Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Resumen

Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Resumen

Células Th17 son un subconjunto distinto de las células T que se han encontrado para producir interleucina 17 (IL-17), y difieren en función de los otros subconjuntos de células T, incluyendo Th1, Th2, y células T reguladoras. Células Th17 han surgido como un culpable central en las respuestas inmunes inflamatorias exceso de celo asociados con muchos trastornos autoinmunes. En este método purificamos los linfocitos T del bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6, y estimular a las células T CD4 + purificadas bajo ambientes Th17 inductores de control y. El entorno de Th17-inducir incluye la estimulación en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, IL-6, y el TGF-β. Después de la incubación durante al menos 72 horas y hasta por cinco días a 37 ° C, las células se analizan posteriormente para la capacidad de producir IL-17 a través de la citometría de flujo, qPCR, y ELISA. Th17 diferenciado las células CD4 + CD25-T pueden ser utilizados para aclarar aún más el papel que juegan las células Th17 en el inicio y la progresión de la autoinmunidad y el anfitrión defensa. Por otra parte, Th17 diferenciación de CD4 + CD25 de los linfocitos de los modelos knockout / enfermedad murinos distintas puede contribuir a nuestra comprensión de la plasticidad del destino celular.

Introducción

Los linfocitos T CD4 + (células T) juegan un papel crítico en la defensa inmunitaria mediada por sistema contra microorganismos infecciosos. Por el contrario, las células T también están íntimamente asociados con la aparición y progresión de las enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, y artritis reumatoide. Linfocitos T CD4 + se activan a través de una combinación de receptor de células T (TCR) interacciones con el antígeno cognado / complejo mayor de histocompatibilidad II (CMHII) moléculas, y las interacciones de los receptores CD28 con B7.1/B7.2 ligandos ^15. Además de la provisión de la estimulación de TCR y CD2....

Protocolo

Todo uso de los animales se realizó de conformidad con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso.

1. Preparación de Mezclas y Medios de Comunicación

1. Estéril de pH de PBS: 7,3 (1 L)
   0,23 g NaH ₂ PO ₄
   1,15 g de Na ₂ HPO ₄
   9,0 g de NaCl
   Recoger el volumen con agua DI. Esterilizar con autoclave.
2. Cultivo Celular Medios (100 ml)
   89 ml de RPMI
   10 ml de 10% de FBS
   1 ml Antibiótico antimicótico (ABAM) 100 mg 50 mM 2-mercaptoetanol (3,5 mg de s....

Resultados

Este protocolo de diferenciación de Th17 comienza con la extracción del bazo y la axilar, braquial, mesentérica, de cuello uterino, y los ganglios linfáticos inguinales. Una representación de las ubicaciones de cada uno se puede encontrar en las Figuras 2 y 3. Las figuras 1 y 5 tanto proporcionan una representación visual de los métodos descritos en este protocolo.

Este protocolo se centra en la diferenciación Th17 de la población de linfoci.......

Discusión

Aquí hemos descrito el protocolo para lograr la diferenciación in vitro Th17. El estudio de la diferenciación de Th17 es importante, como la diferenciación de los linfocitos T en el subconjunto de Th17 es crítico para la eliminación efectiva de los patógenos humanos ^13. A la inversa, la producción de IL17 se ha asociado con progresión de la enfermedad autoinmune ^13. El método de diferenciación de Th17 es aplicable a muchos entornos de investigación, ya que se puede aplicar a numerosos mode.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo/Material
Estéril Poliestreno Placa de Petri	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
AutoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Portaobjetos de Microscopio Premium, Esmerilado	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Jeringa y aguja sin látex	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Tubos de Centrífuga	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 micras	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest placa de cultivo de tejidos 96 pocillos U bottom	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 pocillos placas de cultivo celular	Sigma-Aldrich	CL3524
Tubos Eppendorf 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Hámster Purgado NA/LE Anti-Ratón CD3e	BD Biosciences	553057
Hámster Na/LE Purificado Anti-Ratón CD28	BD Biosciences	553294
Ratón IL-6 Proteína Recombinante	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R& D Systems	240-B-002
Solución de azul de tripán 0.4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Rata Azul Anti-Ratón CD4	BD Biosciences	558107
APC Rata Anti-Ratón CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugado Anti-ratón CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rata Anti-ratón IL-17	BD Biosciences	560820
Kit de inicio de tinción de citocinas intracelulares-ratón	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ kit de aislamiento de células T reguladoras, ratón	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-Mercapt– Etanol	MP Biomédica	194834	Peligroso
Forbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)
Ionomicina Sal de Calcio	Sigma-Aldrich	13909-1ML
Brefeldina A Peligrosa (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Captura mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detección mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Estándar	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Juego de reactivos	de sustrato BD Biosciences	555214
Equipment
>autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Centrífuga Sorvall Legend RT+	ThermoScientific
Incubadora de CO2 serie Napco 8000 WJ	Termociclador ThermoScientific
PTC-200 Peltier	Biorad