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Bioengineering

में सूक्ष्म चैनलों द्वारा विशिष्ट केशिका क्रिया अस्थि-तरह टेम्पलेट्स बड़े बोनी दोष की बहाली के लिए कक्षों की भर्ती को बढ़ा सकते हैं

Published: September 11, 2015 doi: 10.3791/52947
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 5
1Oral and Maxillofacial Surgery, Columbia University, 2Endodontics, Columbia University, 3Mechanical Engineering, Kyung Hee University, South Korea, 4Orthodontics, The Ohio State University, 5Pathology, Weill Cornell Medical College

Abstract

अच्छी तरह से वितरित और स्थिरतापूर्वक डाला टेम्पलेट के लिए लंगर डाले है कि एक सक्रिय, संपन्न सेल की आबादी के बिना, असाधारण हड्डी उत्थान नहीं होती है। पारंपरिक टेम्पलेट्स के साथ, गहरे टेम्पलेट्स के अंदर सेल घुसपैठ, वितरण, और निवास के अभाव में आंतरिक सूक्ष्म चैनलों परिणामों के अभाव। इसलिए, सूक्ष्म चैनल के साथ एक बेहद असुरक्षित और समान रूप से परस्पर घरनदार की हड्डी की तरह टेम्पलेट (biogenic microenvironment टेम्पलेट, बीएमटी) इन बाधाओं को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया है। उपन्यास बीएमटी नवीन अवधारणाओं (केशिका क्रिया) द्वारा बनाई गई और एक स्पंज-टेम्पलेट कोटिंग तकनीक के साथ निर्मित किया गया था। आपस में जुड़े प्राथमिक-pores (300-400 माइक्रोन) पर घरनदार हड्डी में pores, प्रत्येक trabecula भीतर सूक्ष्म चैनल (25-70 माइक्रोन), और nanopores (100-400 एनएम) है कि नकल: बीएमटी कई संरचनात्मक घटक होते हैं कोशिकाओं लंगर के लिए अनुमति देने के लिए सतह। इसके अलावा, बीएमटी सिम के लिए यांत्रिक परीक्षण अध्ययन से प्रलेखित किया गया हैमानव घरनदार हड्डी (~ 3.8 एमपीए) 12 में से उन लोगों के लिए ilar यांत्रिक शक्ति गुण।

बीएमटी पुल के आकार का (Π) टेम्पलेट्स (3 सेमी ऊंचाई और 4 सेमी लंबाई) में उच्च अवशोषण, प्रतिधारण, और कोशिकाओं की बस्ती का प्रदर्शन किया। शुरू में थे कि कोशिकाओं तुरंत सेल मीडिया पर बीएमटी की केशिका क्रिया से दूसरे छोर (10 सेमी की दूरी) के लिए जुटाए टेम्पलेट्स के एक छोर में वरीयता प्राप्त। 4 घंटे के बाद, कोशिकाओं homogenously पूरे बीएमटी पर कब्जा कर लिया और सामान्य सेलुलर व्यवहार का प्रदर्शन किया। केशिका क्रिया मीडिया और बीएमटी भर में वितरण (सक्रिय माइग्रेशन) में निलंबित कोशिकाओं की घुसपैठ के लिए जिम्मेदार है। बीएमटी की इन क्षमताओं मनाया करने के बाद हम BMTs शारीरिक शर्तों के तहत परिधि से अस्थि मज्जा कोशिकाओं, वृद्धि कारक है, और पोषक तत्वों को अवशोषित करेंगे कि परियोजना।

बीएमटी तेजी से घुसपैठ, समरूप वितरण और inhabita के माध्यम से वर्तमान सीमाओं को हल कर सकते हैंबड़े, बड़ा टेम्पलेट्स में कोशिकाओं की nce भारी कंकाल दोष मरम्मत के लिए।

