En strømlinjeformet tilnærming til screening for ekspresjon av rekombinante membranproteiner i Escherichia coli basert på fusjon til grønt fluorescerende protein blir presentert.
Produksjon av rekombinante membranproteiner for strukturelle og funksjonelle studier forblir teknisk utfordrende på grunn av lave nivåer av ekspresjon og den iboende ustabilitet av mange membranproteiner gang oppløst i vaskemidler. En protokoll er beskrevet som kombinerer ligation uavhengig kloning av membran proteiner som GFP fusjoner med uttrykk i Escherichia coli oppdaget av GFP fluorescens. Dette gjør at konstruksjonen og screening av flere membran protein / varianter å identifisere kandidater som er egnet for videre investering av tid og krefter. GFP reporter anvendes i en primær skjermen av ekspresjon ved å visualisere GFP fluorescens etter SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Membranproteiner som viser både et høyt ekspresjonsnivå med minst mulig tap som indikert ved fravær av frie GFP, er valgt for en sekundær skjerm. Disse konstruksjoner blir skalert og en total membranfraksjon fremstilt og oppløseliggjøred i fire forskjellige vaskemidler. Etter ultrasentrifugering for å fjerne detergent-uoppløselig materiale, er lysatene analysert ved fluorescens deteksjon størrelseseksklusjons-kromatografi (FSEC). Å overvåke størrelsen utelukkelse profil av GFP fluorescens gir informasjon om mono-dispersitet og integriteten til membran proteiner i ulike vaskemidler. Protein: kombinasjoner vaskemiddel som eluer med en symmetrisk topp med liten eller ingen fri GFP og minimum aggregering er kandidater for påfølgende rensing. Ved hjelp av den ovennevnte metode, den heterologe ekspresjon i E. coli av SED (form, forlengelse, divisjon, og sporulering) proteiner fra 47 forskjellige arter av bakterier ble analysert. Disse proteiner har typisk ti transmembrandomener og er essensielle for celledelingen. Resultatene viser at produksjonen av SEDS orthologues i E. coli var svært variabel med hensyn til uttrykket nivåer og integriteten av de GFP-fusjonsproteiner. Eksperimentet jegdentified en undergruppe for videre etterforskning.
Det har blitt anslått at membranproteiner utgjør omtrent 20-30% av gener kodet i alle sekvenserte genomer 1, inkludert den humane genom 2. Gitt deres avgjørende rolle i mange biologiske prosesser, for eksempel transport av metabolitter, energiproduksjon og som narkotika mål, er det stor interesse i å bestemme deres tredimensjonale struktur. Men i forhold til løselige proteiner, membranproteiner er svært underrepresentert i Protein Data Bank. Faktisk av de 99 624 frigitte strukturer i PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) bare 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) er klassifisert som membran proteiner. Dette gjenspeiler de tekniske vanskelighetene med å jobbe med membran proteiner som er naturlig uttrykt ved relativt lave nivåer; rhodopsin er en av noen få unntak 3,4. Over-uttrykk av rekombinant versjons i heterologe celler resulterer ofte i misfolding og dårlig målretting til membranen som begrenser den totale produksjonsnivå. Velge den beste vaskemiddel for utvinning og oppløsning av en membran protein gang uttrykt gjør påfølgende rensing vanskelig og krever forsiktig optimalisering.
Escherichia coli er fortsatt det mest brukte uttrykket vert for membran proteiner står for 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) av strukturer løst til dato som er nesten utelukkende fra bakteriekilder. Spesifikk E. coli-stammer, C41 (DE3) og C43 (DE3), har blitt isolert som ikke fører til overuttrykk av membran proteiner og dermed unngå virkningene av toksisitet observert for andre BL21 stammer 5,6. Innstiller nivået av rekombinant membranprotein ekspresjon synes å være kritisk for å optimalisere produksjonsnivået 6,7.
<p class="Jove_content"> I mange tilfeller vellykket produksjon av membranproteiner for strukturbestemmelse har krevd evaluering av flere versjoner blant amino- og karboksy-terminale delesjoner, flere orthologues å utnytte naturlige sekvensvariasjon og forskjellige fusjonsproteiner 6-8. Derfor er en fremgangsmåte for ekspresjon screening av multiple membranproteiner i parallell avgjørende. En ofte brukt metode er å smelte proteinet til grønt fluorescerende protein (GFP) som muliggjør ekspresjon som skal spores uten behov for å rense proteinet. På denne måte kan informasjon om ekspresjonsnivået, stabilitet og oppførsel i forskjellige vaskemidler vurderes med små mengder av en ikke-renset materiale 9-12.I denne artikkelen beskriver vi en strømlinjeformet protokoll for kloning og ekspresjon screening av membranproteiner i E. coli ved hjelp av fusjon til GFP som reporter for produksjon og påfølgende karakterisering av vaskemiddel: protein complexes (figur 1).
I den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen, er ligering uavhengig kloning inn i en vektor GFP reporter kombinert med fluorescensdeteksjon å screene hurtig den relative ekspresjon av multiple membranproteiner i E. coli. Vektorer kan gjøres i fire dager med primær screening uttrykket tar en ytterligere uke. I gel-fluorescens av vaskemiddel-lysater av hele celler blir brukt til å rangere ekspresjon hardt for ytterligere analyse i en sekundær skjerm. Den primære uttrykket skjermen som presenteres krever ikke noe spesialutstyr, bortsett fra en risteinkubator egnet for dyrking av celler i dype brønn blokker. All annen væskebehandling som involverer 96-brønners SBS platene kan utføres ved hjelp av flerkanals pipetter. Protokollen kan lett modifiseres for å inkludere andre E. coli-stammer dyrket under forskjellige betingelser (f.eks uttrykk lavere temperatur). I tilfelle av LEMO21 (DE3) titrering av nivået av rhamnose (fra 0 til 2,0 mM)tilsettes til å modulere hastigheten av transkripsjon kan øke nivået av ekspresjon av noen membranproteiner 7. Andre enn DDM vaskemidler kan brukes for ekstraksjon i primærskjerm om strengere vaskemidler kan solubilisere proteiner fra inklusjonslegemer og dermed gi falske positiver. Jo mer utdype det første skjermbildet blir, jo mer tidkrevende eksperimentet.
Den sekundære skjermen innebærer fremstilling av en total membranfraksjon fra uttrykket treff som er identifisert i den primære skjermen. Dette er et kritisk punkt som det vil bekrefte lokaliseringen av fusjonsproteinene til membranen av E. coli-celler. Etterfølgende ekstraksjon av GFP-fusjonsprotein i forskjellige vaskemidler overvåkes av fluorescens-detektert størrelsesutelukkende kromatografi av solubilisert materiale for å vurdere mono-dispersitet av detergent-proteinkomplekser. Dette er et annet kritisk punkt siden det identifiserer den mest passende rengjøringsmiddel forsolubilisering av membranprotein for påfølgende nedstrøms prosessering. Erfaring viser imidlertid at ytterligere optimalisering av valget av vaskemiddel (e) kan være nødvendig under rensing og krystallisering. Bevis på ensartet oppførsel i forskjellige vaskemidler, inkludert de med en forholdsvis liten micelle størrelse (f.eks LDAO) synes å være god indikator på en tilbøyelighet til å danne godt diffraksjon krystaller i det minste for prokaryote membranproteiner 14. Den profil som er vist på membranprotein i figur 2B i denne forbindelse vises svært gunstig.
Den største fordelen med å bruke et GFP reporter er at det gir en rask utlesning av ekspresjon i ikke-renset prøver. En ulempe er at de GFP-fusjonsproteinet må fjernes under rensing av proteinet for krystallisering. I tilfelle av vektorene som brukes her, muliggjør en rhinovirus 3C-protease for spalting av GFP. Alternativt er det ukomplisertå re-klone kandidat proteiner, som er identifisert i skjermen, i vektorer som bare legger et polyhistidin eller annen affinitetsmarkør for påfølgende rensing. Dette forutsetter at fusjon til GFP er ikke nødvendig for ekspresjon. Hoved alternativ til å bruke fusjon til GFP for påvisning av membran protein uttrykk og oppløseliggjøringen er å legge til bare en histidin tag. Men denne metoden krever vanligvis starter med en membranfraksjon 15 som for evaluering av mange varianter ville bli meget tidkrevende.
I sammendraget, det viktigste formålet med protokollen som er beskrevet i denne artikkelen er å gi et stort antall av membran protein sekvensvarianter å være raskt evaluert i form av uttrykk og vaskemiddel solubilisering og prioritert for dypere analyse.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |