Inyección intravenosa de células cancerosas en la vasculatura de la membrana corioalantoidea de pollo: un procedimiento para establecer un modelo de cáncer de membrana corioalantoidea para estudiar la invasión y metástasis del cáncer

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de las células cancerosas para la inyección

NOTA: La selección de colonias metastásicas se basa en un fenotipo establecido por células cancerosas fluorescentes, derivado de una biblioteca de expresión o vector marcado con proteína fluorescente como proteína fluorescente verde o roja (vea el flujo completo de la pantalla en la Figura 1A). No se recomienda utilizar células transfectadas transitoriamente con proteínas fluorescentes o marcadas con tintes fluorescentes permeables a las células debido al rápido desvanecimiento de la señal causado por la proliferación de células cancerosas y la tinción desigual.

1. Cultive las células cancerosas hasta una confluencia del 60-70% en el momento de la inyección. El uso de células cancerosas a niveles más altos de confluencia disminuirá su viabilidad, lo que resultará en una baja eficiencia en la formación de colonias metastásicas. Asegúrese de que las células cancerosas utilizadas estén libres de micoplasma, ya que la contaminación por micoplasma puede conducir a una disminución de la viabilidad del embrión de pollo.
2. Enjuague las células dos veces con 1x PBS, pH 7.4. Retire el PBS restante, luego agregue tripsina-EDTA al 0,5% e incube a 37 °C durante 2-5 minutos hasta que todas las células se levanten de la superficie de la placa de cultivo.
3. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue las celdas a temperatura ambiente a 200 x g durante 5 min.
4. Vuelva a suspender las células en 10 mL de PBS y vuelva a centrifugar las células como en el paso 1.3, para eliminar la tripsina y otros componentes de los medios de cultivo><, como los antibióticos. nota: La presencia de tripsina o componentes de cultivos celulares, como antibióticos, en la suspensión de células cancerosas puede resultar en una disminución de la viabilidad del embrión de pollo.
5. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 1 mL de PBS helado.
6. Cuente el número de células utilizando un hemocitómetro o cualquier otro equipo de conteo de células disponible.
   nota: Este protocolo de cribado requiere que cada colonia metastásica sea iniciada por una sola célula. Al contar las células, asegúrese de que las células estén completamente tripsinizadas y existan como una suspensión de una sola célula (no hay grupos de células presentes).
7. Para inyección intravenosa (IV), concentre las células a 0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ células/mL. Utilice 1x PBS helado para diluir y/o resuspender los concentrados celulares. Se espera que se necesite aproximadamente 1 mL de suspensión celular por cada diez embriones.
   nota: La concentración necesaria de suspensión celular en suspensión está determinada principalmente por el nivel de experiencia del experimentador. Consulte la siguiente sección para obtener más detalles.

>2. Inyección intravenosa de células cancerosas para la formación de colonias metastásicas

NOTA: Siguiendo este protocolo se pueden inyectar hasta cien embriones en un día. Por lo general, se tarda más tiempo en aislar las colonias metastásicas que en inyectar las células cancerosas y, por lo tanto, se recomienda realizar un experimento inicial para estimar el tiempo necesario para completar todos los pasos. El uso de etiquetas fluorescentes diferenciales para células cancerosas ayuda a reducir el número de animales y el tiempo necesario para cada experimento. Por ejemplo, las células de control se pueden marcar con RFP (proteína fluorescente roja), mientras que las células tumorales mutantes se pueden marcar alternativamente con GFP (proteína fluorescente verde). En este caso, cada experimento tiene un control incorporado que corrige la variabilidad entre embriones.