Protocol

टेम्पलेट के रूप में 1. Polyurethane (पु) स्पंज तैयारी

  1. परस्पर है pores युक्त हाइड्रॉक्सियापटाइट टेम्पलेट्स के उत्पादन के लिए पु स्पंज का प्रयोग करें। टेम्पलेट struts के गठन के साथ ही trabeculae भीतर सूक्ष्म चैनलों के गठन के लिए प्राथमिक trabeculae प्रदान करने के लिए प्रत्येक स्पंज का प्रयोग करें।
  2. कट और लंबाई चौड़ाई में एक्स 1.5 सेमी में एक्स 5 सेमी ऊंचाई में 3.5 सेमी के आयामों के साथ 2 पुल-आकार में (इंच प्रति pores) स्पंज 80 पीपीआई ट्रिम।
    नोट: आयाम और आकार चुना जा सकता है वांछित प्राथमिक छेद के आकार के अनुसार: 100 पीपीआई, 80 पल्स पोलियो टीकाकरण, और 60 पीपीआई।
  3. 4% की एक 100 मिलीलीटर बनाओ (w / v) एक 150 मिलीलीटर बीकर का उपयोग कर NaOH समाधान; उसके बाद विसर्जित कर दिया और तैयार स्पंज पूरी तरह से भिगो कर रहे हैं जब तक निचोड़।
  4. भिगोने के बाद, ultrasonicator (42 किलो हर्ट्ज) में स्पंज के साथ बीकर जगह है।
  5. Ultrasonically सतह के गुणों को संशोधित करने के लिए गर्मी के बिना 15-20 मिनट के लिए पु स्पंज पूर्व का इलाज।
  6. आसुत से कुल्ला5-10 मिनट के लिए पानी। Rinsing, वहीं स्पंज निचोड़ और उन्हें स्पंज अंदर अवशिष्ट NaOH हटाने के क्रम में 5 से 7 बार विस्तार करने की अनुमति देते हैं।
  7. अतिरिक्त पानी को निकालने के लिए कागज तौलिये के साथ स्पंज निचोड़; तो 60-80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में उन्हें सूखी।

कोटिंग के लिए 2. Hydroxyapatite (हेक्टेयर) घोल तैयार

  1. हा घोल बनाने से पहले, एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक बीकर के वजन को मापने। यह माप पाउडर / तरल अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. नैनो आकार हा पाउडर के 10 ग्राम उपाय।
  3. 50 मिलीलीटर बीकर में आसुत जल का 20 मिलीलीटर जोड़ें। 120-140 डिग्री सेल्सियस और हलचल एक गर्म थाली चुंबकीय उत्तेजक प्रयोग करने के लिए गर्मी।
  4. 300-400 rpm पर सरगर्मी जबकि आसुत जल में पाउडर प्रति polyvinyl शराब (PVA) (89,000-98,000 मेगावाट) की 0.3 ग्राम (डब्ल्यू डब्ल्यू / 3%) जोड़ें।
  5. PVA पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक हिलाओ। समाधान PVA का पूरा विघटन के बाद स्पष्ट हो जाना चाहिए।
  6. ओ मुड़ें400-500 rpm पर सरगर्मी जबकि एफएफ गर्मी और सोडियम carboxymethyl सेलूलोज़ (सीएमसी) पाउडर के लिए (अल्ट्रा कम चिपचिपापन) की 0.1 ग्राम (डब्ल्यू डब्ल्यू / 1%) जोड़ें। समाधान PVA का पूरा विघटन के बाद स्पष्ट हो जाना चाहिए।
  7. सीएमसी पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक हलचल और आरटी के लिए शांत हो जाओ।
  8. 300-400 rpm पर सरगर्मी जबकि पाउडर प्रति अमोनियम polyacrylate छितरे की 0.3 ग्राम (डब्ल्यू 3% / डब्ल्यू) जोड़ें। पूरी तरह से भंग कर दिया जब तक हिलाओ।
  9. 300-400 rpm पर सरगर्मी जबकि पाउडर प्रति ग्लिसरीन की 0.2 ग्राम (डब्ल्यू 2% / डब्ल्यू) जोड़ें। पूरी तरह से भंग कर दिया जब तक हिलाओ।
  10. धीरे धीरे 600-900 rpm पर सरगर्मी जबकि समाधान में हा पाउडर फैलाने और 5 मिनट के लिए चलाते रहें।
  11. हा पाउडर के किसी भी ढेर के फैलाव को सुनिश्चित करने के लिए एक ultrasonicator का उपयोग कर 5 मिनट के लिए sonicate।
  12. 90-100 डिग्री सेल्सियस पर 600-900 rpm और गर्मी में सरगर्मी जबकि मिश्रण में आसुत जल की एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  13. Ord में 90-100 डिग्री सेल्सियस पर 600-800 rpm पर एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर मिश्रण सरगर्मी रखेंएर पानी की सामग्री लुप्त हो जाना।
  14. 1.75-1.8 की एक पाउडर / तरल अनुपात प्राप्त किया जाता है जब तक समय-समय पर बीकर और मिश्रण सहित पूरे वजन को मापने।
  15. पाउडर / तरल अनुपात स्वरूपण, पाउडर, अभिकर्मकों, और पानी, शून्य से बीकर और उत्तेजक (2.1) का वजन, और शून्य से हा पाउडर सहित मिश्रण (2.14) के कुल वजन से पाउडर के वजन को विभाजित (2.2)।
    नोट: उदाहरण के लिए: एक (पाउडर, अभिकर्मकों, और पानी सहित पूरे मिश्रण) 49.05 छ है, तो बी (दोषी के साथ बीकर) 33.5 ग्राम है, और फिर सी (हा पाउडर) 10 ग्राम है।
    सी / (एबीसी) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80
  16. गारा कोटिंग के लिए उपयोग करने से पहले आर टी को शांत करने की अनुमति दें।

