Registro in vitro de oscilaciones theta en el hipocampo del ratón

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.                                                                                      

>1. Preparación In Vitro del Hipocampo Agudo

NOTA: Aislar la preparación del hipocampo intacto implica tres pasos principales: (1) Preparación de soluciones y equipos, (2) Disección del hipocampo y (3) Configuración del sistema de tasa de perfusión rápida necesario para la generación de oscilaciones theta intrínsecas. En este protocolo, la realización oportuna de los procedimientos, desde la disección hasta el registro, es particularmente importante porque el hipocampo aislado constituye una preparación tan densa pero delicada que mantener la conectividad funcional de la estructura in vitro requiere un gran cuidado. Preparar todo de antemano asegura que se disponga de un nivel adecuado de perfusión lo antes posible para minimizar el daño celular y mantener la función fisiológica.

1. Solución artificial de líquido cefalorraquídeo (aCSF) a base de sacarosa
   1. Prepare 1X solución de sacarosa madre para ser utilizada para la disección y la incubación posterior a la disección. Combine todos los componentes enumerados en la Tabla 1, excepto el CaCl₂, en 1 L de agua desionizada y almacene a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
2. Solución estándar aCSF
   1. Prepare aCSF estándar para la perfusión de alta tasa de flujo del hipocampo aislado durante los registros electrofisiológicos. Para hacer el caldo concentrado (5X) aCSF, disuelva todos los componentes enumerados en la tabla 2, excepto el CaCl₂, en 2 L de agua desionizada y almacene a 4 °C.
3. Preparar el equipo
   1. Antes de comenzar la disección, prepare el área del banco con una bandeja de plástico llena de hielo (30 x 20 x 5 cm), tuberías conectadas por carbogen y tres placas de Petri de vidrio (10 x 2 cm) (consulte la Figura 1).
   2. Añadir 300 mL de solución de sacarosa (1X stock) a un vaso de precipitados de 500 mL, burbujearlo con carbógeno (95% O₂, 5% CO₂) y añadir Ca₂+ [1,2 mM].
   3. Transfiera 60 mL de esta solución de sacarosa a una placa de Petri de vidrio y déjela a temperatura ambiente. Coloque el resto en un congelador a 4 °C durante 10 - 15 min.
   4. Burbujea la solución de sacarosa helada con carbógeno durante toda la disección.
   5. Llene una segunda placa de Petri (cámara de retención en frío) con solución de sacarosa (4 °C) y manténgala en hielo.
   6. Agregue 30 ml de solución de sacarosa helada a un vaso de precipitados de 50 ml.

>2. Disección completa del hipocampo

NOTA: El método para diseccionar el hipocampo aislado es esencialmente idéntico al desarrollado y descrito originalmente, pero con detalles adicionales y cambios en cuanto a la tasa de perfusión y las técnicas de registro.

