Ensayo de ramificación de glucógeno para medir el grado de ramificación de glucógeno

1. Evaluación cualitativa de la ramificación del glucógeno

1. Prepare la solución saturada de cloruro de calcio agregando 74,5 g de cloruro de calcio anhidro a ~ 40 mL de agua y revolviendo. Agregue un poco más de agua y continúe revolviendo. Aumente el volumen hasta 100 ml con agua y continúe revolviendo hasta que el CaCl₂ se disuelva por completo.
2. Prepare un caldo de trabajo de reactivo de color yodo/CaCl₂ mezclando 50 μL de solución madre de KI/yodo con 13 mL de solución saturada de CaCl₂ en un tubo de 15 mL. Mezclar bien y conservar a 4 °C, protegido de la luz. La solución es estable durante al menos 1 semana en estas condiciones.
3. Determinación de la ramificación
   1. En un tubo de 1,5 mL, combine 650 μL de stock de reactivo de color yodo/CaCl₂ con 100 μL de agua y mezcle bien. Transfiera la solución a una cubeta de metacrilato desechable.
      nota: La solución en la cubeta debe ser clara y de color amarillo pálido.
   2. Colóquelo en el espectrofotómetro y, funcionando en un modo de escaneo de longitud de onda, recoja un espectro de fondo de 330 nm a 800 nm.
   3. En un tubo de 1,5 mL, combine 650 μL de reactivo de color de yodo/CaCl₂ con 50 μg de glucógeno de ostra. Lleve el volumen final a 750 μL con agua y mezcle bien. Transfiera la solución a una cubeta de metacrilato desechable.
      nota: La solución en la cubeta debe ser clara y de un color naranja/marrón intenso.
4. Coloque en el espectrofotómetro y recoja un espectro de absorción de 330 nm a 800 nm.
5. Repita los pasos 1.3.3 a 1.4 con 50 μg de amilopectina y 30 μg de amilosa.
   nota: La muestra de amilopectina debe ser amarilla/verde y la muestra de amilosa debe ser verde/azul. Ambas muestras deben ser claras. Los complejos coloreados formados son estables, sin cambios en el espectro de absorción, durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
6. Para obtener una indicación de la estructura ramificada de una muestra de glucógeno no caracterizada, combine de 25 μg a 50 μg de glucógeno con 650 μL de reactivo de color de yodo/CaCl₂ de trabajo. Proceda como se indicó anteriormente, llevando el volumen a 750 μL con agua, mezclando bien y transfiriendo a una cubeta de metacrilato.
   nota: La muestra de glucógeno debe producir un color amarillo/naranja a naranja/marrón dependiendo del grado de ramificación (longitud de las cadenas externas) del glucógeno presente. De nuevo, la muestra debe ser clara.
7. Recoge el espectro de absorción.