Este informe describe un método para medir la actividad de las larvas de Drosophila utilizando el Monitor de Actividad de Drosophila TriKinetics. El dispositivo emplea rayos infrarrojos para detectar los movimientos de hasta 16 animales individuales. Los datos se pueden analizar para representar los parámetros de movimiento, incluidas las tasas y las posiciones de los animales dentro de las cámaras de ensayo.
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La medición de las larvas La actividad en el
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Resumen
Las larvas de Drosophila se utilizan en muchos estudios de comportamiento, sin embargo, no se dispone de un dispositivo sencillo para medir los parámetros básicos de la actividad larvaria. Este protocolo reutiliza un instrumento que se utiliza a menudo para medir la actividad de los adultos, el monitor de actividad TriKinetics Drosophila (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) para estudiar la actividad de las larvas. El instrumento puede monitorear los movimientos de los animales en 16 tubos de ensayo de vidrio individuales de 8 cm, utilizando 17 haces de detección infrarrojos por tubo. El software de registro guarda automáticamente los datos en una computadora, registrando parámetros como el número de movimientos, las veces que se activaron los sensores y las posiciones de los animales dentro de los tubos. A continuación, los datos se pueden analizar para representar la locomoción general y/o la preferencia de posición, así como otras mediciones. Todos los datos son fácilmente accesibles y compatibles con el software básico de gráficos y manipulación de datos. Este protocolo discutirá cómo usar el aparato, cómo operar el software y cómo ejecutar un ensayo de actividad larvaria de principio a fin.
Introducción
El uso de Drosophila como herramienta genética ha transformado el conocimiento científico de los sistemas biológicos. Las larvas de Drosophila se han utilizado en una variedad de estudios, incluyendo la nocicepción1, el desarrollo2 y como modelo para el estudio de genes de enfermedades humanas3. La actividad de Drosophila abarca una gama de comportamientos que varían bajo diferentes condiciones, incluyendo temperaturas2, exposición a drogas4 y entre diferentes genotipos. Sin embargo, a pesar del uso significativo de la larva como organismo modelo, no se ha dispuesto de un método simple y estandarizado para analizar la actividad larvaria. En la actualidad, muchos estudios de locomoción larvaria emplean sofisticados software de análisisde video 5. Si bien es poderosa, la complejidad de estas herramientas automatizadas puede disuadir a los laboratorios que aún no están equipados para estudiar la locomoción de incluir el análisis de los parámetros de actividad informativa en sus estudios. En otros métodos no automatizados actuales, como el análisis de rastreo de cuadrícula, el movimiento es puntuado por un observador humano, lo que introduce la posibilidad de subjetividad y limita el rendimiento a un animal a la vez6-7. Un estudio similar utilizó un ensayo de rastreo de 5 carriles, que midió el tiempo que tardaban las larvas en recorrer una cierta distancia lineal8. En estos ensayos no automatizados, se mide el desplazamiento, pero esto no tiene en cuenta el recorrido no lineal entre los puntos inicial y final. Como se discute a continuación, el método descrito aquí representa una mayor parte del movimiento larvario real, es objetivo, fácil de operar y ofrece un rendimiento robusto.
Para estudiar fácilmente el comportamiento de la actividad larvaria sin comprometer la precisión, la eficiencia o el costo, este método emplea el Monitor de Actividad de Drosophila (DAM) TriKinetics, un dispositivo que se utiliza a menudo para estudiar la actividad de los adultos. El uso de un dispositivo para estudiar la actividad de los adultos y las larvas es rentable y permite la comparación directa del movimiento de los animales en estas dos etapas de la vida. El sistema, que cuenta con el nivel de resolución más alto del fabricante, utiliza 17 haces de detección infrarrojos por tubo de ensayo, que registran la actividad larvaria cuando se rompen los haces de los sensores dentro de los 16 tubos individuales. Luego, el sistema guarda automáticamente la información registrada en una computadora, poniéndola a disposición para su manipulación con un software básico de gráficos. Los datos obtenidos representan los haces que fueron rotos por las larvas individuales (que se pueden convertir en una tasa), el movimiento cuando una larva permanece dentro de un haz detector y la posición de los animales dentro de las cámaras de ensayo durante un período de registro (lo que permite calcular la preferencia de posición). El sistema es eficiente y relativamente fácil de operar, y pone al alcance de cualquier laboratorio que estudie larvas de Drosophila un análisis de actividad básica altamente reproducible.
Para demostrar el poder de este ensayo, se presentan datos que muestran su uso para verificar las diferencias en la actividad resultantes de la variación de las temperaturas ambiente, así como a través de la comparación de un mutante previamente descrito como hipoactivo (iav1)9 con un control ampliamente analizado (w1118).
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Protocolo
1. Preparación de las larvas
- Para analizar una larva deseada para la locomoción o la posición de preferencia, crecer larvas bajo condiciones estándar para la edad deseada para ensayar el uso de alimentos 10 mosca estándar 11.