1. Disección del cerebro
   1. Anestesiar al ratón bajo una campana extractora con una pequeña toalla de papel empapada con 1 mL de isoflurano (100%) que se agrega a la jaula.
   2. Decapitar al ratón anestesiado y sumergir rápidamente la cabeza en una solución de sacarosa helada (vaso de precipitados de 50 ml, ~ 5 s). Transfiera a una toalla de papel.
   3. Use un bisturí para hacer una incisión medial en la piel (caudal a rostral) y empuje la piel hacia los lados para exponer el cráneo.
   4. Corta el cráneo con unas tijeras pequeñas y usa una espátula para extraer rápidamente el cerebro y dejarlo caer en la placa de Petri que contiene una solución de sacarosa helada. Espere de 1 a 2 minutos para que el cerebro se enfríe.
   5. Mientras el cerebro se recupera, agregue de 2 a 3 ml de solución de sacarosa en un plato de Petri (disección) cubierto de papel sobre hielo.
2. Aislar el hipocampo
   1. Coloque el cerebro en la placa de disección en posición vertical.
   2. Extirpa el cerebelo y la corteza frontal con una cuchilla de afeitar. Corta el cerebro por la mitad a lo largo del plano sagital medio y devuelve los dos hemisferios aislados a la cámara de retención. Espere de 1 a 2 minutos más para la recuperación.
   3. Coloque un solo cerebro hemiseccionado en posición vertical sobre la placa de disección.
   4. Gire la placa hasta que las estructuras sagitales medias miren hacia el observador y el contorno incrustado del complejo septal sea visible como una capa delgada de tejido en forma de pera anterior al tálamo.
   5. Sostenga firmemente el cerebro hemiseccionado con la microespátula y coloque el extremo pequeño de la espátula recubierta de politetrafluoroetileno (PTFE) inmediatamente detrás (caudal a) el área septal.
   6. Inserte la espátula recubierta debajo del tabique y mueva la punta hacia abajo hasta llegar a la placa de disección. Corta caudalmente las fibras que conectan el área septal. Repita la misma operación a lo largo del borde anterior del tabique y corte las fibras que se conectan con la parte frontal del cerebro.
   7. Con la espátula sosteniendo ligeramente la parte interna de la corteza justo por encima del hipocampo en posición vertical, use la microespátula para tirar con cuidado hacia abajo de los núcleos talámico, hipotalámico y del tronco encefálico restante. Luego, use la espátula para cortar y quitar el pañuelo arrancado.
   8. Gira el hemisferio aislado de lado e identifica el contorno del hipocampo.
   9. Inserte la espátula recubierta en el ventrículo lateral debajo del extremo rostral del hipocampo dorsal.
   10. Sostenga la espátula alineada horizontalmente con el plano sagital medio del cerebro hemiseccionado y deslícela a través del contorno liso de las paredes ventriculares hasta que la punta emerja caudalmente.
   11. Sostenga la espátula debajo del hipocampo y presiónela ligeramente sobre las fibras conectadas a lo largo de la capa interna donde el hipocampo se une con la corteza suprayacente. Aplique la microespátula en el lado externo de esta capa y deslícela contra la espátula recubierta para cortar las fibras conectadas.
   12. Para completar la extracción, gire la placa de disección e inserte la espátula recubierta debajo del hipocampo ventral. Sujete ligeramente el interior del pliegue cortical con la espátula y corte las conexiones entorrinales con un movimiento de corte contra la microespátula.
       nota: Todo el complejo septohipocampal se puede eliminar colocando la espátula recubierta debajo de todo el hipocampo y sacando el tejido cerebral restante debajo.
   13. Una vez que se complete el aislamiento, mantenga el hipocampo descansando en el plato y agregue una gota de solución de sacarosa helada para mantenerlo fresco. Recorte con cuidado cualquier corteza y fibras restantes y separe el hipocampo del tabique aplicando suavemente una hoja de afeitar a través del fórnix><. nota: Si se van a realizar registros de pinza de parche a partir de células piramidales, el hipocampo aislado se puede cortar transversalmente en un ángulo de 45° para exponer la capa piramidal de Cornu Ammonis (CA)1 (preparación de "corte en ángulo") sin comprometer los circuitos de la red local en la porción restante del hipocampo.
   14. Transfiera la preparación a una solución de sacarosa a temperatura ambiente y deje que se recupere durante 15 a 30 minutos antes de transferirla a la cámara de registro.

>3. Configure la perfusión rápida para grabar el hipocampo aislado

1. Configure el sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir la entrada continua de aCSF oxigenado a alta velocidad a 20 - 25 mL/min.
   1. Prepare con antelación un matraz de CSF (1X) y sumérjalos en un baño caliente (~30 °C) al menos 15 minutos antes del inicio del experimento. Encienda el sistema de calentamiento de solución en línea (30 °C).
   2. Use burbujeadores de acuario y líneas de tubos conectados a un tanque de carbógeno para oxigenar aCSF durante todo el experimento, y agregue CaCl₂ [2 mM] antes del inicio de la perfusión.
   3. Detenga el flujo de líquido cefalorraquídeo y transfiera el hipocampo a la cámara de registro utilizando el extremo ancho de una pipeta de vidrio. Deje que la preparación saturada de sacarosa se hunda y se asiente en el fondo.
   4. Coloque la preparación en el centro de la cámara de registro (en línea con el eje de entrada-salida) con la superficie lisa de CA1 y SUB en la parte superior.
   5. Estabilice el hipocampo con pesas pequeñas en las extremidades septales y temporales y reinicie el flujo de líquido cefalorraquídeo.