3. हा कोटिंग, सुखाने, और sintering

  1. कोट घोल तक एक स्टेनलेस रंग का उपयोग हा कोटिंग घोल के साथ तैयार पु स्पंज homogenously एक गिलास प्लेट पर पु स्पंज भर में वितरित किया जाता है।
    नोट: अतिरिक्त कलंक को हटाने के बादRY, pores के कुछ अभी भी है क्योंकि उच्च घोल चिपचिपापन के घोल के साथ भरा जा सकता है।
  2. थोड़ा, इंटरकनेक्टिविटी, एकरूपता, और खुले pores सुनिश्चित एक हवा कंप्रेसर का उपयोग कर हा लेपित टेम्पलेट्स उड़ाने के लिए आदेश में। यह प्रक्रिया टेम्पलेट्स ही ढंग से पु स्पंज के अंदर और बाहरी सतहों पर दोनों लेपित हैं कि सुनिश्चित करता है।
    नोट: एक सजातीय कोटिंग हासिल नहीं है, हा लेपित टेम्पलेट्स sintering प्रक्रिया के दौरान गिर जाएगा और कम यांत्रिक शक्ति के कारण निपटने जबकि भी दरार सकता है। इसके अतिरिक्त, सजातीय कोटिंग trabeculae भीतर सूक्ष्म चैनलों बनाने में महत्वपूर्ण है।
  3. कोमल हवा परिसंचरण के साथ ठंडा करने की शर्तों के तहत 5 घंटा (20-25 डिग्री सेल्सियस) की एक न्यूनतम के लिए हा लेपित टेम्पलेट्स सूखी। हालांकि, टेम्पलेट के आकार के आधार पर सुखाने के समय का विस्तार।
    नोट: सूखने के बाद, हा लेपित टेम्पलेट्स आम तौर पर हर आयाम में लगभग 8% से 10% हटना होगा।
  4. सुखाने की प्रक्रिया के बाद, हा जगहएक एल्यूमिना क्रूसिबल पर लेपित टेम्पलेट्स। फिर, एक उच्च तापमान भट्ठी में उन्हें जगह और निम्नलिखित 8 कदम sintering प्रोफ़ाइल का उपयोग करें।
    1. गर्मी 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 230 डिग्री सेल्सियस।
    2. हीट 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 280 डिग्री सेल्सियस।
    3. 400 डिग्री सेल्सियस तक 0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट हीट।
    4. हीट 3 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 600 डिग्री सेल्सियस। 1 घंटे के लिए 600 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    5. हीट 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट 1230 डिग्री सेल्सियस तक। 3 घंटे के लिए 1,230 डिग्री सेल्सियस रखें।
    6. आरटी के लिए कूल 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट।
      नोट: Sintering आगे लगभग 22% से हा लेपित स्पंज टेम्पलेट्स हटना होगा - प्रत्येक आयाम में 25%।

