Exacta y fenol ADN Determinación del sexo libre del día 30 de los embriones de porcinos por PCR

El cerdo doméstico se ha convertido en un tema de investigación fundamental en el desarrollo, la genética y la nutrición en ambos sectores humana y el ganado. El potencial de los cerdos como modelos para la investigación biomédica humana se puede atribuir a sus similitudes fisiológicas. En la ganadería, la manipulación de la proporción de sexos puede aumentar la eficacia de selección y mejoramiento genético ^programas 1. El sexado de embriones individuales es una herramienta fundamental utilizada en muchas investigaciones experimentales, incluyendo pero no limitado a genotipo, la epigenética y X inactivación del dimorfismo sexual durante el desarrollo embrionario temprano ^2.

Los estudios en ratones sugieren que la dieta materna y otros factores pueden dar lugar a un desequilibrio de género ^3. En los cerdos, las causas de la proporción de sexos desequilibrio incluyen raza paterna ^{4, 5} capacidad uterina, y el estado metabólico de la cerda ^6. Dado que las diferencias observadas en los embriones y camadas pueden ser influenciados por SExual dimorfismo, los investigadores deben ser conscientes de embrión de sexo y relaciones sexuales antes de sacar conclusiones con respecto a su investigación. El desarrollo de herramientas y protocolos eficaces para el sexado de embriones de cerdo en el día 30 del desarrollo será discutido aquí.

Varios métodos de asignación del sexo se han desarrollado para los estudios genéticos en organismos modelo y el ganado. Sobre todo en la ganadería, la identificación de los embriones tempranos masculinos y femeninos es una práctica muy común para mejorar la selección genética para programas de mejoramiento. Los primeros embriones de cerdo en el cariotipo utilizando Giemsa ^{7 o} la intensa fluorescencia ^8,9 técnicas se han utilizado para la asignación del sexo. Sin embargo, estos métodos son mucho tiempo y no es adecuado para el cribado de un gran número de embriones con rapidez y precisión.

El método de tipificación sexo más eficaz es la amplificación de ADN usando un calor de la polimerasa de ADN estable y un par de cebadores. sexado de ADN por el método de PCR es más específica, rápida y sensible, orequiriendo ólo una mínima cantidad de materiales celulares. La primera determinación del sexo del embrión basados ​​en la PCR se realizó en los seres humanos ^10, y más tarde en los ratones ^11, ganado, búfalos ^{12 13} y ovejas ¹⁴ embriones antes de la implantación. En el cerdo, se estableció el método de tipificación de ADN sexo más temprana para los embriones antes de la implantación a través de un único par de cebadores de ADN específico del cromosoma Y ^15. Sin embargo, se seleccionaron los cebadores de PCR más comunes para la determinación del sexo del cromosoma Y del gen SRY específica ^macho 16 y la región discriminativo no sexual de un gen dedo de zinc ubicada en ambos X e Y ^cromosoma 17. Posteriormente, estos cebadores se han aplicado para determinar el sexo de los embriones del día 30 en este estudio con una mayor especificidad de los cebadores para detectar sólo el cromosoma X de un gen zinc-finger.

El ADN genómico a partir de embriones antes de la implantación de la especie porcina se puede extraer mediante la exposición de un blastocisto intacta para amortiguar con proteinase K ¹⁶ o tomando una biopsia de unas pocas células de la escisión temprana individuo embriones de ^{15 años y utilizarlos} para la PCR directa. Sin embargo, la liberación de ADN a partir de sangre porcina, cabello, tejidos o una gran conceptus en unos pocos centímetros de tamaño no se hace efectiva utilizando el método de la proteinasa K. Métodos de extracción de ADN para estos materiales se han establecido utilizando ya sea el tiempo que consumen los protocolos de fenol / cloroformo ⁶ o kits ¹⁸ basados ​​caro columna. Con el fin de evitar el uso de productos químicos potencialmente tóxicos, hay una tendencia a desarrollar métodos de extracción de ADN de bajo costo, fácil y sin fenol. Este tipo de protocolo para el aislamiento de ADN genómico PCR calidad de ratón ¹⁹ y de pez cebra ²⁰ tejidos se ha establecido el uso de hidróxido de sodio caliente y Tris (HotSHOT). Este estudio proporciona un protocolo para la obtención de ADN con pares de cebadores dúplex modificados y rediseñados para HotSHOT sexo PCR escribiendo directamente a partir de lisados ​​de células de embriones porcinos día 30 conalta precisión.