>4. Electrofisiología en el hipocampo aislado

1. Registro extracelular de oscilaciones theta del hipocampo in vitro
   1. Para la monitorización extracelular del potencial de campo local (LFP) o de la actividad de una sola unidad del hipocampo aislado in vitro, utilice micropipetas de vidrio (1 - 3 MΩ) rellenas de aCSF. Registre señales de potencial de campo acopladas a CA de bajo ruido con un amplificador de pinza de parche de ganancia x1000, filtrado de paso de banda en línea de 0,1 a 500 Hz y una frecuencia de muestreo de 5 a 20 kHz><. nota: El microscopio personalizado utilizado en este protocolo está equipado con objetivos de baja (2,5X) y alta ampliación (40X) para una vista de baja ampliación del hipocampo, así como microscopía de vídeo infrarroja y epifluorescencia para el reconocimiento de una sola célula. Los componentes de este sistema incluyen el microscopio de fluorescencia vertical, cubos de filtro de fluorescencia, una cámara de video analógica y un capturador de fotogramas digital con software de imágenes, una cámara de perfusión personalizada en el escenario (Figura 2A, recuadro i) y micromanipuladores de alta precisión para grabaciones neuronales y colocación de fibra óptica.
   2. Utilice la cámara montada en el microscopio y conectada a la pantalla de un ordenador para inspeccionar la preparación del hipocampo con un aumento bajo (2,5X) y comprobar rápidamente que no haya socavaciones ni daños en la superficie externa. La disposición diagonal de las fibras alveas a lo largo de la superficie lisa de CA1 debe ser visible (Figura 2A, recuadro ii) cuando se transmite luz a través del hipocampo.
   3. Utilice el objetivo de campo amplio de baja ampliación para ver el hipocampo aislado y la ubicación de los electrodos LFP en ubicaciones de grabación específicas.
      nota: En la Figura 2A se ilustra un diseño de la preparación aislada del hipocampo con múltiples electrodos colocados en diferentes lugares de registro.
   4. Baje un electrodo LFP en el baño hasta que toque la superficie (alveo) del área CA1.
      nota: Esto generalmente produce un transitorio rápido en la grabación acoplada a CA, similar a lo que sucede cuando el electrodo entra en contacto con el medio de grabación. Un monitor de audio puede ser útil para escuchar la señal del canal LFP después de este paso.
      nota: A menudo, los primeros signos de actividad solo aparecerán después de 10 a 15 minutos, por lo que es importante no avanzar rápidamente en la preparación. Si después de este período, el electrodo LFP de superficie todavía no está recogiendo actividad, avance un poco más hacia abajo a través del estrato oriens y haga una pausa periódicamente para ver si surge algún tipo de actividad mientras se acerca a la capa celular principal. Si no se detecta nada después de 5 a 10 minutos más, retraiga con cuidado el electrodo y colóquelo en otro lugar a lo largo de la misma región.
   5. Avance el electrodo LFP a través de la capa piramidal. Obsérvese que la actividad de espiga extracelular aumenta inicialmente a medida que se detecta la descarga de una sola unidad de las neuronas individuales (en su mayoría células piramidales e inhibidoras en cesta). Baje el electrodo aún más y observe que la punta comienza a desvanecerse nuevamente a medida que la punta cruza hacia el radio. Observe que una oscilación de red claramente visible en el rango de frecuencia theta (4 - 12 Hz) se hace evidente y alcanza la amplitud máxima (~100 - 300 μV) a medida que la ubicación de grabación se baja a través del radiato.
2. Oscilaciones theta a través de una sola región
   1. Para probar las propiedades espaciales de las oscilaciones theta espontáneas a través de la región CA1, coloque la punta de un electrodo LFP de referencia en un sitio CA1 medial (ubicado medialmente a lo largo del eje septo-temporal longitudinal) y bájelo en el radiato como se describió anteriormente.
   2. Coloque un segundo electrodo LFP en un sitio CA1 (200 - 800 μm septal o temporal desde el primer LFP) y observe que las oscilaciones theta de CA1 pueden sincronizarse a distancias relativamente grandes.
3. Oscilaciones theta a través de capas
   1. Para probar las propiedades de las oscilaciones theta a través de las capas del hipocampo, deje un electrodo LFP de referencia en un sitio de radiato CA1. Comenzando justo por encima del estrato oriens, baje un segundo electrodo en la capa de la celda piramidal y a través del radio. Observe una inversión gradual de la señal LFP (inversión de fase relativa) a través de la capa piramidal.
      nota: Para ver ejemplos representativos de estos tipos de actividad, consulte la Figura 2B. Anteriormente se han publicado ejemplos de perfiles laminares/de profundidad y análisis de densidad de fuente de corriente (CSD) que ilustran el sitio de inversión de fase en hipocampos aislados.

