Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Hemo, un complejo de hierro ferroso y protoporfirina IX es una molécula central para el transporte y la utilización de oxígeno en los organismos que viven prácticamente todos ^1-3. La estructura única de hemo le permite funcionar como un portador de gases diatómicos y electrones, así como para realizar diversas otras funciones ^1-5. Por ejemplo, hemo se une al oxígeno en la hemoglobina y la mioglobina para la transferencia y el almacenamiento de ^6,7 oxígeno. También funciona como un transportador de electrones en los citocromos durante la respiración y actúa como un donador de electrones para las reacciones redox catalizadas por enzimas del citocromo P450 ^8,9. Una de las características más significativas de hemo es que, puede desempeñar un papel regulador en los procesos celulares y moleculares, tales como la transcripción de genes, síntesis de proteínas y micro-ARN biogénesis ^4. Por ejemplo, afecta a la transcripción de muchos genes mediante el control de la actividad de represor transcripcional de mamífero Bach1 y la rec nuclear de mamíferoeptor Rev-erbα ^10-15. Heme regula la activación de la proteína activadora de hemo (Hap) 1 que desempeña un papel importante en la activación de genes implicados en la respiración y controlar el daño oxidativo, en respuesta a heme o de oxígeno ^16. Heme también regula la transcripción de genes en las células neuronales a través de factor de crecimiento nervioso (NGF) de señalización ^3,17-20. También regula la síntesis de proteínas en las células eritroides de mamífero mediante la modulación de la actividad de quinasa eIF2α hemo-regulados (HRI) ^21-24. Además, hemo afecta a la actividad de las proteínas de señalización clave como la tirosina quinasa Src y Jak2, que son esenciales para el funcionamiento adecuado de las células y ^4,20,25 crecimiento celular. Se encontró que en células HeLa inhibición heme provoca la detención del ciclo celular y la activación de marcadores asociados con la senescencia y apoptosis ^26. Tanto la deficiencia de hemo o aumento de los niveles de hemo se asocian con efectos graves para la salud en los seres humanos ^27. Recientes un molecularnd estudios epidemiológicos han mostrado una asociación positiva de alto consumo hemo y aumento del riesgo de enfermedades, tales como diabetes tipo 2, enfermedad coronaria y varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y cáncer de páncreas ^27,28. El uso de un par emparejado de laboratorio de células pulmonares normales y cancerosas autores han encontrado que las células cancerosas se han incrementado los niveles de consumo de oxígeno, la síntesis del grupo hemo y proteínas implicadas en la captación de hemo y oxígeno utilización ^28. Curiosamente, la inhibición de la síntesis de hemo disminuyó el consumo de oxígeno, la proliferación, la migración y la formación de colonias de células de cáncer ^28. Por lo tanto, la fluctuación en los niveles de hemo endógeno juega un papel importante en la regulación de procesos moleculares y celulares ^3,4,28,29.

En los mamíferos, la biosíntesis de hemo se produce en ocho etapas, que implican enzimas localizadas en la mitocondria y el citosol ⁴ (Figura 1). Bios hemotesis comienza en la matriz de la mitocondria con la condensación de glicina y succinil-CoA reductasa para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalizada por ALA sintasa (ALAS) ^4,31. Este es el paso limitante en la biosíntesis de hemo en células no eritroides. 5-ALA entonces se exporta hacia el citosol, donde se producen los siguientes cuatro pasos para formar coproporfirinógeno III (CPgenIII), que luego se importa de nuevo a las mitocondrias, donde se convierte en la protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, una molécula de hierro se incorpora a la protoporfirina IX (PPIX) para producir hemo, una reacción catalizada por ferroquelatasa (FECH) ^2,4.