- Haga un filtro de malla por el estiramiento de nylon de grado serigrafía malla sobre un embudo. Asegure la malla en el cuello de embudo con la goma. Colocar el embudo en un vaso de precipitados.
- Para recoger las larvas para el análisis, scoop una espátula llena de alimentos que contienen larvas alimentándose de la botella de cultivo y lavar con agua del grifo RT sobre el filtro de malla, la recogida de larvas individual directamente de la malla con un pincel 10.
2. Preparación de tubos de ensayo
- Para preparar para tapar los tubos de ensayo, hervir cuidadosamente un gel de agar al 4% y se vierte en una placa de Petri a una profundidad de 1,5 cm. Esto proporcionará un enchufe para cada lado del tubo cuando está encerrado animal. La solución de 4% es suficientemente densa para evitar que las larvas de penetrating los enchufes.
- Asegúrese de que los tubos estén limpios y claros antes de la inserción de la larva. Si no lo son, esto puede bloquear los movimientos de que se está grabando.
- Para asegurar larvas tienen suficiente humedad para el movimiento, prepare un frasco que contiene una pequeña cantidad de agua caliente. Invierta la botella, orientar cuidadosamente la salida hacia un lavabo y apretar suavemente para expulsar el agua del tubo de recogida.
- Inserte la salida de la botella en el tubo de ensayo. Apriete la botella para entregar vapor de agua en el tubo de ensayo hasta que aparezca una fina capa de condensación en la pared del tubo. Video 1 muestra una larva se mueve en un tubo con una cantidad apropiada de la humedad.
- Para sellar la larva en el tubo, quitar el gel de agar 1,5 cm de espesor de la placa de Petri y colocar sobre una superficie de malla para permitir el flujo de aire por debajo de la agar de modo que un tapón de agar puede ser insertado en el tubo. Presione un extremo del tubo de ensayo en el gel dos veces para insertar dos tapones de gel en un extremo.
- Con un paintbprecipitarse, coloque una larva en el tubo de aproximadamente 1,5 pulgadas de profundidad y sellar el tubo presionando el extremo más cercano a la larva en el gel de agar. La presión resultante forzará a cabo el segundo tapón de gel de agar desde el extremo opuesto y sellar el animal dentro del tubo.
- Colocar los tubos en el dispositivo MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM), y ajustar las posiciones de los tubos para que los animales no pueden ir más allá de la gama de los sensores.
- Para asegurarse de que los tubos de ensayo no se deslizan fuera del marco de lectura de infrarrojos del dispositivo durante el transporte, mantenga el tubo en su lugar mediante la fijación de un anillo de masilla alrededor de cada tubo, donde entra en contacto con el dispositivo de grabación.
3. Medición de la Actividad
- La actividad de registro en una incubadora para evitar lecturas erróneas que pueden ocurrir debido a las sombras, luces fluorescentes o de las variaciones de temperatura en el laboratorio. Consulte la Figura 5 para un arreglo sugerido del sistema.
- Establecer una incubadora a 20 ° C (ver Figura 1). Para evitar falsas grabaciones debido a la interferencia de fuentes de luz incandescentes durante la grabación, apague las luces fluorescentes de la incubadora y el uso de una fuente de luz LED por separado durante la grabación en la incubadora. Realizar un ensayo sin animales para garantizar que las condiciones de luz no desencadenar aberrante sensores. No debe haber datos de movimiento grabadas después de esta prueba.
- Permita que las larvas se adapte a la configuración de la incubadora 20 ° C durante 5 minutos antes de comenzar el ensayo.
- Para establecer el sistema DAM a intervalos de grabación que desee (por ejemplo, 1 min), asegúrese de software de grabación del sistema DAM se descarga al ordenador central 12 y abrir el archivo del sistema DAM antes de conectar la cámara de grabación a la interfaz Psiu.
- Para ajustar la frecuencia de grabación deseado en el que se guardarán los datos, seleccione las preferencias y haga clic encima o por debajo de la opción intervalo de lectura para seleccionar diferentes marcos de tiempo en el que los datosserá almacenado. Por ejemplo, seleccione la lectura de tiempos de intervalo de 1 segundo a 1 hora.
- Para seleccionar el parámetro que varía para grabar datos, elegir preferencias y luego seleccione las casillas correspondientes en virtud de salida de tipo de datos (cuentas, movimientos, posiciones y habitar, ver Tabla 1). Cada parámetro proporciona un análisis único de la actividad larval dentro del tubo.
- Para iniciar la grabación, conecte el monitor a la unidad de interfaz de fuente de alimentación (Psiu) utilizando cable telefónico CAB6. Conecte el Psiu a una toma de corriente. Una luz verde indicará conexión apropiada.