टेम्पलेट में कोशिकाओं के 4. प्रवेश और निवास

  1. 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक दवाओं (स्ट्रेप्टोमाइसिन और पेनिसिलिन) के साथ पूरक α सदस्य से मिलकर एक गैर osteogenic मीडिया में संस्कृति पूर्व osteoblastic MC3T3 कोशिकाओं, ।
  2. 10 मिलीलीटर जोड़ें6 अच्छी तरह से थाली के भीतर एक ही कुएं में 2 एक्स 10 6 सेल घनत्व में एक सेल निलंबन की।
  3. 6 अच्छी तरह से थाली में खड़ी 3 सेमी x 4 सेमी एक्स 1 सेमी पुल के आकार टेम्पलेट रखें। एक बगल खाली कुएं में सेल निलंबन युक्त थाली में टेम्पलेट, और दूसरे पैर का एक पैर रखें।
  4. टेम्पलेट 10 मिनट के लिए सेल निलंबन को अवशोषित करने की अनुमति दें।
  5. उसके बाद मूल रूप से सेल निलंबन के साथ भरा हुआ था कि अच्छी तरह से करने के लिए मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. 7 दिन बीत चुके हैं, जब तक हर 2 या 3 दिन दोनों कुओं में मध्यम भरपाई होगी।
  7. Hematoxylin और eosin धुंधला 11 से सेल गतिशीलता की प्रभावकारिता का निर्धारण करें।
    1. 20-30 मिनट के लिए 100% EtOH में डुबो कर कोशिकाओं और पाड़ को ठीक करें।
    2. 1-2 मिनट के लिए Hematoxylin साथ दाग।
    3. दो बार के लिए 1-2 मिनट के लिए आसुत पानी से कुल्ला।
    4. तो, 70% में विसर्जन से 95%, 1-2 मिनट प्रत्येक के लिए तो 100% EtOH के निर्जलीकरण।
    5. 20-30 सेकंड के लिए Eosin साथ दाग।
    6. दो बार के लिए 12 मिनट के लिए आसुत पानी से कुल्ला।
    7. 1-2 मिनट प्रत्येक के लिए, 70% में विसर्जन से 80%, 90%, और 100% EtOH के निर्जलीकरण।
    8. सेक्शनिंग और इमेजिंग के लिए एक ऐक्रेलिक राल में पाड़ शामिल करें।
  8. 3 [4,5-Dimethylthiazol-2-YL] -2,5-diphenyl tetrazolium ब्रोमाइड (MTT) सेल व्यवहार्यता परख और लाइव / मृत परख (लाइव / मृत सेल धुंधला किट MPTP) समय पर अंक के साथ सेल व्यवहार्यता का निर्धारण 3 दिन और 7 से 11 की।
    नोट: हड्डी की तरह टेम्पलेट निर्माण प्रोटोकॉल की योजना "प्रतिनिधि परिणाम" सत्र में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।

Representative Results

बीएमटी के समग्र संरचना घरनदार हड्डी की तरह आंतरिक संरचना के साथ एक अद्वितीय तीन आयामी टेम्पलेट दर्शाती है। बीएमटी स्थूल pores, सूक्ष्म चैनलों, और नैनो pores होता। साफ पूरी तरह से परस्पर मैक्रो-छिद्रों की विन्यास (320 माइक्रोन का औसत आकार), सूक्ष्म चैनल (50 माइक्रोन का औसत व्यास), और नैनो-pores (100 एनएम का औसत आकार) एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ सत्यापित किया गया (एवो-40; Zeiss) के साथ-साथ सूक्ष्म टोमोग्राफी के माध्यम से।

चित्रा 1 एक बीएमटी बनाने में चरणबद्ध विस्तृत प्रोटोकॉल पता चलता है। Sintering प्रक्रिया के लिए पु स्पंज (P1 - P7, चित्रा 1) की तैयारी से प्रोटोकॉल के सटीक नियंत्रण के माध्यम से, निम्न सुविधाओं को हासिल किया जा सकता है: एक बेहद घने और चिकनी सतह हा कोटिंग और सुखाने के बाद; एक ठीक से आकार और 3-डी टेम्पलेट आकार; घरनदार हड्डी के समान एक पूरी तरह से परस्पर झरझरा घरनदार नेटवर्क; और सूक्ष्म चैनलों बुद्धिहिन ऐसे Haversian नहरों और Volkmann की नहरों (आंकड़े 2 और 3) के रूप में इंट्रा-हड्डीवाला चैनलों की नकल है कि प्रत्येक trabecula। इसके अलावा, अपेक्षाकृत उच्च यांत्रिक शक्ति (~ 3.8 एमपीए) मानव घरनदार हड्डी के समान एक compressive शक्ति परीक्षण के द्वारा मापा गया था। घरनदार हड्डी कशेरुकाओं मानव काठ के उन लोगों के साथ काफी हद तक समान histomorphometric मापदंडों के सूक्ष्म सीटी विश्लेषण 12 से पुष्टि की गई। केशिका क्रिया के विभिन्न परिमाण कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन का उपयोग 4 चित्र में अलग केशिका व्यास के माध्यम से प्रदर्शन किया गया। इन सिमुलेशन के माध्यम से, हम बीएमटी प्राथमिक-pores (300-400 माइक्रोन) और व्यास के आधार पर सूक्ष्म चैनल (25-70 माइक्रोन) के भीतर अलग-अलग अवशोषण दरों कि होगा प्रदर्शन का अनुमान है। छोटे केशिकाओं मजबूत अवशोषण क्षमता का प्रदर्शन किया। चित्रा 5 में दिखाया गया है यह धारणा इस प्रयोग में सत्यापित किया गया था।

