Aislamiento de la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Disociación mecánica del tejido

NOTA: Mantenga las células y los reactivos fríos todo el tiempo, excepto durante los pasos de tinción. Este paso debería tomar ~ 30 min.

1. Pica cada tejido cerebral con una cuchilla de afeitar en <1 mm³ trozos finos.
2. Utilice una pipeta de 1 mL (con las puntas cortadas) para transferir los trozos de tejido a los homogeneizadores Dounce preenfriados, cada uno de los cuales contiene 2 mL de medio A con DNasa e inhibidor de RNasa.
3. Homogeneice el tejido girando lentamente el pistón hacia adentro y hacia afuera del homogeneizador Dounce durante 6-10 carreras completas hasta que no queden trozos visibles.
   nota: La duplicación mata las neuronas y la mayoría de las otras células gliales, pero deja las células microgliales bastante intactas. Tanto la insuficiencia como el exceso de orina pueden conducir a un bajo rendimiento de células.
4. Transfiera los tejidos disociados a tubos de 50 ml a través de filtros de 70 μm.
5. Enjuague cada homogeneizador y pistón Dounce con un total de 6 mL de medio frío A y filtre la solución de enjuague a través del mismo colador en el tubo correspondiente.
6. Transfiera las suspensiones de una sola celda (aproximadamente 8 mL cada una) a tubos cónicos de 15 mL y centrifugue a 400 x g durante 5 min a 4 °C con freno = 5.

>2. Eliminación de mielina

>NOTA: Este paso debería tomar ~60 min.

1. Prepare 1 columna de depleción grande (LD) (para la corteza) y 3 columnas de selección grande (LS) (para las otras 3 regiones) en un separador magnético (Tabla de materiales). Enjuague cada columna con 3 mL de tampón MCS.
2. Una vez finalizada la centrifugación, pipetear y desechar el sobrenadante sin alterar el pellet. Para los tejidos de la corteza y el cerebelo, resuspenda las células en 850 μL de tampón MCS con 1,8 μL de inhibidor de RNasa. Para los tejidos del hipocampo y del cuerpo estriado, resuspender las células en 400 μL de tampón MCS con 0,9 μL de inhibidor de la RNasa.
   nota: Las columnas (LD vs. LS) y el volumen utilizado para la resuspensión se optimizan en función de la cantidad de mielina presente en el tejido. Si se analizan otras regiones del cerebro, es posible que sea necesario ajustar estas condiciones según el tamaño del tejido y la cantidad de mielina que pueda existir. La eficacia de la eliminación de mielina se puede estimar en el paso 2.9.
3. Agregue 100 μL de perlas de eliminación de mielina en cada una de las células de la corteza y el cerebelo y agregue 50 μL de perlas de eliminación de mielina en cada una de las células del hipocampo y el cuerpo estriado.
4. Mezcle suavemente las células con perlas e incube los tubos en hielo durante 10 minutos.
5. Lleve el volumen del tubo con células corticales a 2 mL con tampón MCS y todos los demás a 1 mL (es decir, agregue 1 mL para las células corticales; 500 μL para las células del hipocampo y estriatales; no es necesario agregar tampón a las células cerebelosas).
6. Una vez que las columnas estén vacías de tampón de enjuague, coloque un tubo de 15 ml debajo de cada columna. Cargue las células corticales (2 mL) en la columna LD y todas las demás (1 mL cada una) en las columnas LS. Utilice inmediatamente 1 mL de tampón MCS para lavar los tubos originales y cargue la solución en las columnas correspondientes.
7. Lave la columna LD una vez con 1 mL de tampón MCS y lave cada columna LS dos veces con 1 mL de tampón MCS en cada lavado. Continúe recogiendo la solución de flujo continuo durante el lavado.