Summary
נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.
Abstract
נמטודות Entomopathogenic (aka EPN) מייצגות קבוצה של נמטודות מאכלסת-האדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. נמטודות אלה שייכות לשתי משפחות: Steinernematidae וHeterorhabditidae. עד כה, יותר מ -70 מינים תוארו בSteinernematidae ויש כ 20 מינים בHeterorhabditidae. יש לי נמטודות שותפות mutualistic עם חיידקי Enterobacteriaceae ויחד הם פועלים כמתחם קוטלי חרקים רב עוצמה שהורג מגוון רחב של מיני חרקים.
במסמך זה, אנו מתמקדים בטכניקות הנפוצות ביותר נחשבות לאיסוף EPN מהקרקע. החלק השני של מצגת זו מתמקד בטכניקה מתגרה חרקים, גישה בשימוש נרחבת עבור הבידוד של EPN מדגימות קרקע, ואת טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת להתאוששות של נמטודות אלו מחרקים נגועים. שיטות וטכניקות אלה הן שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של כת EPNures במעבדה וגם יוצר את הבסיס למבדקים אחרים, כי רואים נמטודות אלה כאורגניזמים מודל למחקר בתחומים ביולוגיים אחרים. הטכניקות שמוצגים במצגת זו מתאימות לאלו שבוצעו ו / או שעוצבו על ידי חברי המעבדה בורסת SP, כמו גם אלה שתוארו על ידי מחברים שונים.
Introduction
נמטודות רבות הקשורים לחרקים, ואינטראקציות המארח שלהם נעות בין מועיל למזיק. במסמך זה, אנו מתמקדים בקבוצה של נמטודות, כי הם פתוגנים של חרקים, הידוע גם בנמטודות entomopathogenic (או EPN). שתי משפחות נמטודות שייכות לקבוצה זו של נמטודות: Steinernematidae וHeterorhabditidae 11,13. ההשפעה פתוגניים שלהם היא בעובדה שמעניקה את האינטראקציה שלהם עם חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים enteric (חיידקי Xenorhabdus לקשר עם steinernematids וחיידקים Photorhabdus לקשר עם heterorhabditids) 2. החיידקים וקטורים ממארח חרק אחד למשנהו על ידי את הבמה רק נמטודות חיים החופשית, לנוער בשלב השלישי התולעת (הידוע גם בנוער dauer, לנוער התולעת או IJ), שחיה בקרקע. ברגע שנכנס החרקים, נמטודות לשחרר את החיידקים לתוך hemolymph של החרקים, שהורג את מארח החרק על ידי הרעלת דם מסיבית. החיידקים גםבזות רקמות של החרקים ולהיות מקור המזון 'נמטודות, ומאפשר להם להגיע לבגרות ולהתרבות. בדרך כלל, דור אחד או שניים של נמטודות המבוגר מיוצר בתוך פגר החרקים. הצאצאים של reassociates הדור המבוגר שעבר עם כמה תאי חיידקיים במתמחים יותר בצורה מאשר היחסים התזונתיים הקודמים שלהם, ולטפח את התאים האלה במעיים שלהם, כאשר הם עוברים מ פגר החרקים לתוך האדמה שם הם ממתינים לחרקים אחר לparasitize 6,11,14 (איור 1).
מאז הגילוי שלהם ב1927, EPN היה נחשב חלופות בעלות ערך לחומרי הדברה כימית כפי שהם יכולים parasitize מגוון רחב של חרקים, כי הם מזיקים חקלאיים 3,4,5. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, נמטודות אלה וחיידקים סימביוטיים הוכרו כמערכת מודל נזיל לחקר היבטים ביולוגיים, אקולוגיים והאבולוציוני של interactio מארח-חיידק14 NS.
המטרה של מצגת זו היא להראות את השיטות וטכניקות הנפוצות ביותר לדגימת אדמה ובידוד של EPN. מגוון רחב של כלים זמין ויכול לשמש לאיסוף דגימות קרקע ובם: מקלפות אדמה, כפות סיידים, חופרי הודעה חור, מקדחים, צינורות דגימה, אתים שני, בין השאר (איור 2).
בהתאם לצורך של המחקר, יכולות להיחשב שתי אסטרטגיות דגימה:) מרובדת, ב) דגימה אקראית (איור 3). הדגימה מרובדת משמשת בדרך כלל כחלק מלימוד אינטנסיבי באזור מסוים או demarked על פני תקופה נתונה של זמן. באופן כללי, חתך הוא demarked ודגימות קרקע נלקחות במרווחי זמן קבועים בחתך על פני תקופה של זמן (איור 3 א) 15. הדגימה האקראית היא בדרך כלל מועסק כאשר מתמקדים באזור נרחב. אסטרטגיית דגימה זו הייתה בשימוש ללימוד המגוון של EPN וrom שטח גדול גיאוגרפי או באזור (איור 3 ב) 12. מספר גורמים יכולים להיחשב בהתאם למיקוד של המחקר הכולל מגוון רחב של גבהים, מרקמי קרקע ובתי גידול (לדוגמא., שדות מעובדים, יערות, שטחי מרעה, פארקים, חופי ים, אזורי riparian, וכו ').
אנחנו מראים את הטכניקה מתגרה חרקים, שתוארה במקור על ידי מצעים ו1 Akhurst ומהווה חלופה פשוטה וסלקטיבית לשחזור EPN מדגימות קרקע. זהו הליך סלקטיבית המבוסס על ההנחה כי נמטודות (שלב IJ) יימשך למארח חרקים וparasitize זה. טכניקה זו יכולה להיחשב גם לבידוד של פתוגנים אחרים חרקים כגון פטריות, חיידקים ו8,10.
אנחנו גם מדגימים את טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת לאחזור צאצאי נמטודות ממארחי חרקים נגועים 7,14. זה מאמץ נפגשהוד שמציע את היתרון של אחזור נמטודות צאצאים "נקיים" ללא פסולת מגוויות חרקים משפילות.
לבסוף, הטכניקות המתוארות ומוצגות במאמר זה מתאימות לאלה שהגו ו / או שבוצעו במעבדה שלנו, כמו גם אלה שתוארו על ידי עמיתים ומשתפי פעולה שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אוסף דוגמאות קרקע
- שקול המשתרע על שטח מינימאלי של 2 - 4 מ '2 עבור כל אתר דגימה.
- לאסוף דגימות קרקע בעומק של לפחות 15 סנטימטר (איור 4).
- קח לפחות 5 דגימות אקראיות בתוך תחום זה.
- קח 3 subsamples לדגימה. בהתאם למטרת המחקר, או לשלב את subsamples או לשמור אותם בנפרד.
- מניחים כל דגימה בשקית ניילון. שקול כפול לצוד, כדי למנוע דליפה של דגימות (איור 4).
- דוגמאות לייבל עם סמן עמיד למים. כלול את המידע הבא מכל אתר דגימה: מידע באתר (כולל יישוב / אזור / שם אתר ולתאם מידע GPS), תאריך, בית גידול, צמחייה קשורה, טמפרטורה, גובה, וכו '
הערה: במידת צורך, לאסוף ו / או להקליט את נוכחותם של חרקים או חסרי חוליות אחרות שנאספו במדגם לזיהוי שלאחר מכן. הם עשויים לייצג נאטור פוטנציאלמארחים אל EPN. - כלי איסוף נקיים בין דגימות על ידי שטיפה ביסודיות עם מים ו / או חיטוים עם 70% אתנול או 0.5% פתרון אקונומיקה.
- שמור דגימות בצידנית (8-15 מעלות צלזיוס) במהלך הובלה למעבדה.
- קח את חלק של דגימת הקרקע לניתוח כדי להשיג מידע על הרכב קרקע, מרקם, לחות, מוליכות חשמליות או פרמטרים אדמה רצויים אחרים.
. 2 בידוד נמטודות מדגימות קרקע: טכניקת חרקים מתגרה
- הסר את כל פסולת (כלומר., סלעים, חתיכות עץ או קליפה, עלים, וכו '.) שנאסף בדגימות שלך כדי למנוע זיהום עם מיקרואורגניזמים saprobic.
- מוסיף מים כדי ללחלח את הקרקע ולהקל על התנועה של נמטודות.
הערה: השתמש בבקבוק ספריי כדי להגדיל את רמת הלחות של הקרקע באיטיות. - הנח כ 200-250 מיליליטר של אדמה לחה במכל פלסטיק נקי עם מכסה.
- להוסיף פיתיונות חרקים. שקול 5-10 חרקים על פני הקרקע של כל דגימה (איור 5).
- כסה את המכל עם מכסה ולהפוך את מכולות.
- לשמור על מכולות בחושך ועל RT (בדרך כלל 22-25 מעלות צלזיוס).
- בדוק מכולות כל 2 - 3 ימים ולהסיר חרקים מתים.
הערה: להוסיף חרקים בריאים נוספים לכל מכולה למתגרה נוסף של דגימת הקרקע. - הסר את החרקים מתים מהמכולות. הערה: גוויות עם חום או צבע אוקר בדרך כלל parasitized ידי steinernematids, בעוד הלבנים האדומים לגופות סגולות כהות parasitized ידי heterorhabditids.
- יש לשטוף גופות במים סטריליים.
- מניחים גופות במלכודת לבנה הותאם להתאוששות של צאצאי נמטודות (ראה הליך בהמשך).
מלכודת לבנה השתנה:. 3 נמטודות שחזור מגוויות נגועות
- הנח את החלק העליון של קוטר 50 (או 60) מ"מ. צלחת פטרי בתוך צלחת גדולה יותר (100 מ"מ).
- הגדרת חטא אחדנייר GLE מעגלי מסנן (# Whatman 1) בתוך הצלחת קטנה יותר.
- גופות מניחים על נייר הסינון של המנה קטנה יותר מה שהופך את גופות בטוחים לא נוגעות זה בזה, כדי למנוע כל זיהום.
- מלא את צלחת פטרי החיצונית (גדולה יותר) עם CA. 20 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים. אל תוסיפו מים בצלחת שמחזיקה את הגופות.
- מכסה את צלחת פטרי הגדולה ואת התוכן שלה עם המכסה (איור 6).
- תווית מנות בהתאם. הוסף את הפרטים הבאים: שם נמטודות (מינים / לבודד), תאריך זיהום (זיהום נקבע מועד) ותאריך מלכודת (זה תאריך המלכודת מוגדרת).
- שמור מלכודת ב RT עד הופעתה של התולעת שלבים לנוער (IJS) מתרחשת. תהליך זה יכול לקחת בין 10-25 ימים בהתאם למין נמטודות ו / או המאמץ הנחשב.
- מים קציר עם IJS על ידי הסרת הצלחת הגדולה יותר של המלכודת ולשפוך מים עם נמטודות לתוך מבחנה.
- לאפשר לנמטודות למזוג לתחתית בתייקר. תהליך זה עשוי לקחת כמה דקות.
- יוצקים מים בזהירות, מה שהופך נמטודות בטוחה תישאר בתחתית הכוס.
- יש לשטוף נמטודות על ידי הוספה יותר מים ומאפשרים לנמטודות למזוג. צעד זה יכול להיות חוזר ונשנה 2 - 3 פעמים עד שהמים נקיים.
- הנח השעיה נמטודות בבקבוק תרבית רקמה (250 מיליליטר). שמור על ריכוז של ההשעיה ל1,000 - 3,000 מיליליטר / נמטודות.
- בקבוק חנות עם תליוני נמטודות בחדר קר או בחממה בין 10-20 ° C.
הערה: לבדוק צלוחיות מאוחסנות מעת לעת כפי שחיי מדף של EPN הוא משתנה. בדרך כלל ניתן לאחסן steinernematids ל6-12 חודשים ללא הצורך בsubculturing, ואילו heterorhabditids עשוי לדרוש בדיקות תקופתיות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אוסף דוגמאות קרקע
קטינים התולעת שלישי בשלב של EPN השלבים רק בחינם החיים במעגל החיים 'נמטודות אלה אשר מתגוררים באדמה (איור 1). לכן, איסוף דגימות קרקע היא שיטה יעילה מאוד להתאושש מנמטודות אלו. איור 4 מראה פרופיל קרקע המציין את העומק שבו צריכים לקחת דגימות. שמירה על הלחות של מדגם היא גורם מפתח להישרדות של נמטודות. כתוצאה מכך, חשוב לשמור על דגימות קרקע בשקיות ניילון ולשמור אותם בטמפרטורות קרירות במהלך מעבר למעבדה (איור 4).
שחזור נמטודות
בטבע, סיכוי למציאת החרקים parasitized ידי EPN באופן טבעי הם פחות מ -3%, אלא אם יש מגיפה ומדגם גדול יותר של חרקים עם נגיעות EPN הוא נמצא. לכן, מתגרה של דגימות קרקע עם חרקים הוא appr נוחoach כדי לשפר את ההתאוששות של EPN מסביבתם הטבעית. איור 5 מתאר את הטכניקה מתגרה אדמה. במקרה זה, מיכל פלסטיק 250 מיליליטר עם ראש בורג היה בשימוש. כ 250 גרם של אדמה הושמו במכל ו5-10 G. זחלי mellonella נוספו על פני השטח של האדמה (איור 5 מימין). לאחר 5 ימים, מיכל נפתח כדי לאחזר חרקים מתים עם סימני זיהום EPN. שים לב זחלים הנגוע בנמטודות עם צבע אדום (איור 5 משמאל).
איור 6 א מראה ייצוג סכמטי של המלכודת הלבנה שונה. איור 6 מדגים את ההגדרה של המלכודת. שימו לב שגופות נגועות EPN לא נוגעות זה בזה ושנייר הסינון בצלחת פטרי הקטן נשאר יבש. איור 6C מציג IJS מתעורר מגופות. הערה 'השבילים' של נמטודות (IJS) שנוצרים על צלחת פטרי, כאשר הם עוברים למחלק את המים. הזמן להופעת IJ מן הגופות הוא משתנה בהתאם למיני נמטודות וגם תלויים בטמפרטורה ובלחות שבו הלבנה המלכודת נשמר. איור 6 ד 'מציג IJS כבר במים של המנה הגדולה יותר של המלכודת הזאת. שים לב שנמטודות במים נראות נקיות וחופשיות מרקמות חרקים.
איור 1. מחזור חיים של נמטודות entomopathogenic.
איור 2. אתים ומכשירים אחרים המשמשים לאיסוף דגימות קרקע. (א) נקודת האת קלאסית. (ב) חפירה בידו. (C) משמאל לימין: צינור Viehmeyer, שפכטל, צינורות Oakfield, מקלפות אדמה.
איור 3. אסטרטגיות דגימת קרקע. () מרובדת. (ב) אקראי.
איור 4. ייצוג סכמטי של אסטרטגית אדמת הדגימה. תמונה משמאל מראה את פרופיל קרקע המציין עומק רצוי שבו צריכים לקחת דגימות. תמונה של הימין מראה מדגם אדמה בשקית ניילון עם תיוג מתאים.
"Width =" 3/52083fig5highres.jpg 500 "/>
איור 5. Bating של דגימות קרקע עם זחלי חרקים. תמונה מהימין מראה זחלים בריאים, ואילו תמונה משמאל ניתן לראות זחלים מתים לאחר תקופה מתגרה 5 יום.
איור 6. ייצוג סכמטי () ותצלומים (BD) של מלכודת לבנה שונה. מלכודת (ב ') הקימה; (C) תקריב של גופה נגועה מראה הופעת IJ; (ד') תקריב מראה הופעה מסיבית של IJS מגופות לתוך המים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפגנה זו היא הראשונה מבין שתי מצגות המתארות את מספר הטכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד EPN והחיידקים סימביוטיים שלהם. טכניקות אלו מייצגות שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN במעבדה וגם יוצרות את הבסיס למבדקים אחרים שמעסיקים EPN כמו אורגניזמים מודל למחקר.
סקרי קרקע שונים של EPN הראו כי השפע וההפצה שלהם יכולים להשתנות על פני עונות השנה, בתי גידול ואזורים גיאוגרפיים 4, 5,9,15. גורמים כגון מרקם קרקע, תכולת לחות וטמפרטורה, כמו גם זמינה מארח עשויים לשחק תפקיד מפתח בהפצה שלהם. לכן, זה קריטי, כי נתונים ראשוניים על הסקר. ברגע שדגימות נלקחו, חשוב שהם מעובדים בהקדם האפשרי. עם זאת, אם זה לא אפשרות, הם צריכים להיות מאוחסנים בחדר קר או יחידת בקרת טמפרטורה מתאימה אחרת. טמפרטורות שונות עשויות להיותנחשב לאחסון מכולות מתגרה חרקים בהתאם למקורו של הדגימות. בדרך כלל, טמפרטורות קרירים (למשל., 15 מעלות צלזיוס) נחשבות לדגימות ממוזגים ודגימות מאזורים טרופיים, טמפרטורות חמים יותר (לדוגמא., 30 ° C) הן לש'.
הטכניקה מתגרה חרקים היא השיטה הנפוצה ביותר להתאוששות של EPN מדגימות קרקע. זוהי אסטרטגיה נוחה המאפשרת שליפה של EPN במעבדה. זחלי instar האחרונים של עש השעווה גדול יותר, mellonella Galleria (פרפרים: Pyralidae) נחשבים בדרך כלל; לעומת זאת, מארחים חרקים אחרים (כלומר, צרצרים, תולעי קמח, זחלי חיפושית, וכו ') ו / או בשלבים מתאימים יכולים להיחשב ומומלצים לשימוש. כמה מחקרים הראו כי מחזור חילוץ יחיד של שיטת Galleria-הפיתיון הוא לעתים קרובות מספיק לקביעת נוכחות של EPN במדגם מסוים או לחילוץ כל EPN מדגימת קרקעזה 15. בדרך כלל, שיעורי החלמה משתנים בין 20-40% 12,15.
אלטרנטיבה למתגרה של דגימות קרקע במעבדה היא השיקול של מתגרה באתרם. זהו המיקום של פיתיונות חרקים באתר הדגימה. במקרה זה, החרקים ממוקמים בכלובים (בדרך כלל עשויים ממתכת או רשת פלסטיק) והם עזבו באתרי demarked באזור המחקר לתקופת זמן נתונה. הכלובים עם החרקים ואז הביא ובדק לזיהום EPN. עם זאת, גישה זו היא עבודה אינטנסיבית וזמן רב 15.
טכניקת לכידת נמטודות תוכננה במקור על ידי 10 לבנים ומאוחר יותר הותאמו על ידי קאיה והמלאי 6. הטכניקה מנצלת את המשיכה של נמטודות למים (כלומר, hygrotropism החיובי) ומשחזרת בהצלחה שלבי התולעת של EPN חופשיים של רקמות ו / או פסולת חרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לחברים בעבר במעבדה המלאי: סם-קיו קים, קתרין Plichta וויקטוריה מירנדה-תומפסון על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. אנו מכירים את תמיכת הקרן הלאומית למדע (מענקי IOS-0,840,932 וIOS-0,724,978) לבורסת SP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
- Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R.
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
