Combinado imagiologia óptica e μCT num modelo de rato com infecção de implante ortopédico, utilizando uma estirpe bioluminescente engenharia de Staphylococcus aureus, desde a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente controlar a dinâmica da infecção bacteriana, assim como a resposta inflamatória correspondente e alterações anatómicas na osso.
Imagens multimodalidade surgiu como uma abordagem tecnológica comum usado tanto em pesquisa pré-clínica e clínica. Técnicas avançadas que combinam em imageamento óptico e μCT vivo permitem a visualização dos fenômenos biológicos em um contexto anatômico. Essas modalidades de imagem pode ser especialmente útil para estudar as condições que o osso impacto. Em particular, as infecções de implantes ortopédicos são um problema importante em cirurgia ortopédica clínica. Estas infecções são difíceis de tratar, pois o biofilme se formar nas estrangeiras materiais implantados cirurgicamente, levando à inflamação persistente, osteomielite e eventual osteólise do osso ao redor do implante, o que acaba resultando em afrouxamento e falha do implante. Aqui, um modelo de ratinho de um implante ortopédico protético infectado foi usado, que envolveu a colocação cirúrgica de um implante de fios Kirschner em um canal intramedular do fémur de tal modo que a extremidade do implante extended na articulação do joelho. Neste modelo, ratinhos LysEGFP, uma estirpe de ratinho que tem neutrófilos EGFP-fluorescentes, foram empregados em conjunto com uma estirpe de Staphylococcus aureus bioluminescente, que, naturalmente, emite luz. As bactérias foram inoculadas nas articulações do joelho dos ratinhos antes de fechar o local cirúrgico. In vivo bioluminescente e imagiologia fluorescente foi utilizado para quantificar a carga bacteriana e resposta inflamatória de neutrófilos, respectivamente. Além disso, μCT imagiologia foi realizada no mesmo ratinhos de modo que a localização dos sinais ópticos fluorescentes bioluminescente e 3D pode ser co-registadas com as imagens μCT anatómicas. Para quantificar as alterações no osso ao longo do tempo, o volume do osso externo dos fémures distais foram medidos em pontos de tempo específicos, usando um processo de segmentação baseada contorno semi-automatizado. Tomados em conjunto, a combinação in vivo de bioluminescente / imagens fluorescentes com μCT de imagem pode ser especialmente útil fou a monitorização não invasiva da infecção, da resposta inflamatória e alterações anatómicas nos ossos ao longo do tempo.
Multimodalidade técnicas de imagem pré-clínicos que envolvem a combinação de informações ópticas e anatômicas permitem a visualização e monitoramento de fenômenos biológicos em 1-4 3D. Desde μCT de imagem permite a visualização requintado de anatomia óssea, utilizando μCT imagem em conjunto com de imageamento óptico representa uma combinação única que pode ser especialmente útil para processos que envolvem biologia óssea 5-7 investigando. Um exemplo seria usar essas técnicas para estudar infecções de implantes ortopédicos, que representam uma complicação desastrosa após procedimentos cirúrgicos ortopédicos 8,9. Bactérias biofilmes formar sobre os objectos estranhos implantados que promovem a sobrevivência das bactérias, servindo como uma barreira física que impede que as células imunitárias de detecção da infecção e bloqueia o acesso aos antibióticos a partir de bactérias 10,11. A infecção crônica e persistente do tecido das articulações (artrite séptica) umad osso (osteomielite) induz a reabsorção óssea que conduz ao afrouxamento da prótese e eventual falha de 8,9. Este osteólise periprotético resultante é associada com aumento da morbidade e mortalidade 12,13.
Em nosso trabalho anterior, in vivo bioluminescente e imagem fluorescente foi usado junto com raios-X e tomografia computadorizada de micro (μCT) em um modelo ortopédico infecção de prótese articular em ratos 14-19. Este modelo envolveu a colocação de um fio de titânio Kirschner-(K-wire), de tal maneira que a extremidade de corte do implante estendido na articulação do joelho a partir dos fémures de ratinhos 14-19. Um inoculo de Staphylococcus aureus (estirpe bioluminescente Xen29 ou Xen36) foi então pipetada para a superfície do implante, na articulação do joelho, antes do local cirúrgico foi fechado 14-19. In vivo imagiologia óptica foi utilizado para detectar e quantificar os sinais bioluminescentes, que correspondeu number de bactérias no tecido articular e do osso infectado 14-19. Além disso, a fluorescência in vivo de imagens de ratinhos LysEGFP, que possuem neutrófilos fluorescentes 20, foi utilizada para quantificar o número de neutrófilos que migraram para as articulações do joelho infectadas contendo os implantes K fios 14,19. Por fim, as modalidades de imagem anatômicos, incluindo imagens de alta resolução de raios-X e μCT imagem, permitida respectivo 2D e 3D imagens anatômicas do osso afetado por toda a duração da infecção crônica, que nós arbitrariamente terminam normalmente entre 2 e 6 semanas de pós-operatório 16 , 18. Usando esse modelo, a eficácia da terapia antimicrobiana local e sistêmica, resposta imune protetora e alterações anatômicas patológicas nos ossos poderiam ser avaliados 14-18. Neste manuscrito, os protocolos detalhados para as modalidades de imagens ópticas e μCT neste modelo infecção de prótese articular ortopédica foram fornecidos como representatisistema para estudar os processos biológicos no contexto anatômico do osso ve. Estes incluem os procedimentos cirúrgicos para modelar uma infecção de prótese articular ortopédica em ratos, em 2D e 3D em procedimentos de imagem óptico in vivo (para detectar sinais bioluminescentes bacterianas e sinais de neutrófilos fluorescentes), aquisição μCT imagem e análise e co-registro de imagens ópticas 3D com o imagens μCT.