De acuerdo con el Consejo Canadiense para el manejo de estos animales y con la aprobación de la Política Animal de la Facultad y el Comité de Bienestar - Ganadería de la Universidad de Alberta, las cerdas gestantes fueron sacrificados por personal capacitado aproximadamente a día se recogieron 30 del embarazo y embriones. Utilice guantes de examen en todo momento durante los procedimientos.

1. Recogida y almacenamiento de la muestra

1. La eutanasia cerda usando un perno cautivo seguido por desangramiento. Usar guantes para recoger los aparatos reproductores y embriones de cada cerda sacrificados.
   Nota: recogida rápida de muestras y embriones de transferencia a hielo seco o nitrógeno líquido se traducirá en los tejidos de mayor calidad para otros trabajos moleculares como los microarrays y qPCR.
2. Diseccionar el útero y separar con cuidado todos los embriones dentro de sus membranas placentarias extraembryonic de la pared uterina subyacente ^21. Asegúrese de que no hay contaminación tejido materno.
3. Relongitud del cable y el peso de todos los embriones viables antes de la congelación.
4. Recoger cada embrión individual y de inmediato se envuelve en una hoja de aluminio a presión antes de la congelación con nitrógeno líquido.
5. La transferencia de los embriones congelados de nitrógeno líquido directamente en un congelador a -80ºC.

2. Los embriones de molienda

1. Etiquetar todos los tubos de muestra (15 ml) con el ID de muestra necesaria para el número de muestras a analizar.
2. Llene el recipiente térmico con hielo seco a la mitad e insertar el tubo de muestras de pre-marcado en el hielo seco.
3. Use guantes de invierno con otro par de guantes de examen en la parte superior para la transferencia de los morteros y manos de pre-enfriado de -80 ° C congelador para secar el depósito de hielo.
4. Coloque el embrión congelado en el interior del mortero en el hielo seco.
5. Verter nitrógeno líquido adecuado para cubrir el embrión y se muele con la mano del mortero en un polvo fino.
6. Transferir el polvo embrión a un tubo de muestra pre-marcado con un microspatula (Figura 1) y colocar el tubo en un congelador a -80 °.
7. Use un mortero previamente enfriado limpia y mano de mortero para cada embrión y cambiar los guantes de examen después de moler cada embrión para evitar la contaminación cruzada entre las muestras.

3. Preparación de ADN genómico utilizando Modificado de sodio Método Hidróxido

1. Etiqueta de todos los tubos de microcentrífuga (1,5 ml) necesarios para el número de muestras a analizar.
2. La transferencia de los tubos de muestra que contienen polvo embrión a partir de la -80 ° C congelador a un recipiente con hielo seco antes de comenzar.
3. Pipetear 180 l de NaOH 50 mM (hidróxido de sodio) en cada tubo de microcentrífuga de pre-marcado.
4. Encienda una incubadora y de precalentamiento a 95 ° C.
5. Utilice un palillo de dientes para transferir la cantidad correcta de polvo de embriones (alrededor de 5 a 10 mg) (Figura 2) del tubo de muestra en un tubo de microcentrífuga de pre-marcado que contiene la solución de NaOH 50 mM.
6. tire up el mismo palillo de dientes lentamente para visualizar el lisado ADN como una pegajosa, pegajosa, sustancia blanca transparente similar (Figura 3).
7. La transferencia de los tubos de microcentrífuga con lisado de ADN a la incubadora pre-calentado a 95 ° C durante cinco minutos. transferir inmediatamente el tubo a una caja de espuma de poliestireno lleno de hielo.
8. Añadir 20 l de 1 M Tris-HCl directamente en el tubo de centrífuga y se mezcla golpeando suavemente el tubo. Use un papel de pH para asegurarse de que el pH es de aproximadamente 8,0 (Figura 4) antes de la centrifugación.
   Nota: Cuando se trata de un gran número de preparaciones de muestra, es aceptable para recoger al azar algunas muestras para comprobar el pH.
9. Centrifugar el tubo con el lisado de ADN en 2000 xg en una microcentrífuga durante dos minutos a temperatura ambiente para eliminar los residuos de tejido sin disolver.
10. Transferencia de 150 l del sobrenadante transparente de acabado en un nuevo tubo o placas de 96 pocillos.
    Nota: El lisado ADN claro está lista para usarse como una plantilla en PCreacción R y es estable a 4 ° C durante dos semanas, o puede ser mantenido a -20 ° C durante un año.

Los cebadores de PCR 4. Diseño Sexo-específicas

1. Obtener los números de acceso para la región determinante del sexo porcino Y (SRY) (NM_214452.3) y los genes y las proteínas ligadas al cromosoma X con dedos de zinc (ZFX) (XM_005673501.1) de la página web NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. Copiar y pegar estos números de acceso NCBI a una herramienta de diseño de la cartilla en línea.
   Nota: La mejor información cebadores incluyendo la longitud, Tm y GC%, así como el tamaño del producto de PCR (pb), se genera en la pantalla del ordenador (Figura 5).
3. Validar la especificidad de estos cebadores utilizando el programa explosiva de nucleótidos (Blastn) en contra de la actual base de datos genómica porcina 104 para asegurar que estas secuencias sólo se encuentran en X y el cromosoma Y de SRY y ZFX respectivamente (Figura 6).

5. Genomic DNA PCR directamente a partir de ADN lisados

1. Utilizarsólo 1 l de lisado de ADN como una plantilla para una 15 l de reacción de PCR.
   Nota: Un método de cribado de alto rendimiento para placas de 96 pocillos PCR se puede realizar en forma similar utilizando una pipeta multicanal.
2. No la siguiente sólo para la primera PCR: preparar un tubo de PCR para el control negativo sin molde y dos tubos adicionales para controles positivos mediante la adición de 1 l (0,5 ng) de ADN genómico porcino sexo conocido obtenido comercialmente. Más tarde, incluir una muestra de la última análisis sexado éxito como un control positivo y para correr junto con la nueva reacción de PCR para la determinación del sexo.
3. Utilizar cualquier enzima de PCR Ready Mix HotStart y preparar una mezcla maestra mediante la adición de cebadores y agua libre de nucleasa en función del número total de las reacciones de PCR. Añadir 1 l de lisado de ADN en un tubo de PCR pre-existente con 14 l de la mezcla maestra de PCR. Añadir cebadores de tal manera que la concentración final de los cebadores a partir de dos genes específicos del sexo es de 0,3 M en total de 15 l PCR reaction.
4. Configurar el siguiente programa de PCR en un termociclador: 95 ° C durante 3 min, 35 ciclos cada uno con un paso 20 seg de fusión 98 ° C, seguido de una etapa de recocido 15 seg a 65 ° C, seguido de una etapa de elongación 15 sec a 72 ° C. En una etapa final, se incuban las reacciones durante 1 min a 72 ° C y continuar incubar a 4 ° C hasta la retirada del tubo de PCR para la verificación de la electroforesis en gel para determinar el sexo.
   Nota: Las condiciones de PCR y optimización están de acuerdo con el manual del kit de PCR se menciona en la Tabla de Materiales.
5. Añadir la cantidad apropiada de invernadero SYBR fluorescente mancha de gel de ADN no tóxico cuando se prepara un gel de agarosa TBE 2%.
   Nota: El bromuro de etidio puede ser sustituido por tinción fluorescente verde-si no está disponible.
6. Añadir 1,5 l de la colorante de carga (10x) en el tubo de PCR y mezclar bien pipeteando el tampón de reacción PCR de arriba a abajo.
7. Carga de 10 l de la muestra en el pocillo y rONU del gel de agarosa con valores de voltaje adecuados (aparato de gel pequeño a 100 V, el aparato de gel de 96 pocillos a 150 V hasta que la banda de tinte se ejecuta medio camino a través del gel).
8. Observar y ajustar las intensidades de las bandas con la configuración de la luz fluorescente usando un escáner láser y capturar una imagen del gel. Nota: imager gel común puede ser sustituido por el gel con bromuro de etidio.
9. Determinar el sexo de los embriones de cerdo mediante la identificación de los embriones con una banda como una hembra y dos bandas como un macho (Figura 7).

