Ensayo de trasplante de almohadilla de grasa ovárica: una técnica in vivo para introducir células en almohadilla de grasa ovárica en modelos de ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Trasplante de almohadilla de grasa ovárica

NOTE: Desinfecte los instrumentos entre cada cirugía animal. Prepare y organice todo el equipo con anticipación. Los trasplantes dorsales a la almohadilla de grasa ovárica derecha son preferentes, ya que evita el bazo. Sin embargo, las receptoras pueden tener trasplantes en ambas almohadillas de grasa ovárica.

1. Utilice ratones singénicos o ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID/NCr) como receptores de células primarias. En el caso de las células humanas, como las células HIO118, utilice ratones Nod/SCID/gamma (NSG) o ratones SCID.
2. Anestesiar al ratón receptor con una única inyección intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a una dosis de 0,15 mL/10 g de peso corporal. Coloque al animal en una almohadilla térmica en el capó del animal y confirme la anestesia adecuada mediante la pérdida del reflejo del pie (pellizco de los dedos del pie). Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras el animal está bajo anestesia. Inyectar al animal por vía subcutánea el analgésico Ketoprofeno a una dosis de 4 mg/g de peso corporal para tratar el dolor postquirúrgico.
   NOTE: Como alternativa, use isoflurano para la anestesia. Coloque el animal en la cámara de inducción y ajuste el caudalímetro de oxígeno a 0,8-1,5 L/min y el vaporizador de isoflurano a 2-3%. Retire al animal anestesiado de la cámara, déjelo respirar isoflurano de una máscara y ajuste el caudalímetro de oxígeno a 0,4-0,8 L/min y el vaporizador de isoflurano a 1,5%, luego comience la cirugía.
3. Afeitar el área quirúrgica con una maquinilla #40; quitar el vello de un sitio dos veces mayor que el área quirúrgica, preparar la piel afeitada con tres exfoliantes antisépticos de povidona yodada, seguidos de etanol al 70%, y cubrir con un paño estéril.
4. Mueva al animal bajo un microscopio de disección ubicado en un gabinete de bioseguridad. Exponga el tracto reproductivo mediante una incisión en la posición dorsomedial directamente encima de la almohadilla de grasa ovárica.
   PASO CRÍTICO: La incisión precisa en la piel facilita la cicatrización de heridas; En el paso 1.4 se recomienda el uso de un bisturí.
5. Con pinzas finas y romas, tire de la almohadilla de grasa ovárica con cuidado a través de la incisión hacia la línea media, minimizando el daño a los nervios y los vasos sanguíneos principales><. PASO CRÍTICO: Si se produce sangrado, detenga la cirugía y considere la posibilidad de trasplantarla a un animal huésped diferente.
6. Bajo el control del microscopio de disección con la ayuda de una aguja biselada de calibre 28, haga una incisión profunda de 2-4 mm en la almohadilla de grasa ovárica, 3-4 mm por encima del ovario.
   CPASO ARTÍSTICO: Asegúrese de que la incisión solo atraviese la mitad de la almohadilla de grasa; La perforación hasta la parte inferior provoca fugas. Sea rápido y proceda sin demora después de este paso.
7. Para trasplantes de células, llene una jeringa (aguja de calibre 30) con 10-20 μL de la mezcla de matriz de célula y membrana basal e inyéctela en la incisión de la almohadilla de grasa. Para el trasplante de trompas uterinas, tome la trompa uterina con pinzas finas y colóquela en una matriz de membrana basal de 10-20 μL mantenida en hielo. Con una punta de filtro graduada XL de 0,1-10/20 μL (acortada en 3 mm), recoja el tejido y la suspensión de la matriz de la membrana basal y suéltelo en la incisión de la almohadilla de grasa.
8. Espere 5 minutos para que la matriz de la membrana basal se solidifique y vuelva a colocar el tracto reproductivo en el peritoneo. Cierre los músculos con dos puntos de sutura quirúrgica y la piel con dos pequeños clips para heridas o suturas quirúrgicas.
9. Repita los pasos 1.4-1.8 para trasplantar una mezcla de matriz de PBS y membrana basal en la almohadilla de grasa contralateral del animal, que servirá como control.
   PASO CRÍTICO: Después de la cirugía, coloque al animal sobre una almohadilla térmica porque la pérdida de calor es rápida en ratones anestesiados.
10. Deje que el animal se recupere en una almohadilla térmica en la jaula nativa y observe al animal hasta que esté completamente despierto de la anestesia. No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
11. Coloque un puñado de gránulos de comida prehúmeda dentro de la jaula además de la comida seca en la jaula después de la cirugía. Aplique analgésicos postquirúrgicos si es necesario durante los próximos días y examine la herida diariamente. Aplique antibióticos de acuerdo con el protocolo aprobado para animales si se produce una infección de la herida. Retire los clips de la herida diez días después de la cirugía, cuando la herida se haya cerrado por completo.