- Conecte el Psiu a través de un cable de bus serie universal (USB) a un Macintosh o PC con Windows para la grabación de datos. Abra el programa DAM SystemMB1v6x en el equipo para iniciar automáticamente la grabación de datos.
- Después se completa el tiempo de recogida deseada, seleccione Salir y salga ahora en la pantalla de la actividad DAM; los datos se guardará automáticamente bajo DAM de datos del sistema. Tome este archivo de datos (por ejemplo, monitorear 1) y arrastre en una carpeta separada. Esto almacenará los datos en bruto desde el software DAM para que más tarde pueden ser procesados.
4. Preparación de los datos para el procesamiento (DAM FileScan)
- Para procesar los datos en bruto en un formato comprensible abrir la aplicación DAM FileScan y seleccione Seleccionar carpeta de datos de entrada. A continuación, seleccione la carpeta de datos y el archivo deseado y seleccione la opción de escaneado. Por último, seleccione la longitud bin al período lectura deseada. Esto va a organizar los datos en bruto en los parámetros establecidos por el operador y el programa informará de los datos recogidos en ese rango particular.
- Seleccione el tipo de datos de salida para analizar el ajuste movimiento deseado (recuento del monitor, se mueve, moran). Bajo el menú de lecturas adicionales, seleccione suma a bin (esto es si la longitud bin es mayor que el intervalo de lectura sistema seleccionado).
- Nombre del archivo de manera adecuada y guardar. El archivo se almacena en la misma ubicación que la carpeta del paso 3.9.
- Con el fin de recoger promedio mueve, proceso los datos brutos generados desde el paso 4. Para generar una tabla en una hoja de cálculo, abra el archivo que se guardó previamente (paso 4.3), y cuando aparezca la ventana del asistente de importación de texto, seleccione acabado para abrir los archivos de datos en un formato de hoja de cálculo.
Nota: Dependiendo del tipo de datos analizados, la hoja de cálculo se leerá de manera diferente. Normalmente para medir movimientos de monitor o recuentos, el período de tiempo del estudio se registró numéricamente, mientras que cada tubo de lectura individual recibirá una carta designado. Cuando la visualización de los datos en la hoja de cálculo, las columnas representan KZ las ranuras para tubos de ensayo 1-16, respectivamente. Las filas representan los puntos de datos recogidos. - Por ejemplo, si se recogieron mueve durante 20 min en intervalos de 1 min, promediar las 20 filas para calcular un número medio de movimientos / minuto y otras mediciones.
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Resultados
La Figura 1 muestra los resultados de un estudio de respuesta de la temperatura de control de larvas de tercer instar, 1118 w, utilizando el dispositivo de monitorización para detectar diferencias en la locomoción de larvas en siete diferentes temperaturas. Las larvas se lava y se coloca en el dispositivo de la actividad DAM como se describe anteriormente, y se coloca en una incubadora a la temperatura deseada. A continuación, el aparato se dejó aclimatar al medio ambiente durante 5 minutos a...
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Discusión
Actividad de las larvas de Drosophila está influenciada por una variedad de factores incluyendo el genotipo 8, 13 años de edad y la temperatura ambiente 2. Aunque poderosos métodos videográficos capaces de análisis muy detallado han sido desarrollados por los que estudian la locomoción 5, este nivel de detalle puede ser superfluo para aquellos que deseen para determinar los parámetros básicos de la actividad. El método descrito aquí emplea un dispositivo que está disponible en m...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los NIH P20GM103643 a I. Meng.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Monitor de actividad Drosophila, multihaz, 16 tubos, incluidos los cables | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| para monitor de actividad | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Tubos de vidrio de 80 x 5 mm para monitor de actividad (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Software de adquisición de datos para Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | descarga gratuita | |
| del software DAMFileScan 108x para Macintosh | www.trikinetics.com | descarga gratuita | |
| de software USB (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | descarga gratuita | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | descarga gratuita | |
| Zeiss Stemi 2000C- Microscopio estereoscópico | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Dióxido de carbono | Maine Oxy | anestesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | superficie para clasificar moscas anestesiadas |
| Pincel pequeño | Winsor & Newton | #2 ROUND | o similar, utilizado para clasificar moscas anestesiadas |
| Malla de serigrafía (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | El tamaño de los poros utilizado en este protocolo fue de ~ 0,1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | conservante |
| Etanol (190 pruebas) | Pharmco | 111000190 | utilizado para disolver Tegosept |
| Botella de fondo cuadrado de 6 oz (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Agujas" para botellas de plástico para moscas | Genesee | 49-100 | |
| Viales de Drosophila, anchos (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Hojas para viales de plástico anchos | Genesee | 49-101 | |
| Harina de maíz desgerminada amarilla | Medalla de Oro Drosophila | ||
| agar LabScientific | FLY 8020 | ||
| Levadura de panadería - Harina Red Star | King Arthur | 1270 | |
| Azúcar granulada - Dominó |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