El nivel de la biosíntesis de hemo depende principalmente del nivel de enzima ALAS que está estrechamente controlada por el hierro hemo intracelular y ^4. La biosíntesis de hemo puede verse afectada por defectos genéticos, la disponibilidad de ciertos minerales y vitaminas (por ejemplo, riboflavina, zinc), la exposición a toxinas (por ejemplo, aluminio, plomo), Anoxia, fiebre, y los niveles de ciertos esteroides (por ejemplo, estrógeno) ^32-35. El nivel de la síntesis de hemo se altera en diversas condiciones de enfermedad. Disminución de la biosíntesis del grupo hemo puede causar anemia, así como enfermedades neurológicas ^3,36. Alternativamente, el aumento de la biosíntesis de hemo juega un papel importante en la progresión de ciertos cánceres ^28,37. Heme ha demostrado ser crítico para el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de los mamíferos adiposo, eritroides y células neuronales ^4,38-41. Por ejemplo, la deficiencia de hemo conduce a un daño de neuritas en neuronas corticales de ratón primaria a través de la inhibición de glutamato NMDA (N-metil-D-aspartato) receptor ^17. Además, la inhibición de la síntesis de hemo causa la muerte celular programada en el carcinoma de cuello uterino humano epitelial células HeLa ^26,41. Por lo tanto, la medición de los niveles de biosíntesis de hemo en diversas células bajo diferentes condiciones es importante para el estudio de la etiología y progressien de muchas enfermedades.

Aquí se describe un método rápido y sensible para medir el nivel de la síntesis de hemo intracelular mediante el uso de [4- ¹⁴ C] de ácido 5-aminolevulic. Este es un método alternativo a otros métodos que utilizan ⁵⁵ o ⁵⁹ Fe Fe. Preferimos utilizando ¹⁴ C porque su radiación es muy débil. Por el contrario, se requiere una fuerte protección para trabajar con isótopos Fe. Además, este método está destinado a medir y comparar la síntesis de hemo en diferentes células en paralelo de una manera rápida. Con el fin de medir los niveles de hemo absolutos, se puede utilizar el método previamente establecido que implica el uso de HPLC ^42,43.

PRECAUCIÓN: Mientras trabajaba con radiactividad, tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminación del experimentador y el entorno. Deshágase de todos los desechos siguiendo las directrices locales de seguridad radiológica.

1. Preparación de las células

1. Células de semillas en 3,5 cm placas de tal manera que la confluencia alcanza el 80% -90% en el día de ensayo.
   1. Tenga en cuenta que la siembra de confluencia para las células depende del tipo celular y su tasa de crecimiento. Cuando el tratamiento de las células con un reactivo para un cierto número de días, semilla de células de modo que la confluencia es 80% -90% en el día de la medición de hemo. Si el número de células obtenido a partir de 3,5 cm placas es insuficiente, utilizar placas de 6 cm con la misma cantidad de ALA radiactivo como en el siguiente paso.
      Nota: El uso de placas individuales se recomienda porque es más fácil de manejar platos individuales.
2. Un día antes de la medición hemo, añadir 0,1-0,3 Ci ^[14 C] 5-ALA y ALA frío para llegar a un final Concentración de 20 M del total ALA a cada placa de cultivo en un ataque área de trabajo para trabajar con materiales radiactivos y poner las placas de nuevo en la incubadora. Idealmente, se incuba con ALA radiactivo durante 16 horas.
   Nota: radiomarcado 5-ALA requiere puede variar entre líneas celulares. Se requiere un recuento radiactivo por minuto (cpm) de al menos 100 para reducir al mínimo el error asociado con el conteo. Es aconsejable para determinar una cantidad mínima de ^[14 C] 5-ALA requerida para las líneas celulares estudiadas. Para la mayoría de experimentos 0,1-0,3 Ci es suficiente para obtener una buena medición. La adición de frío ALA es opcional.

