Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

34.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/50765

⸱

26 de septiembre de 2013

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Resumen

Células Th17 son un subconjunto distinto de las células T que se han encontrado para producir interleucina 17 (IL-17), y difieren en función de los otros subconjuntos de células T, incluyendo Th1, Th2, y células T reguladoras. Células Th17 han surgido como un culpable central en las respuestas inmunes inflamatorias exceso de celo asociados con muchos trastornos autoinmunes. En este método purificamos los linfocitos T del bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6, y estimular a las células T CD4 + purificadas bajo ambientes Th17 inductores de control y. El entorno de Th17-inducir incluye la estimulación en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, IL-6, y el TGF-β. Después de la incubación durante al menos 72 horas y hasta por cinco días a 37 ° C, las células se analizan posteriormente para la capacidad de producir IL-17 a través de la citometría de flujo, qPCR, y ELISA. Th17 diferenciado las células CD4 + CD25-T pueden ser utilizados para aclarar aún más el papel que juegan las células Th17 en el inicio y la progresión de la autoinmunidad y el anfitrión defensa. Por otra parte, Th17 diferenciación de CD4 + CD25 de los linfocitos de los modelos knockout / enfermedad murinos distintas puede contribuir a nuestra comprensión de la plasticidad del destino celular.

Introducción

Los linfocitos T CD4 + (células T) juegan un papel crítico en la defensa inmunitaria mediada por sistema contra microorganismos infecciosos. Por el contrario, las células T también están íntimamente asociados con la aparición y progresión de las enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, y artritis reumatoide. Linfocitos T CD4 + se activan a través de una combinación de receptor de células T (TCR) interacciones con el antígeno cognado / complejo mayor de histocompatibilidad II (CMHII) moléculas, y las interacciones de los receptores CD28 con B7.1/B7.2 ligandos 15. Además de la provisión de la estimulación de TCR y CD2....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todo uso de los animales se realizó de conformidad con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso.

1. Preparación de Mezclas y Medios de Comunicación

  1. Estéril de pH de PBS: 7,3 (1 L)
    0,23 g NaH 2 PO 4
    1,15 g de Na 2 HPO 4
    9,0 g de NaCl
    Recoger el volumen con agua DI. Esterilizar con autoclave.
  2. Cultivo Celular Medios (100 ml)
    89 ml de RPMI
    10 ml de 10% de FBS
    1 ml Antibiótico antimicótico (ABAM) 100 mg 50 mM 2-mercaptoetanol (3,5 mg de s....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Este protocolo de diferenciación de Th17 comienza con la extracción del bazo y la axilar, braquial, mesentérica, de cuello uterino, y los ganglios linfáticos inguinales. Una representación de las ubicaciones de cada uno se puede encontrar en las Figuras 2 y 3. Las figuras 1 y 5 tanto proporcionan una representación visual de los métodos descritos en este protocolo.

Este protocolo se centra en la diferenciación Th17 de la población de linfoci.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Aquí hemos descrito el protocolo para lograr la diferenciación in vitro Th17. El estudio de la diferenciación de Th17 es importante, como la diferenciación de los linfocitos T en el subconjunto de Th17 es crítico para la eliminación efectiva de los patógenos humanos 13. A la inversa, la producción de IL17 se ha asociado con progresión de la enfermedad autoinmune 13. El método de diferenciación de Th17 es aplicable a muchos entornos de investigación, ya que se puede aplicar a numerosos mode.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

No hay revelaciones para declarar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado en parte por los premios NIH / NCATS clínica y traslacional Ciencia a la Universidad de Florida y TL1 TR000066 TR000064 UL1, un suplemento de la diversidad de los padres de Grant R01AI056152 del Instituto Nacional de Salud, una donación de reactivos BD Biosciences, y la Universidad de la Florida.

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo/Material
Estéril Poliestreno Placa de PetriFisher Scientific0875713A60 mm x 15 mm
AutoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Portaobjetos de Microscopio Premium, EsmeriladoFisher Scientific12-544-33" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Jeringa y aguja sin látexBD Biosciences309632
Corning 15 ml Tubos de CentrífugaSigma-AldrichCLS430791
Nylon 40 micrasMiami AquacultureNylon 40/26
Microtest placa de cultivo de tejidos 96 pocillos U bottom BD Biosciences35-3077
Corning Costar 24 pocillos placas de cultivo celularSigma-AldrichCL3524
Tubos Eppendorf 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Hámster Purgado NA/LE Anti-Ratón CD3eBD Biosciences553057
Hámster Na/LE Purificado Anti-Ratón CD28BD Biosciences553294
Ratón IL-6 Proteína RecombinanteeBioscience14-8061-62
TGFbetaR& D Systems240-B-002
Solución de azul de tripán 0.4 %Sigma-Aldrich66H2364
Pac Rata Azul Anti-Ratón CD4BD Biosciences558107
APC Rata Anti-Ratón CD8aBD Biosciences553035
PE Conjugado Anti-ratón CD25eBioscienceE01155-516
Alexa Fluor 700 Rata Anti-ratón IL-17BD Biosciences560820
Kit de inicio de tinción de citocinas intracelulares-ratónBD Biosciences51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ kit de aislamiento de células T reguladoras, ratónMiltenyi Biotec130-091-221
ABAM Cellgro30-004-CI
RPMICorning, Cellgro10-040-CM
B 2-Mercapt– EtanolMP Biomédica194834Peligroso
Forbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)
Ionomicina Sal de CalcioSigma-Aldrich13909-1ML
Brefeldina A Peligrosa (BFA)MP Biomedicals159027
ELISA IL-17A Captura mAb BD Biosciences555068
ELISA IL-17A Detección mAb BD Biosciences555067
ELISA IL-17A EstándareBioscience14-8171-80
IL-2 ELISA KitBD Biosciences555148
TMB Juego de reactivos de sustrato BD Biosciences555214
Equipment
>autoMACS Pro Cell SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
Centrífuga Sorvall Legend RT+ThermoScientific
Incubadora de CO2 serie Napco 8000 WJTermociclador ThermoScientific
PTC-200 PeltierBiorad

Referencias

  1. Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
  2. Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Aislamiento de ganglios linfáticosdisección del bazoseparación AutoMaxcitometría de flujoanálisis de qPCRdetección por ELISAcondiciones inductoras de Th17expresión de IL-17