Generación de explante de ganglios de raíz dorsal y cultivo celular disociado

>1. Explante el cultivo de DRG de un ratón adulto

1. Coloque el DRG recolectado en una placa de Petri de 35 mm que contenga 3 mL de medio sin suero helado (SFM).
2. Transfiera cada DRG individual en una placa de Petri de vidrio seco y, bajo un microscopio quirúrgico, limpie y recorte el exceso de fibras y tejido conectivo aún adherido al DRG con una cuchilla. El DRG es fácilmente identificable como una estructura abultada y transparente a lo largo del nervio/raíz espinal blanco. A menudo se encuentran vasos sanguíneos alrededor del DRG.
3. Coloque el DRG limpio en una nueva placa de Petri que contenga medios SFM helados.
4. Diluya la mezcla de proteínas gelatinosas (consulte la Tabla de materiales) en SFM helado (1:1).
5. Coloque el DRG ex vivo en placas de 12 pocillos prerrecubiertas con 10/20 μL de mezcla de proteínas gelatinosas y colóquelas dentro de la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 30-60 min.
6. Agregue suavemente 1,5-2 mL de SFM al sistema de cultivo para cubrir todo el explante y mantener los explantes en condiciones de cultivo (37 °C y 5% de CO2).
   nota: Este es un paso crítico porque el DRG está anclado a los platos de vidrio solo por la mezcla de proteínas gelatinosas polimerizadas. El tiempo de polimerización y las habilidades de pipeteo son fundamentales para evitar la flotación.
7. Cambie el medio de crecimiento de DRG cada 72 horas y deje que el DRG crezca durante el tiempo que sea necesario.

>2. Aislamiento de neuronas unicelulares de DRG

1. Colocar todo el GRD recogido en un tubo estéril de 1,5 mL con 1,2 mL de medio F12 que contenga 1,25 mg/mL de colagenasa IV e incubarlo a 37 °C y 5% de CO2 durante 45 min. Repita este paso durante otros 45 min después de la primera incubación.
2. Tratar los explantes con 2 mL de medio F12 que contenga tripsina (0,025%) durante 30 min inmediatamente después del tratamiento con colagenasa IV a 37 °C y 5% de CO2.
3. Incubar con 2 mL de medio F12 que contenga suero fetal bovino (FBS; 33%) a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.
4. Lave los explantes tres veces con 2 mL de medio F12 y proceda a disociarlos mecánicamente con una pipeta de vidrio hasta que el medio se vuelva turbio.
   nota: Este procedimiento consiste en la recolección de GRD limpios/recortados del animal, como se explicó en la sección anterior. Al realizar la disociación mecánica de los explantes, sea cuidadoso y no utilice una fuerza excesiva, ya que puede provocar derrames y pérdida de material de trabajo.
5. Filtre el cultivo celular disociado a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las impurezas y el exceso de tejido conectivo. Centrifugar el lisado celular filtrado a una temperatura de 2.500 x g durante 2 min.
6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 500 μL de medio neurobasal que contiene suplemento para cultivo neuronal (1x), mezcla de antibióticos (1x), L-glutamato (0,5 mM) y factor de crecimiento nervioso (5 μg/mL) (ver Tabla de Materiales).
7. Coloque las células disociadas en portaobjetos de cubierta recubiertos de laminina (50 μg/mL; consulte la tabla de materiales) a una densidad de células preferida. Determine la densidad de celdas usando un contador de celdas.
   nota: Enchapamos las células a 25.000 células/portaobjetos de cubierta. Esta técnica permite la disociación tanto de las neuronas como de las células satélite gliales. El componente glial co-cultivado con las neuronas pseudounipolares juega un papel crítico en la supervivencia neuronal.