Imagens multimodalidade como técnicas de imagem que utilizam em imageamento óptico vivo em conjunto com μCT imagem fornece uma nova abordagem tecnológica que permite a visualização em 3D, quantificação e monitorização longitudinal de processos biológicos em um contexto anatômico 1-4. Os protocolos no presente estudo fornecem informação detalhada de como in vivo bioluminescente e imagiologia fluorescente pode ser combinado com μCT imagiologia num modelo de infecção ortopédico protético implante em ratos para monitorizar a carga bacteriana, uma inflamação neutrofílica e alterações anatómicas no osso de forma não invasiva e longitudinalmente ao longo tempo. Tomadas em conjunto, as informações obtidas através da combinação de imagens ópticas e estruturais representa um grande avanço tecnológico, o que pode ser particularmente adequado para estudar os processos biológicos e as condições patológicas que afetam o sistema músculo-esquelético.
Um interesseconstatação ing que deve ser ressaltado é que observamos que os sinais fluorescentes EGFP-neutrófilos diminuiu para níveis de fundo por 14-21 dias e manteve-se em níveis de fundo para a duração do experimento, apesar da presença de bactérias bioluminescentes. É pouco provável que a irradiação com raios-X impactado sobrevivência de neutrófilos como observamos cinética semelhante de sinais de neutrófilos nos ratinhos não irradiado 19. No nosso trabalho anterior envolvendo um modelo de S. aureus feridas infectadas, a infiltração de neutrófilos envolveu uma combinação de recrutamento de neutrófilos robusta a partir da circulação, a sobrevivência prolongada de neutrófilos no local da infecção e o homing de células progenitoras KIT + para o abcesso, onde localmente dar origem a amadurecer neutrófilos 23. É provável que processos semelhantes contribuiu para a infiltração de neutrófilos no implante ortopédico S. modelo aureus. Embora seja desconhecido porque os sinais de neutrófilos diminuída em revmodelo de infecção aedic, pode ser que a resposta imune mudado ao longo do tempo que esta infecção progrediu de uma aguda de infecção crônica e este é um assunto de investigação futura.
Há limitações com este modelo do rato de infecção de prótese articular ortopédica e in vivo de imagens multimodalidade que deve ser observado. Em primeiro lugar, este modelo de rato é uma simplificação dos procedimentos reais e materiais utilizados em cirurgia ortopédica em humanos 24. No entanto, este modelo faz recapitular a infecção crônica e inflamação que se seguiu no osso e tecido comum que é visto em infecções de implantes ortopédicos humanos 8,9. Além disso, para se obter as imagens μCT, relativamente baixas doses de irradiação com raios X foram utilizadas para minimizar os efeitos adversos sobre a saúde dos animais durante o curso da infecção. Para uma melhor resolução do osso, as doses mais elevadas de radiação de raios-X pode ser usado para imagiologia de μCT sacrificados umanimals. No entanto, isso iria eliminar a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente monitorar as alterações ósseas ao longo da duração das experiências.
Em conclusão, a imagiologia multimodal que envolve a combinação de toda in vivo imageamento óptico animal com imagens μCT anatômica permitiu obter informações mais completas sobre a infecção e resposta inflamatória. Além disso, estas técnicas têm permitido a avaliação das consequências da infecção e inflamação no tecido ósseo e articulações. O trabalho futuro poderia tirar proveito de imagens multimodalidade para avaliar a eficácia de terapias antimicrobianas, respostas imunes, patogênese da doença e as mudanças reativas no osso como nós começamos a investigar 14-18. Além disso, a imagem latente multimodalidade poderia avaliar sondas e marcada para diagnosticar a presença de uma infecção, como anteriormente descrito, em modelos animais de infecção coxa, endocardite, Infect pulmonaríons e infecções de biomateriais 25-28. Por fim, o uso da imagem de multimodalidade poderia ser expandido para além das doenças infecciosas e utilizado em todas as disciplinas, incluindo ortopedia, reumatologia e oncologia, para investigar outras doenças que afetem o sistema músculo-esquelético, como o cancro do esqueleto, doença metastática, fraturas e artrite 5-7 .
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por um programa H & H Lee Surgical Residente Research Scholars (de janeiro), uma Fundação AO Start-Up concessão S-12-03M (a LSM) e um dos Institutos Nacionais de Saúde concessão R01-AI078910 (a LSM) .
Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
Wire Cutter – Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
Sustained-release Buprenorphine (5 ml – 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
Quantum FX in vivo μCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | μCT in vivo imaging system | |
IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and μCT in vivo imaging system | |
Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |