Estudio del efecto de los plaguicidas en las neuronas de Caenorhabditis elegans

1. Preparación de placas de Petri recubiertas de pesticidas

1. Prepare placas de Petri de agar (6 cm de diámetro funcionan mejor) utilizando procedimientos estándar.
   nota: Estos se pueden preparar con meses de anticipación y almacenar en el refrigerador hasta su uso. Lleve las placas a temperatura ambiente (RT) en la mesa de trabajo. En la mayoría de los casos, se debe proporcionar a los grupos de estudiantes un plato para cada dilución de la mezcla de plaguicidas, incluyendo un control de agua.
2. Prepare 1 mL de cada dilución del pesticida elegido en tubos de microfuge de 1.5 mL etiquetados. Para un manejo seguro, asegúrese de leer las instrucciones y proporcionar guantes o trabajar con una campana extractora, si se sugiere.
   nota: Diluciones sugeridas para probar: 1 mL de plaguicida sin diluir completa, dilución 1:10 en agua (100 μL de pesticida, 900 μL de agua destilada), dilución 1:100 (10 μL de pesticida, 990 μL de agua), dilución 1:1000 (10 μL de la dilución 1:10, 990 μL de agua), etc.
3. Haga un esparcidor de solución doblando con cuidado una pipeta Pasteur de vidrio (tamaño de 9 ml) en una llama de mechero Bunsen. Utilice la llama para cerrar la abertura de la pipeta. A continuación, esterilizar con etanol el esparcidor antes de cada esparcimiento en la placa de Petri.
4. Con una micropipeta, coloque 100 μL de la dilución (o control de agua) en el centro del agar y extiéndalo suavemente por la superficie con el esparcidor esterilizado. Vuelva a esterilizar el esparcidor antes de cada uso.
5. Deje a un lado las placas de Petri cubiertas y deje que la solución penetre en la superficie hasta que se "seque".
   nota: Dependiendo del pesticida y los niveles de humedad en el laboratorio, esto puede llevar algún tiempo. Es posible que los estudiantes deban preparar sus platos el día antes del período de exposición.
6. Para períodos de exposición superiores a 12 h, añada 50 μL de un cultivo nocturno de Escherichia coli a las placas antes de añadir los nematodos. Para experimentos agudos (12 h o menos), no es necesario tener E. coli en las placas.

>2. Adición de nematodos a placas recubiertas de pesticidas

NOTA: Los estudiantes necesitarán tener una placa de nematodos adultos (los cultivos de 5 días son los mejores) de la cepa fluorescente LX929, que está disponible en el Centro de Genética de Caenorhabditis elegans. Hay dos procedimientos posibles para esto. Si los estudiantes han tenido experiencia previa trabajando con nematodos (por ejemplo, si este procedimiento es parte de un ejercicio de varias semanas y ya han aprendido a recoger nematodos con un palillo de gusano), use el Paso 2.1. Si no lo han hecho, utilice el paso 2.2.

1. Recoge los nematodos con un palillo de gusano. Fabrica un pico de gusano a partir de un trozo de alambre de platino de 1 pulgada que se funde en una pipeta Pasteur con una llama de mechero Bunsen. Recoja una pequeña gota de E. coli pegajosa en la púa y luego recoja los nematodos adultos usando la mancha pegajosa. Para obtener un tamaño de muestra decente, elija 10 nematodos para cada placa de tratamiento.
   nota: Los estudiantes sin mucha experiencia pueden seguir los pasos 2.2-2.3.
2. Utilice una micropipeta para colocar 1 ml de agua estéril en la placa de nematodos. Agita el agua para levantar los nematodos, luego retira el líquido con los nematodos y colócalo en un tubo de microfuga de 1,5 ml.
3. Deje que los nematodos se asienten por gravedad durante unos 10 minutos, luego retire con cuidado al menos 500 μL del agua y deséchelos. Vuelva a suspender los nematodos y, con una punta de pipeta amarilla recortada, retire 50-100 μL de gusanos en suspensión en cada placa de tratamiento. Asegúrese de que cada plato tenga al menos 10 gusanos adultos.
4. Configure un temporizador, o anote la hora, y exponga los nematodos en RT durante el período de tiempo elegido. Durante el tiempo de exposición elegido, prepare los portaobjetos del microscopio para monturas húmedas. Los portaobjetos deben realizarse el mismo día que la microscopía.
   nota: Los grupos de estudiantes habrán elegido su tiempo de exposición durante la planificación de su estudio independiente.

>3. Preparación de portaobjetos de microscopio para montajes húmedos

NOTA: Los pasos 3.1-3.3 pueden ser realizados por cada grupo de estudiantes. Prepare tres diapositivas cada uno.

1. Prepare dos portaobjetos colocando un trozo de cinta adhesiva en un solo lado del portaobjetos. La cinta se utiliza para crear el grosor correcto para que la agarosa forme una almohadilla de grosor uniforme. A continuación, coloque una corredera limpia y sin usar entre ellos en la mesa de trabajo, como se ilustra en la figura.
2. Utilice una micropipeta para colocar una gota de 10 μL de agarosa derretida (3% en agua bidestilada (ddH₂O), calentada con un calentador de bloque seco a 65 °C) en el centro del portaobjetos que se encuentra en el centro.
3. Aplana la gota colocando otra corredera limpia en la parte superior, perpendicular a la corredera con la gota, como se muestra en la figura. Aplana aplicando presión para que la gota de agarosa forme el grosor de la cinta de etiquetado.
4. La agarosa se solidificará en aproximadamente 1 minuto. Luego, aplique una presión constante para separar los dos portaobjetos. El círculo de agar se adherirá a uno de los portaobjetos. Apoye este portaobjetos, con el agar hacia arriba, sobre la mesa de trabajo y déjelo secar durante 1-2 minutos antes de usarlo.