बीएमटी अत्यधिक प्रभावी प्रदर्शन कियासूक्ष्म चैनल संरचनाओं के केशिका क्रिया के माध्यम से तरल पदार्थ अवशोषण और प्रतिधारण; stevenel का नीला दाग आसानी से प्रवाह (चित्रा 5) को ट्रैक करने के द्रव माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कम्प्यूटेशनल अनुकरण के आधार पर, इन विन्यास के साथ बीएमटी अवशोषित और 10 सेकंड के भीतर कुल दूरी में 8.5 सेमी करने के लिए सेल निलंबन ऊपर बनाए रखने के लिए देखा गया। कारण आंतरिक संरचना से प्रेरित एक मजबूत केशिका कार्रवाई करने के लिए, दाग मध्यम एक 3 सेमी (ऊंचाई) के विपरीत छोर पर पहुंच 4 सेमी (लंबाई) 1 मिनट और 40 सेकंड के भीतर 1 सेमी (चौड़ाई) पुल के आकार टेम्पलेट एक्स। इसके अलावा, बीएमटी में सक्रिय सेल जुटाना और निगमन (चित्रा 6) मनाया गया। बाद में, समरूप सेल जुटाना और लगाव एक समान रूप से वितरित गठन में बढ़ाया प्रसार और मैट्रिक्स गठन में हुई। बीएमटी सेल निलंबन के साथ संतृप्त किया गया था के बाद इसके अलावा, बीएमटी के माध्यम से कोशिकाओं की लंबी दूरी (~ 10 सेमी) प्रवास तुरंत मान्य किया गया था। एसई eded कोशिकाओं हवा के संपर्क में है और संस्कृति के माध्यम में डूबे नहीं किया गया था कि टेम्पलेट सेगमेंट में बच गया। इस प्रयोग में, संस्कृति के माध्यम पाड़ के केवल पैर छू कुओं में विशेष रूप से कोशिकाओं के लिए प्रदान किया गया। microchannels के द्वारा प्रदर्शित केशिका क्रिया तो पाड़ के ऊपर, पुल हिस्से तक पहुंचने के लिए ताजा माध्यम के लिए अनुमति दी। संस्कृति के 3 दिन बाद, टेम्पलेट तेजी से फैल कोशिकाओं के साथ कब्जा कर लिया गया। संस्कृति के 7 दिनों के बाद, प्रत्येक trabecula अतिरिक्त सेलुलर मेट्रिसेस से लपेटा गया था और कोशिकाओं 13 के साथ एम्बेडेड।

चित्र 1
चित्रा 1. P7 अनुकूल यांत्रिक शक्ति को प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है के बाद सटीक sintering प्रोफ़ाइल रखते हुए अंतिम गर्मी उपचार (P7) को पु स्पंज (P1) के पूर्व उपचार से समग्र हड्डी की तरह टेम्पलेट निर्माण प्रोटोकॉल।।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
। चित्रा 2 प्रतिनिधि स्टीरियो माइक्रोस्कोप, एक 80 पल्स पोलियो टीकाकरण की (AmScope एसएम 2TZ-एम) छवियों (x4) पु स्पंज (बाएं), हा लेपित और बीएमटी (मध्य), और धातुमल बीएमटी (दाएं) सूखे आकार (आयाम: 3। लंबाई x चौड़ाई में 1 सेमी) में ऊंचाई x 4 सेमी में सेमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एक biogenic टेम्पलेट का चित्रा 3. SEM और सूक्ष्म सीटी छवियों: (ए) एक biogenic टेम्पलेट का एक समग्र छवि, रोंग> सूक्ष्म चैनलों के लिए (बी, सी, डी) चित्र। Trabeculae में स्पष्ट सूक्ष्म चैनलों को उजागर करने के लिए, टेम्पलेट दानेदार किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
। चित्रा अलग चैनल व्यास के साथ केशिका क्रिया 4. कम्प्यूटेशनल गणना एक ही समय अवधि (0.4 एमएस), सबसे बड़ा केशिका जबकि भीतर: 0.16 मिमी तक मध्यम (नीला) अवशोषित (घ = 300 माइक्रोन प्राथमिक ताकना करने के लिए संदर्भित करता है) ऊंचाई, छोटी केशिका: ऊंचाई में 0.415 मिमी तक मध्यम अवशोषित (घ = 30 माइक्रोन सूक्ष्म चैनल को संदर्भित करता है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

NT "के लिए: रख-together.within-पेज =" हमेशा "> चित्रा 5
470 माइक्रोन, 80 पीपीआई ≈ 320 माइक्रोन, 100 पीपीआई ≈ ≈ 60 पीपीआई: चित्रा 5. छवियाँ प्राथमिक-pores और सूक्ष्म चैनल (प्राथमिक ताकना आकार औसत व्यास को संदर्भित करता है के विभिन्न आकारों पर आधारित केशिका क्रिया के अवशोषण क्षमताओं का अंतर दिखाया ) 200 माइक्रोन। पीला लाइनों प्राथमिक-pores और सूक्ष्म चैनलों के संयोजन से प्रेरित केशिका क्रिया का प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल लाइनों प्रत्येक trabecula में प्रदर्शन मुख्य रूप से सूक्ष्म चैनलों से प्रेरित केशिका क्रिया का प्रतिनिधित्व करते हैं। (एफ) में दिखाया गया है, 100 पीपीआई टेम्पलेट 39 सेकंड के भीतर टेम्पलेट की पूरी संतृप्ति, जिसके परिणामस्वरूप में सबसे मजबूत केशिका क्रिया प्रेरित किया। 80 पीपीआई और 60 पीपीआई टेम्पलेट्स उसके बाद परीक्षण किया गया। (बी) 0 सेकंड, (सी) 0.5 सेकंड, (डी) 1.5 सेकंड, (ई) में 17.0 सेकंड, (एफ) 39.0 सेकंड, (जी) 50.0 सेकंड, और (एच) 1 मिनट के विसर्जन के बाद 18 सेकंड। (खाका आयाम: 1सेमी एक्स 1 सेमी x ऊँचाई cuboidal में 4 सेमी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 शुरू में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं गैरवरीय पैर के अंत में पहुँच वरीयता प्राप्त कुओं केशिका क्रिया से प्रेरित biogenic टेम्पलेट्स के माध्यम से गैर वरीय कुओं (भाग वी) से (भाग मैं)। से प्रवेश और कोशिकाओं के आव्रजन (भाग वी) के तुरंत बाद पूर्ण संतृप्ति। 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं के संगम पूरे टेम्पलेट भर में स्पष्ट किया गया था। 7 दिनों के बाद, spatiotemporal मैट्रिक्स कोलेजन गठन सेल आबादी (एच एंड ई दाग) के भीतर हुई। (खाका आयाम: लंबाई लंबाई चौड़ाई में एक्स 1 सेमी में x 4 सेमी में 3 सेमी)। सीएल करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ Ick।

Discussion

आदि कोशिकाओं, वृद्धि कारक है, पोषक तत्वों, सहित एक बहु घटक टेम्पलेट सफल हड्डी उत्थान और महत्वपूर्ण आकार बड़े अस्थि दोष के कार्यात्मक बहाली के लिए आवश्यक है। इन कारकों के भीतर, संरचनात्मक अनुरूप जैविक गुणों आवश्यक हैं। जैविक कार्यक्षमता को पूरा करने के लिए, टेम्पलेट biocompatibility, osteoconductivity, यांत्रिक अखंडता, पर्याप्त सतह क्षेत्र, पर्याप्त सतह बनावट, और ऑक्सीजन और पोषक तत्व परिवहन के लिए इसका मतलब प्रदर्शन करना चाहिए। मदद की पैठ टेम्पलेट में (सक्रिय भर्ती), टेम्पलेट (प्रतिधारण) भर में एक समान वितरण, त्वरित प्रसार और उच्च व्यवहार्यता (बस्ती): सेलुलर स्तर पर, निम्नलिखित विशेषताएं भारी अस्थि दोष के कार्यात्मक बहाली के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। अंत में, पर्याप्त अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स के बाद के गठन और जीन अभिव्यक्ति के ट्रिगर ऐसे तेजी vascularization एक के रूप में आवश्यक जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैंएन डी अस्थिजनन।

सिंथेटिक विकल्प के कई अलग अलग प्रकार के ऑटो / allo- हड्डी ग्राफ्ट को बदलने के लिए प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, मौजूदा पाड़ संगठन सूक्ष्म चैनलों और नैनो के pores युक्त एक आंतरिक microenvironment प्रदर्शन नहीं करता है, और इसलिए सक्रिय रूप से गहरी 10 मिमी से बड़े होते हैं कि सिंथेटिक के विकल्प में सेल घुसपैठ, वितरण, और निवास की सुविधा नहीं है। वे कुशलता से, तेजी से, और समान रूप से अस्थि टेम्पलेट में गहराई से विस्थापित करने के लिए कोशिकाओं अग्रणी के लिए शारीरिक संकेतों प्रदान नहीं करते हैं। इसके बजाय, कोशिकाओं की सीमित निष्क्रिय भर्ती पाड़ की बाहरी और भीतरी क्षेत्रों के बीच एक असमान वितरित सेल आबादी बनाता है। इस टेम्पलेट के भीतरी कोर तक पहुँचने कोशिकाओं की प्रारंभिक चुनौती exacerbates लेकिन यह भी सिंथेटिक विकल्प के दूसरे छोर के साथ पोषक तत्व प्रवाह और सेल संचार में अवरोध उत्पन्न होता ही नहीं। सेल डी में disproportional सेल भर्ती और डेरा परिणाम इस प्रकार कापाड़ के बाद Eath और अधूरा हड्डी विकास शरीर 14,15 में प्रत्यारोपित कर दिया गया है।

इस प्रकार, हम इन बाधाओं को संबोधित करने के लिए प्राथमिक शारीरिक क्यू के रूप में केशिका कार्रवाई की अवधारणा को पेश किया है। हम अच्छी तरह से सक्रिय रूप से बीएमटी में गहरी कोशिकाओं की भर्ती के लिए जिम्मेदारी से प्राथमिक खींच बल के लिए खाते में जाएगा कि केशिका क्रिया के लिए प्रेरित करने बीएमटी में सूक्ष्म चैनलों इंजीनियर है।

पु स्पंज कोटिंग तकनीक कई अद्वितीय गुण प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, यह खुद को पूर्व निर्धारित टेम्पलेट ढांचे पर निर्भर है, जो अच्छी तरह से नियंत्रित झरझरा घरनदार संरचनाओं का एक आसान तैयारी के लिए अनुमति देता है (यानी, 300-400 माइक्रोन के लिए इंच टेम्पलेट प्रति 80 ताकना)। इस अस्थिकोरक घुसपैठ 15 के लिए छेद के आकार के अनुकूलन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। दूसरा, तकनीक सेल स्थानांतरण 11 प्रारंभ कर की महत्वपूर्ण भूमिका के लिए खाते में जो परस्पर सूक्ष्म चैनलों के निर्माण में सक्षम बनाता है। कस्टम आकार और टेम्पलेट्स के आकार बनाने के मामले में पु स्पंज का उपयोग करते समय तीसरा, लगभग कोई सीमाएं हैं। निर्माता साधारण आकार या जटिल geometries के लिए भी गणना लेजर काटने के लिए एक कैंची का उपयोग कर सकते हैं। इन ठीक नियंत्रित प्रौद्योगिकियों का उपयोग करना, हम बीएमटी बनाया। हा, क्योंकि इसकी biocompatibility और osteoconductive क्षमता 17 से शुरू होने वाले माल के रूप में चयनित किया गया था।

इस अध्ययन में, पर प्रकाश डाला जा करने की जरूरत है कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। तापमान बहुत अधिक है और सरगर्मी गति बहुत कम है यदि हा घोल तैयार करने के दौरान, हा घोल बीकर के नीचे किनारों पर अटक हो जाते हैं और सूख जाएगा। अतिरिक्त हा घोल बाहर बह जब कोटिंग की प्रक्रिया के बाद, एक हवा के दबाव का भी उच्च बीएमटी की सतह पर दरारें पैदा कर सकते हैं। यह ठीक से अतिरिक्त हा घोल केवल बाहर हवा अपेक्षाकृत कम हवा के दबाव रखने के लिए महत्वपूर्ण है। Sintering प्रक्रिया के अंत में, दूसरे और तीसरे कदमसबसे महत्वपूर्ण (हीट 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट 280 डिग्री सेल्सियस और गर्मी 0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 400 डिग्री सेल्सियस तक) कर रहे हैं। हा घना हो जाता है, जबकि इस तापमान रेंज में, पु स्पंज पूरी तरह से बाहर जला देगा। इस प्रोटोकॉल बारीकी से पीछा नहीं कर रहा है, बीएमटी ढह या sintering के बाद टूटने लगे किया जाएगा।

इस अध्ययन में वर्णित बीएमटी कई लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले,-इंटर जुड़ा स्थूल pores (300-400 माइक्रोन) मानव घरनदार हड्डी के उन नकल और चिकनी अस्थि मज्जा प्रवाह के लिए अनुमति देता है। दूसरा, टेम्पलेट्स केशिका क्रिया के माध्यम से अस्थि कोशिकाओं की प्रारंभिक प्रवेश में तेजी लाने के लिए प्रत्येक घरनदार पट भीतर सूक्ष्म चैनल (25-50 माइक्रोन) के शामिल हैं। टेम्पलेट केवल 300 माइक्रोन pores (प्राथमिक pores) और कोई microchannels था, कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन 13 का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया, केशिका क्रिया अस्थि मज्जा के साथ टेम्पलेट का पूरा संतृप्ति के लिए अपर्याप्त होगा। यह विशेष रूप से एल की आवश्यकता होगी कि बड़े आकार के दोष के लिए सच का आयोजन होगाARGE आकार टेम्पलेट्स। माइक्रोमीटर आकार चैनलों प्रदर्शनी अत्यधिक प्रभावी तरल पदार्थ अवशोषण, और इस तरह हम सूक्ष्म चैनलों हमारे अध्ययन में केशिका कार्रवाई के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार होने की उम्मीद। तीसरा, हमारे BMTs रणनीतिक नैनो pores को रखा है। साहित्य से डेटा कोशिकाओं नैनो पैटर्न 18,19 करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हैं कि संकेत मिलता है; इसलिए, हम सेल लगाव बढ़ाने में एक भूमिका निभाने के लिए सूक्ष्म चैनलों की दीवारों पर नैनो के pores की उम्मीद है। घरनदार सेप्टा की सतह पर नैनो आकार pores (100-400 एनएम) लंगर के लिए कोशिकाओं स्थिर अनुमति। कुल मिलाकर, इन तीन आंतरिक संरचनाओं के संयुक्त प्रभाव टेम्पलेट भर बढ़ाया सेल जुटाना और आसंजन में हुई। हालांकि, प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं और सही बीएमटी निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। उदाहरण के लिए, कोटिंग, जबकि एक सजातीय चिपचिपापन रखने की कठिनाई के कारण तैयार हा घोल की एक बड़ी राशि वहाँ अक्सर है। इसके अलावा बनाने में एक सीमा हैकारण कोटिंग, जबकि समय काम करने के लिए खंड में 5 सेमी 3 से अधिक टेम्पलेट्स। कोटिंग मोटाई निर्माता तकनीक पर निर्भर करता है, जो महत्वपूर्ण है।

हमारे अध्ययन के निष्कर्ष बताते हैं कि अवशोषित और पारंपरिक alloplastic (या सिंथेटिक) मचानों से अधिक संभावित लाभ की पेशकश करेगा कोशिकाओं को बनाए रखने में सक्षम बीएमटी। एक भावी अध्ययन हड्डी से संबंधित विकास कारकों के साथ अस्थिजनन और / या एंजियोजिनेसिस पर बीएमटी के लाभों को सत्यापित करने के लिए विचार किया जा रहा है। इसलिए, हम अपने अद्वितीय विशेषताओं बीएमटी पाड़ बड़े दोष में सिंथेटिक निर्माणों और अधूरा हड्डी उत्थान में अपर्याप्त अस्थि मज्जा घुसपैठ की प्रमुख बाधाओं को संबोधित कर सकते हैं कि दावा करते हैं।

इस अध्ययन का अंतिम लक्ष्य समय / श्रम प्रधान अस्थि मज्जा स्ट्रोमा के लिए आवश्यकता को नष्ट करने से महत्वपूर्ण आकार बोनी दोष में हड्डी पुनर्निर्माण और कार्यात्मक बहाली में bioengineering के वर्तमान प्रतिमान को आसान बनाने के लिए हैएल कोशिकाओं अलगाव और विस्तार प्रक्रियाओं। अंत में, हम हड्डी के पुनर्निर्माण के लिए तेजी से सेल अवशोषण, समरूप वितरण, और निवास के लिए प्रेरित जो सूक्ष्म चैनलों और नैनो pores, के साथ 3 डी-निर्माणों अनुरूप संरचनात्मक रूप से उपयोग करने का लक्ष्य है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
polyurethan sponge Plastifoam PU-3215
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 167176
Hydroxyapatite Powder Ossgen
Polyvinyl Alcohol Sigma-Aldrich 341584
Carboxymethyl cellulose sodium salt Sigma-Aldrich 360384
ammonium polyacrylate Vanderbilt DARVAN 821A
Glycerin Sigma-Aldrich G2289

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 103 हड्डी की तरह टेम्पलेट केशिका क्रिया सूक्ष्म चैनल कोशिकाओं भर्ती तेजी से कोशिकाओं प्रवेश समान वितरण कोशिकाओं डेरा कोशिकाओं प्रतिधारण हड्डी पुनर्निर्माण महत्वपूर्ण बोनी दोष
में सूक्ष्म चैनलों द्वारा विशिष्ट केशिका क्रिया अस्थि-तरह टेम्पलेट्स बड़े बोनी दोष की बहाली के लिए कक्षों की भर्ती को बढ़ा सकते हैं
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Oh, D. S., Koch, A., Eisig, S., Kim, S. G., Kim, Y. H., Kim, D. G., Shim, J. H. Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect. J. Vis. Exp. (103), e52947, doi:10.3791/52947 (2015).

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