2. El hemo Extracción

1. Coloque las placas de cultivo de células en hielo y llevarlos a la zona en condiciones de trabajar radiactividad.
   1. Realizar todo el proceso de extracción y evaporación en una campana a prueba de explosiones. Debido a que el éter almacenado puede explotar, utilizar el éter en pequeñas botellas y evaporar los líquidos restantes, no almacene en el éteruna botella abierta durante más de un mes. No utilice acetona cerca de llamas abiertas y calentadores, ya que es altamente inflamable. Acetona tienda que contiene reactivos en botellas de vidrio, ya que disuelve plástico de cultivo de tejidos.
2. Aspirar el medio utilizando una pipeta. Lavar las células una vez con 1 ml de PBS 1x frío. Aspirar PBS.
3. Añadir 1 ml de PBS 1x frío a las placas y recoger las células en la parte inferior de la placa utilizando una goma de policía. Transferir las células recogidas de cada plato a un tubo ml preenfriado 2 etiquetados. Recoge todas las células en tubos de 2 ml.
   Nota: Utilice un policía de caucho fresco para cada placa para raspar las células de cada placa. Para cada placa que requeriría cuatro 2 ml tubos, un tubo de 1,5 ml y un vial de centelleo.
4. Centrifugado a 15.000 xg durante 1 min a 4 ° C.
5. Saque PBS utilizando una pipeta, dar un breve centrifugado y retire el PBS residual. Resuspender las células en 100 l de PBS 1x. Vortex para volver a suspender las células y mantener en hielo.
6. Tome 10 y# 956; l desde el paso 5 y la transferencia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar en hielo para medir la concentración de proteínas.
   Nota: tampón de lisis celular, debe añadirse a las células y se mantuvo en hielo para medir la concentración de proteínas más tarde.
7. Haga girar los 90 l restantes de la etapa 5 a 5.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C; eliminar completamente PBS utilizando una punta de pipeta 200 l.
8. Añadir 300 l de tampón de extracción hemo (ver Lista de Materiales) a cada tubo. Entonces vórtice durante 15 segundos para mezclar y poner en hielo durante 1 min, repetir esto 3 veces.
   1. Añadir tampón de extracción hemo (HEB) y agitar el tubo rápidamente para volver a suspender el sedimento, hacer sólo una o dos tubos a la vez porque la pastilla debe resuspendió rápidamente sin quedarse en el HEB durante demasiado tiempo. Una vez HEB se añade a todos los tubos y sedimento se resuspende a continuación, siga el vórtice 15 seg y 1 min en el ciclo de hielo como en el paso 8. Nota pellet que puede no ir completamente en el HEB si la pastilla se deja en el tampón de HEB para una mástiempo y no se resuspendieron rápidamente.
9. Añadir 1,2 ml de éter dietílico a cada tubo y agitar durante 30 seg. Centrifugado a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
   Nota: El éter dietílico se queda sin puntas de pipeta rápidamente. Para controlar esto, dietil éter pipeta arriba y abajo una vez o dos veces, haciendo así que ayuda a mantener el éter de dietilo en la pipeta. Repita esto cada vez que se utiliza una punta de pipeta nueva.
10. Transferencia de fase superior (éter) con 1 ml de la pipeta a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir 0,5 ml de HCl 2 N, vórtice de mezclar y giro como en el paso 9.
    Nota: Es difícil ver la separación entre fases de éter y HCl. Por lo tanto, añadir pequeñas cantidades de azul tripán en solución de HCl 2 N para ser utilizado durante el experimento, lo suficiente como para darle un color azul pálido. Esto le ayudará a distinguir las dos fases. La fase inferior será azul y la fase etérea superior será incoloro. Transferir la fase etérea incoloro superior a un tubo nuevo y desechar la fase inferior HCl (azul).
11. Repita el paso 10 de dosmás veces para lavar la fase etérea con HCl 2 N. Transferir sólo la fase de éter arriba a un nuevo tubo durante cada repetición y desechar la fase inferior HCl.
12. Después del tercer lavado con HCl, transferir la fase superior con 1 ml de la pipeta a un vial de centelleo. Secar las muestras por evaporación del éter dietílico, manteniendo las muestras en la campana química O / N.

3. Medición de la radiactividad

1. Al día siguiente, añadir 5 ml de líquido de centelleo de las muestras secas desde el paso 2.12.
2. Agitar bien para mezclar. Medir la radiactividad usando un contador de centelleo.