>4. Montaje de nematodos vivos en portaobjetos de microscopio

1. Para agregar nematodos al portaobjetos preparado con la almohadilla de agarosa, agregue una gota de 5 μL de agua que contenga 1 M de azida sódica (NaN₃) a la almohadilla de agar. Esta solución anestesia a los gusanos y los inmoviliza.
   cautela: La solución madre de azida de sodio puede causar enfermedades si se ingiere.
2. A continuación, transfiera los nematodos (al menos 10 por portaobjetos de tratamiento) a la gota con un palillo de gusano. Esterilice el palillo antes y después de usarlo para transferir nematodos.
3. Use pinzas para agregar un cubreobjetos colocándolo en ángulo y bajándolo lentamente. Evite que el cubreobjetos se deslice o baje demasiado rápido utilizando un lápiz o una sonda de metal.
4. Coloque la montura húmeda preparada en un microscopio fluorescente para observar los gusanos, primero con un aumento de 10x y contraste de fase, luego con un aumento de 40x con contraste de fase e iluminación fluorescente.

>5. Microscopía fluorescente

NOTA: Los grupos de estudiantes deben hacer un montaje húmedo de varios gusanos de cada tipo en portaobjetos de microscopio separados, que deben etiquetar apropiadamente. Las instrucciones que siguen son consejos generales sobre el uso de un microscopio compuesto de fluorescencia estándar que puede tener una configuración trinocular adjunta, una cámara digital y un sistema informático. Los estudiantes deben estar familiarizados con la configuración del microscopio, incluidos los objetivos, los tipos de filtros de luz, la capacidad de cambiar entre luz de campo claro y luz de fluorescencia, cómo enviar la señal de luz a la cámara digital, etc.

1. Coloque una montura húmeda preparada a la vez en la platina del microscopio y asegúrela en su lugar con los clips de la platina del microscopio.
2. Comience a ver las monturas húmedas visualizando primero con el objetivo de aumento más bajo, que suele ser de 10x, y utilice el campo claro o el contraste de fase para visualizar y enfocar los nematodos.
3. Una vez que un nematodo esté ubicado en el campo de visión, concéntrelo usando la perilla de enfoque fino en el microscopio. Cambie la iluminación a la fluorescencia girando el dial. A continuación, dirija la luz a la cámara para capturar las imágenes digitales. Ajuste la iluminación con el software de imágenes para que las neuronas estén brillantemente iluminadas pero no sobresaturadas.
4. En algún momento, obtenga una imagen separada de una regla con el mismo aumento que las imágenes de celda para proporcionar una escala de aumento para su figura. Coloque una sección corta de una regla transparente, o un portaobjetos de micrómetro, en la platina del microscopio, concéntrela con la perilla de enfoque fino y obtenga una imagen con el software de imágenes.
5. Obtenga imágenes adicionales (de al menos 10 nematodos separados) con aumentos más altos, si es posible. Es probable que la luz intensa blanquee el área desde la que se está tomando la imagen, así que monitoree cuidadosamente la imagen y no permita que la luz permanezca en la misma área del portaobjetos durante largos períodos de tiempo. Asegúrese de nombrar las imágenes adquiridas para realizar un seguimiento del nematodo y la región, así como del tratamiento y la ampliación.
6. Cree una carpeta en la computadora y mueva las imágenes a la carpeta para usarlas en el análisis y la preparación de figuras.

>6. Escala de evaluación de la integridad morfológica

>NOTA: Una característica citológica clave del daño neurodegenerativo en las neuronas es un cambio en la morfología del soma. Hay tres morfologías que se pueden ver y contar fácilmente.

1. Cuente las neuronas con procesos suaves y uniformemente fluorescentes y los cuerpos celulares no redondos como de costumbre, como se muestra en las Figuras 1 y 2.
2. A menudo, el soma se vuelve redondeado e hinchado en comparación con las neuronas jóvenes y sanas. Cuenta las neuronas que se ven así como "redondeadas".
3. Las neuronas con procesos neuronales largos pueden exhibir burbujas, donde hay puntos redondeados o incluso espacios en los procesos. Cuente las neuronas que muestran estas características como "ampolladas".

Figura 1: Evaluación de los efectos de un pesticida que contiene neonicotinoides sobre la morfología de las neuronas. (A) Neuronas colinérgicas no tratadas de la cepa fluorescente LX929. (B) Neuronas colinérgicas expuestas a pesticidas (T + S). (C) Porcentaje de neuronas que exhiben ampollas en las dos condiciones. Las barras de error son el error estándar de la media. indica p < 0,001 de un ANOVA de un factor. Se analizaron un total de 113 neuronas de 12 nematodos individuales. Esta cifra ha sido modificada de Bradford et al. (2020).

Figura 2: Efectos de un pesticida que contiene manganeso sobre la morfología de las neuronas dopaminérgicas. El grupo de estudiantes no proporcionó una barra de escala para su figura, sino que tomó la imagen con un aumento de 40x. (A) Soma neuronal putativo de CEPDL y CEPVL (marcado) en gusanos de control. El soma intacto de la neurona principal y sus procesos indican una falta de degeneración. (B) Procesos putativos CEPD L&R (asterisco) y soma neuronal CEPV L&R (marcado) en gusanos agudamente expuestos. El soma y los procesos expresaron GFP, pero parece haber una disminución de la expresión de GFP en los procesos dorsales. (C) Soma neuronal putativo de CEPDL y CEPVL (marcado) en gusanos expuestos crónicamente. El soma no expresaba GFP y los procesos no eran visibles, lo que indicaba una degeneración significativa.