Un resultado representativo de la determinación del sexo de 345 DNA lisados ​​de cribado por PCR se muestra en la Figura 7 y se resume en la Tabla 1.

Como puede verse en la figura 7, la temperatura de cebadores de recocido a 65 ° C es la condición óptima en este protocolo de PCR generando intensidad similar y tamaños de amplificación hendidas (Figura 5) entre las diferentes muestras.

Dos productos amplificados de SRY (400 pb) y ZFX (506 pb) se muestran en la imagen de gel (Figura 7). embriones masculinos mostraron dos fragmentos de ADN con el tamaño correcto de la parte superior (400 pb) y (506 pb) bandas inferiores. La intensidad de estas dos bandas se demostró que era igual en los individuos más masculinos. Todos los embriones de hembra solamente mostraron un único fragmento de ADN correspondiente al gen ZFX situado en elX-cromosoma.

lisados ​​de ADN obtenidos a partir de la NaOH 50 mM modificada se pueden usar directamente para la PCR con una alta tasa de éxito y la precisión. lisados ​​de ADN no mostraron ninguna inhibición de reacción de PCR después de cribado 345 embriones. Sólo tres personas no fueron sexados y el porcentaje de embriones femeninos fue ligeramente mayor que en los hombres (Tabla 1).

Figura 1:. Embryo Transfer Powder Transferencia de polvo embrión a un tubo de 15 ml.

Figura 2: Recolección y Transferencia de Embriones en polvo con un palillo de dientes (A) Una cantidad excesiva de embriones polvo adherido al palillo.. (B) la cantidad correcta depolvo embrión se adhiere a la palillo de dientes para ser transferido a la solución de reactivo de lisis alcalina. (C) Una cantidad insuficiente de polvo de embrión se adhiere a la palillo de dientes.

Figura 3:. Visualización ADN Técnica Lentamente tire hacia arriba el palillo de dientes, después de añadir el polvo de embrión, para determinar si el ADN de embriones se ha disuelto como pegajoso pegajoso blanco sustancia transparente similar.

Figura 4:. PH de confirmación (A) pH de la solución de hidróxido de sodio (reactivo de lisis alcalina) es 12,0. (B) Después de tampón de neutralización adición al tampón de lisis, indicación de color de papel pH es verde y el pH debería ser alrededor de 8,0.

Figura 6: Asignación de cebadores específicos al sexo porcino en el cromosoma X e Y. (A) Localización del avance y cebadores inversos especificados en el gen ZFX. (B) Localización del avance y reversa cebadores especificados en el gen SRY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7:. La amplificación por PCR de genes específicos por sexo porcino desde el día 30 embriones 2% en gel de agarosa TBE teñidas con tinción de gel de ADN SYBR con los controles positivos conocidos se indican con símbolos masculinos y femeninos. Dos bandas indicadas como machos y una sola banda como hembras. Estrella roja indica la posible contaminación de la muestra en el pocillo con la aparición de una banda muy débil inferior (400 pb) en comparación con la banda superior (506 pb) producto de la PCR causada por SRY cebadores Y-específicos. La flecha roja indica la plantilla sin control negativo de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Porcentaje de Mujer, Hombre y desconocido después de la PCR Sexing entre 345 Día 30 embriones.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.