4. Cálculos

1. Lisar las células del paso 2.6 utilizando la misma cantidad de tampón CelLytic M (ver Lista de Materiales) y centrifugado a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
2. Tomar una alícuota del sobrenadante y medir la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteína BCA.
   La cantidad total de proteína en mg (TP) = (90 * l conc. De proteína en81; g / l) / 1000
   Nivel de síntesis del grupo hemo (radiactividad / TP) = pmol / mg de proteína.

Este método se utilizó para comparar los niveles de síntesis de hemo en normal (HBEC30KT) vs. cáncer (HCC4017 células pulmonares). La Figura 2 muestra un nivel más alto de la síntesis de hemo en células de cáncer (HCC4017) que las células pulmonares normales (HBEC30KT). El nivel de la síntesis de hemo también se midió en células normales y cancerosas en la presencia de cianuro de carbonilo desacoplador mitocondrial 3-clorofenilhidrazona (CCCP). Las células fueron tratadas con CCCP 10 mM durante 24 horas antes de la medición de los niveles de síntesis del grupo hemo. Como era de esperar, los niveles de síntesis de hemo (Figura 2) se redujo en presencia de CCCP tanto en las células normales y cancerosas. Se ha demostrado previamente que la síntesis de heme puede ser inhibida por acetona succinil (SA), un inhibidor potente y específico de deshidratasa ácido 5-aminolevulínico (ALAD) que es la segunda enzima en heme ruta biosintética 41. Usando este método, se midieron los niveles de síntesis del grupo hemo en células HeLa en presencia y abscia de 0,5 mM SA. La Figura 3 muestra que los niveles de síntesis del grupo hemo se redujo en más de 10 pliegues en presencia de SA. Para demostrar aún más el uso de esta técnica, se midieron y se compararon en 4 cáncer y en líneas de células HEK293T tal como se muestra en la Figura 4 los niveles de síntesis de hemo.

Figura 1. La biosíntesis del hemo vía en humanos ALAS, 5-aminolevulínico sintasa de ácidos.; 5-ALA, el ácido 5-aminolevulínico; ALAD, ALA deshidratasa; PBG, porfobilinógeno; HMBS, sintasa hidroximetilbilano; HMB, hidroximetilbilano; UROS, uroporfirinógeno III sintasa; UPgenIII, uroporfirinógeno III; UROD, uroporfirinógeno descarboxilasa; CPgenIII, coproporfirinógeno III; CPOX, coproporfirinógeno III oxidasa; PPgenIX, protoporfirinógeno IX; PPOX, protoporfirinógeno IX oxidasa; PPIX, protoporfirina IX; FECH, Ferroquelatasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Los niveles de la biosíntesis del grupo hemo en normal (HBEC30KT) y el cáncer (HCC4017) líneas celulares, en ausencia y presencia de 10 mM CCCP desacoplador mitocondrial. El nivel de fondo fue similar al nivel de la muestra en blanco (líquido de centelleo sola) y se fue inferior al 2% del control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Niveles de la biosíntesis del grupo hemo en células HeLa en absENCE y la presencia de 0,5 mM de inhibidor de la síntesis del grupo hemo succinil acetona (SA). Las células fueron tratadas con SA durante 3 días antes de la medición hemo. El nivel de fondo fue similar al nivel de la muestra en blanco (líquido de centelleo solo) y fue inferior al 2% del control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Comparación de los niveles de biosíntesis de hemo en 4 cancerosas y líneas de células HEK293T. El ensayo se realizó según el protocolo. HCC4017 se cultivaron en ACL4 medios de comunicación, A549 y H1395 en RPMI1640 suplementado con 5% de FBS, HEK293T y HeLa en DMEM suplementado con 10% FBS. Para el análisis estadístico, los niveles de síntesis de hemo en las células cancerosas y las células HEK293T fueron comparados con el nivel de la síntesis de hemo en HCC4017 células, mediante el uso de Welch 2 muestra de t-test. **, P valor <0,005. El nivel de fondo fue similar al nivel de la muestra en blanco (líquido de centelleo solo) y fue inferior al 2% del control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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