1. Ensamble el aparato de inyección como se muestra en la Figura 1B. Primero, monte una aguja en la jeringa y luego extienda la aguja de la jeringa con un trozo de tubo de 3 a 5 cm de largo.
2. Rompa la punta de la aguja de borosilicato con las pinzas finas (~20-60 μL de ancho).
3. Cargue la jeringa con la suspensión de células cancerosas (50–200 μL) e inserte la aguja de borosilicato en el tubo (Figura 1B).
4. Inspeccione la aguja de borosilicato en busca de obstrucciones celulares y burbujas de aire. Es fundamental inyectar las células como una sola célula en suspensión para garantizar que cada colonia metastásica sea iniciada por una sola célula><. nota: Las células cancerosas tienden a agregarse en PBS dentro de 1-2 h después de la tripsinización y, por lo tanto, deben prepararse inmediatamente antes de la inyección. Si es necesario, las células se pueden resuspender periódicamente con la jeringa de 1 ml utilizada para las inyecciones (sin la aguja de borosilicato).
5. Si se observa una obstrucción celular dentro del capilar, retire el capilar, vuelva a suspender las células y reemplácelo con un nuevo capilar. Use el émbolo para expulsar las burbujas. Si no se observan obstrucciones celulares ni burbujas, continúe con el siguiente paso.
6. Retire la tapa de la cubierta y transfiera el embrión debajo del estereoscopio. Identifique la vena apropiada que se inyectará en la superficie de la CAM. Las venas y arterias forman una intrincada red dentro del tejido CAM (Figura 1C). Las venas se distinguen por el color rojo más brillante porque transportan sangre rica en oxígeno al embrión.
   nota: Para la manipulación general de embriones, la inyección de células cancerosas y la escisión de colonias metastásicas, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente equipado con objetivos de 0,8x y 1,5x y oculares de 10x para la visualización. Los microscopios menos avanzados también se pueden utilizar con éxito para estos procedimientos, dependiendo del nivel de experiencia de los usuarios. Los lectores pueden ponerse en contacto con los autores para obtener recomendaciones más detalladas.
7. Encontrar la vena ideal para inyectar células que normalmente es solo un poco más ancha (10-20%) que el diámetro de la punta de la aguja de borosilicato y ubicada a medio camino entre el embrión y la pared del plato de pesaje. Por lo general, es más fácil inyectar en el punto inmediatamente adyacente a la bifurcación de la vena.
   nota: La inyección en una vena más grande puede parecer más fácil, pero provocará un sangrado excesivo y una disminución de la supervivencia del embrión.
8. Presione la punta de la aguja contra la pared del vaso sanguíneo y aplique una presión suave en la misma dirección que el flujo sanguíneo. Si es necesario, use un hisopo de algodón (sostenido en la otra mano) para ayudar a anclar o estabilizar el recipiente que se está inyectando.
9. Presione suavemente el émbolo de la jeringa. Uno puede visualizar una inyección exitosa al observar una "limpieza" del vaso sanguíneo cuando la suspensión de células cancerosas ingresa al torrente sanguíneo.
10. Continúe presionando el émbolo de la jeringa durante 2-10 s hasta que el volumen de suspensión deseado se inyecte en el torrente sanguíneo de la vena. En total, la inyección de un solo embrión puede requerir de 1 a 10 minutos, dependiendo del nivel de experiencia del usuario. Si aparece un sangrado excesivo o una acumulación de líquido claro en el lugar de la inyección, deseche el embrión><. nota: Es fácil "inyectar en exceso" un embrión. La consideración general que debe tenerse en cuenta es que las colonias metastásicas no deben tocarse entre sí después de un período de crecimiento de 4 a 5 días. Idealmente, ~5-10% de los capilares de las venas terminales de CAM deberían tener células inmovilizadas en ellos después de una inyección exitosa (Figura 1D, E). Como se mencionó en la sección 1, se puede utilizar un rango de concentración celular (0,5 x 10⁶ – 1,0 x 10⁶ células/mL). Las concentraciones más bajas requerirán un tiempo de inyección más largo, pero disminuirán la obstrucción de la aguja. Las concentraciones más altas requerirán tiempos de inyección más cortos, pero aumentarán la obstrucción de la aguja. Se recomienda probar varias concentraciones para encontrar la que sea más cómoda para un operador. Generalmente, se prefiere una concentración más alta (1,0 x 10⁶ células/mL) para disminuir el tiempo de inyección.
11. Retire la aguja de la MCA y frote suavemente el lugar de la inyección con un hisopo de algodón para eliminar la sangre o el exceso de células cancerosas.
12. Cubra el embrión en el plato de pesaje con una tapa y devuelva el embrión de pollo inyectado a la incubadora.
13. Repita el procedimiento con el siguiente embrión hasta que se inyecten todos los embriones.

Figura 1: Esquema de la inyección de células cancerosas y el aislamiento de colonias metastásicas.(A) Diagrama de flujo que describe los pasos de la plataforma de detección de embriones de pollo. (B) Inyección de células cancerosas en la platina del microscopio fluorescente estereoscópico. (C) Inyección de las células cancerosas en la vasculatura CAM. (D) Imagen que muestra una inyección exitosa de células cancerosas (densidad aceptable de células cancerosas), tomada inmediatamente después de la inyección. (E) Imagen que muestra una mala inyección de células cancerosas, vista como un embrión sobreinyectado. Observe la acumulación de células cancerosas en los capilares sanguíneos (flechas blancas). Barras de escala = 1 cm.