Inducción de una lesión cerebral traumática penetrante en moscas Drosophila adultas

1. Traumatismo craneoencefálico penetrante (PTBI; Figura 1)

1. Ordena las moscas F1 recién cerradas. Seleccione los machos jóvenes dentro de las 6 horas posteriores a la eclosión. Coloque estos machos en viales limpios que contengan alimento, con 40 o menos moscas por vial.
   NOTA: Esto se logra más fácilmente a media mañana anestesiando moscas en la almohadilla de CO₂ e identificando a los machos adultos que todavía tienen meconio (visible como una mancha verdosa oscura a través de la pared abdominal) en sus intestinos.
2. Desinfecte los pines Minutien (consulte la Tabla de materiales) durante al menos 5 minutos colocando ~ 100 pines en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL lleno de etanol al 70%.
3. Desinfecte la almohadilla de_CO2 y un pincel rociando etanol al 70% y séquelo con un pañuelo de papel limpio y sin pelusa. Una vez que las herramientas estén limpias y secas, transfiera 40 o menos machos F1 clasificados de nuevo a la plataforma limpia.
4. Separe los machos F1 en 2 grupos en la almohadilla de mosca. Un grupo servirá como control, moscas ilesas. El segundo grupo experimental será sometido a PTBI.
5. Con pinzas, extraiga 4-5 clavijas Minutien nuevas del tubo de microcentrífuga y colóquelas cerca del borde de la almohadilla de CO₂. Debajo del visor de disección, elija un alfiler Minutien recto con una punta afilada.
   NOTA: El uso de un solo pin Minutien para un experimento reducirá la variabilidad. Reutiliza los alfileres afilados. Coloque los pasadores dañados o romos en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml que contenga 70% de etanol para su eliminación segura.
6. Si trabaja con moscas de la cruz estándar, encienda la lámpara de diodo emisor de luz (LED) del microscopio estereoscópico equipada con los filtros de excitación y emisión adecuados para la proteína de fluorescencia verde (GFP). Esto permite la excitación a 440-460 nM y permite la visualización de 500-560 nM.
   NOTA: Con este conjunto de lámpara y filtro, los cuerpos celulares del cuerpo del hongo emitirán fluorescencia verde a través de la cutícula de la cabeza (Figura 1C). En el caso de las moscas gemelas permanentes o de otros genotipos, se puede utilizar un iluminador de luz blanca estándar para el microscopio estereoscópico para visualizar puntos de referencia en la cutícula de la cabeza y dirigirse a la lesión en el cuerpo del hongo (Figura 1C).
7. Use las pinzas para levantar y sostener el alfiler Minutien seleccionado en una mano (para las personas diestras, generalmente es la mano derecha) y el pincel en la otra mano (generalmente la izquierda). Elija una mosca del grupo experimental y colóquela de manera que tenga una vista dorsal de la cápsula de la cabeza con la cabeza de la mosca a la derecha. Coloque el cepillo en la parte anterior del tórax dorsal y empuje suavemente hacia abajo para estabilizar la mosca.
8. Apunta la punta del alfiler Minutien a los cuerpos celulares del cuerpo del hongo en el lado derecho de la cabeza y penetra en la cápsula de la cabeza. Si utiliza puntos de referencia, diríjase a la cutícula dorsal de la cabeza entre los ocelos y el borde dorsal del ojo (Figura 1).
9. Después de completar la lesión, use el pincel para empujar suavemente la cabeza del alfiler Minutien.
10. Si usa el cerebro para RNA-Seq o qRT-PCR, haga una segunda lesión en el lado izquierdo de la cabeza.
11. Repita los pasos 2.8-2.10 para herir a todas las moscas del grupo experimental.
12. Una vez que todas las moscas hayan sido heridas, coloque las moscas de control y las moscas lesionadas en viales separados etiquetados que contengan comida. Coloque los viales horizontalmente (es decir, de lado) mientras las moscas se recuperan de la anestesia y durante el envejecimiento posterior para evitar que las moscas queden atrapadas en la comida.
13. Coloque las moscas cruzadas estándar a 25 °C y las moscas gemelas permanentes a 30 °C para envejecer.
14. Para moscas de más de 24 h, colóquelas sobre alimentos limpios cada 1-2 días.

Figura 1: Lesión Cerebral Traumática Penetrante (PTBI) en el cerebro central de Drosophila adulta. (A) Esquema del exterior de una cabeza de mosca adulta. Esta es una vista frontal. Por lo tanto, el lado derecho del animal está a la izquierda del espectador. (B) Esquema del interior de la cabeza de una Drosophila adulta con la trayectoria de la lesión indicada en gris. Esta es una vista posterior. Así, en esta imagen y en las figuras subsiguientes, el lado derecho del cerebro está a la derecha. El PTBI central del cerebro afecta a múltiples estructuras cerebrales, incluido el cuerpo del hongo (verde) y los tejidos fuera del cerebro, incluido el cuerpo graso (azul) y los hemocitos (rojo). CB = región central del cerebro. OL= región del lóbulo óptico. (C) Vista dorsal de una cabeza adulta viva en la que los cuerpos de los hongos (puntas de flecha) están marcados con una proteína verde fluorescente (GFP). Este es el "genotipo estándar" (ver texto para más detalles). El protocolo PTBI provoca lesiones reproducibles en los cuerpos de los hongos.