzo en alineación directa con el transductor, en el campo de visión del microscopio, permitiendo una colocación cuidadosa de la fibra óptica sobre la muestra de modo que ilumine todo el ancho del tubo.
8. Irradie la muestra utilizando una fibra óptica que canaliza un láser de estado sólido bombeado por diodo que funciona a una longitud de onda de 1.053 nm. La luz láser que incide sobre la muestra y el transductor utilizado para medir el efecto fotoacústico están desenfocados.
9. La energía del láser que incide en la muestra es de aproximadamente 8 mJ y la velocidad del láser de 10 Hz es suficiente para iluminar cada muestra varias veces a medida que pasa por el sistema.
10. Coloque el sistema de flujo encima de un microscopio invertido y asegúrese de que tanto el pulso láser como la trayectoria de la muestra sean visibles a medida que la muestra pasa a través del sistema de flujo. Registre el flujo con una cámara montada en un microscopio.
11. Registre las adquisiciones de ultrasonido utilizando un software de adquisición de datos. Disparo de ultrasonido y láser pulsado usando el FPGA. Utilice PBS con 2% de Tween, y FA-CuS NPs a una concentración de 100 μg/mL en PBS 2% Tween, como controles negativos y positivos, respectivamente.
12. Utilizando una cámara montada en un microscopio, registre tanto el disparo del láser como el paso de las muestras a través del sistema de flujo. Estas grabaciones se utilizarán para correlacionar la señal acústica registrada por el transductor con el disparo del láser. A medida que las muestras pasan por delante del disparo del láser, la señal se puede correlacionar con la señal fotoacústica resultante para su análisis. A una frecuencia de muestreo de 10 Hz, el láser iluminará cada enchufe varias veces.

Figura 1. Imágenes representativas del sistema de citometría de flujo fotoacústico y de la cámara de flujo.(A) Vista detallada de la cámara de flujo impresa en 3D. (B) Diagrama del sistema PAFC. (C) Arquitectura del sistema de flujo: SP = bomba de jeringa; DAQ/FPGA = adquisición de datos/matriz de puertas programables en campo; Ob = lente del objetivo; OF = fibra óptica; FC = acoplador de fibra; UT = transductor de ultrasonido; FT = tanque de flujo.