Tabla 1.

Tabla 2.

Figura 1: Procedimiento de disección para la preparación del hipocampo intacto aislado.

(a) Vista general de la configuración de la disección. Arriba a la derecha: matraz de solución de sacarosa helada carbugenada (1); abajo a la izquierda: bandeja de plástico llena de hielo (2) que sostiene el plato de disección cubierto con papel para lentes (3); la cámara de conservación en frío que contiene una solución de sacarosa (4); y un conjunto de instrumentos quirúrgicos (5). (b) Vista del cerebro del ratón antes de la hemisección en la placa de disección. (c) Recuperación del cerebro hemiseccionado en la cámara de retención fría y vista ampliada (recuadro) del hemisferio encefálico izquierdo antes de insertar el extremo pequeño de la espátula recubierta debajo del tabique. (d) Se extrae de abajo una espátula recubierta colocada debajo del hipocampo aislado, a lo largo de la región CA1/SUB, con el tejido cerebral restante.

Figura 2: Configuración de la configuración para el registro in vitro de oscilaciones Theta de la preparación del hipocampo intacto en la cámara de grabación sumergida.

(a) El hipocampo aislado se muestra con un diseño de regiones hipocampales y múltiples electrodos colocados en cuatro sitios de registro diferentes distribuidos septotemporalmente (indicados con asteriscos blancos). En la vista de la plataforma de la cámara de registro que se muestra arriba (recuadro i), la entrada y la salida para el flujo de perfusión rápida se indican mediante números (1, 2). En la imagen ampliada del hipocampo que se muestra a continuación (recuadro ii), se coloca un solo electrodo en el CA1 del medio sepetotemporal, y las fibras del alvéo, que corren en diagonal hacia el subículo. S: septal, T: temporal, f/fx: fimbria-fórnix. b) Representación esquemática de la organización de las capas CA1 con trazas representativas de LFP registradas simultáneamente a partir del estrato oriens (gris) y del estrato radiatum (negro). Obsérvese la fase invertida de las señales entre las dos capas. Alv: estrato alveo, PR: estrato piramidal, SR: estrato radial. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. c) Ejemplo de traza LFP que muestra la oscilación theta espontánea registrada desde la zona CA1/SUB (segmento de 20 segundos) y segmentos expandidos de 2 segundos (abajo) desde la señal sin filtrar; paso de banda filtrado para frecuencias theta (0,5 - 12 Hz); gamma lenta (25 - 55 Hz); y gamma rápida (125 - 250 Hz).