Inoculación ortotópica de células de cáncer de ovario en ovarios murinos: un procedimiento para establecer un modelo de ratón de cáncer de ovario para estudiar la diseminación peritoneal de las células

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de suspensiones celulares

1. Línea celular de carcinoma de células claras de ovario humano
   1. Mantener las células ES-2 en medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina/estreptomicina (penicilina: 100 unidades/mL, estreptomicina: 0,1 mg/mL). Cultivo de células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
   2. Recoja células en la fase de crecimiento logarítmico en una solución de tripsina al 0,05%/EDTA al 0,02% (tripsina/EDTA).
      1. Primero, retire el medio viejo del recipiente de cultivo celular, luego lave las células una vez con PBS (PBS sin Ca²⁺/Mg²⁺,3-4 mL por 25 cm²).
      2. A continuación, añadir 1 mL por cada 25^cm2 de tripsina/EDTA. Gire el recipiente de cultivo celular para cubrir la monocapa celular con tripsina/EDTA. Después de retirar y desechar la tripsina/EDTA, vuelva a colocar el recipiente de cultivo celular en la incubadora durante 3-5 minutos o hasta que se desprendan las células.
      3. Examine las células bajo un microscopio para asegurarse de que las células estén separadas de la superficie del recipiente de cultivo celular y flotando.
      4. Añadir medio de crecimiento fresco que contenga suero para inactivar la tripsina (5 mL por 25^cm2) y resuspender las células. Transfiera las células resuspendidas a un tubo cónico de 15 mL.
      5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Realice la centrifugación a 4 °C o a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células con medio de crecimiento (5 mL por 25^cm2).
   3. Cuente las células (por ejemplo, por exclusión de tripano-azul), luego vuelva a suspender en el medio de crecimiento a una densidad de 2 x 10⁸ células/mL. Coloque las células suspendidas en hielo.
2. Descongele las alícuotas de hidrogel a base de matriz extracelular (MEC) congeladas en un baño de hielo.
3. Añadir la suspensión celular a las alícuotas de hidrogel a base de ECM en una proporción de 1:1 (concentración celular final: 1 x 10⁵ células/μL de hidrogel medio a base de ECM) y mezclar bien. Coloque las suspensiones celulares preparadas en un baño de hielo hasta su uso.

>2. Inoculación ortotópica con suspensiones celulares

NOTA: La cirugía no requiere una suite dedicada. La cirugía se puede realizar en una mesa de laboratorio en un área de la habitación que esté separada y tenga una actividad mínima. También se puede utilizar una campana laminar. Se deben usar instrumentos quirúrgicos estériles y no se deben usar tijeras para hacer incisiones en la piel.

1. Utilice ratones hembra desnudos (BALB/c nu/nu) a las 8 semanas de edad para este modelo de inoculación ortotópica.
2. En primer lugar, anestesiar al ratón mediante inhalación con isoflurano (2-4%). Verifique la profundidad del anestésico verificando la falta de retirada al pellizcar con firmeza el dedo del pie. Después de anestesiar al ratón, aplique un ungüento oftálmico estéril suave en los ojos para evitar que se seque según sea necesario.
3. Coloque el ratón anestesiado en una platina de operación, con el boca abajo. Desinfecte el área quirúrgica varias veces con alcohol y un exfoliante a base de yodo o clorhexidina.
4. Realice una incisión de 2 cm verticalmente cerca de la columna vertebral entre el arco costal derecho y el fémur. Use un paño quirúrgico estéril alrededor del sitio de la incisión. Fije las superficies de piel incisas con abrazaderas para mantener la abertura.
   nota: Se pueden utilizar retractores en lugar de abrazaderas.
5. A continuación, realice una segunda incisión (aproximadamente 1 cm) en el peritoneo parietal debajo de la primera incisión para abrir la cavidad abdominal. Pinza las superficies abdominales incisas. Cortar el tejido graso que rodea el ovario ipsilateral y la trompa de Falopio con una pinza para extirpar el ovario de la cavidad abdominal. Coloque cuidadosamente el ovario y la trompa de Falopio sobre una gasa. Luego, coloque el ratón con el vientre hacia abajo debajo del microscopio de disección.
6. Coloque la suspensión celular en una jeringa de insulina (1/2 cc, 29 G) justo antes de la inyección. Inyecte con cuidado la suspensión celular preparada (1-2 μL) en el ovario. Durante varios segundos, mantenga la aguja dentro del ovario para asegurar la gelificación del hidrogel a base de ECM. Después de la gelificación, las células tumorales inyectadas permanecen dentro del ovario.
7. Con cuidado, regrese el ovario al cuerpo. Suturar la segunda incisión con seda médica estéril y luego sellar la piel con clips para heridas.
8. Después de la cirugía, a los ratones se les administrará analgesia (p. ej., meloxicam, intramuscular o subcutáneo, 0,2 mg/kg) durante un período inicial de 24 horas.