La combinación de doble fluorescencia In Situ La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Las células gliales, que son las células más abundantes en el sistema nervioso central (CNS), comprenden los oligodendrocitos (las células mielinizantes de CNS), oligodendrocitos precursores (PO, también conocidos como "células NG2"), astrocitos y microglia. Existe un creciente interés en las funciones de las células gliales y sus posibles funciones en enfermedades neurológicas ^1. Por ejemplo, la enfermedad de Canavan (CD) es una enfermedad neurodegenerativa hereditaria a partir de principios en la infancia con leucodistrofia espongiforme y una pérdida progresiva de las neuronas, lo que lleva a la muerte por lo general antes de los 10 años de edad ^2,3. Las mutaciones en el gen Aspartoacyclase (ASPA), que conducen a reducir drásticamente la actividad ASPA ⁴ en CD han sido identificados. ASPA es una enzima que cataliza la desacetilación de la N-acetil aspartato (NAA), una molécula altamente concentrado en el cerebro, acetato de generar y aspartato ^5-7. Muchos pacientes con EC presentan mayores niveles de NAA, debido a la falta de ASPA actividad. Algunos estudios especulan que el acetato derivado de NAA podría ser una fuente importante de ácidos grasos / lípidos en el cerebro durante el desarrollo y CD puede resultar de la disminución de la síntesis de mielina durante el desarrollo causada por el fracaso de NAA ser desglosado ^3,5,6.

ASPA se encuentra predominantemente en el riñón, el hígado y la materia blanca del cerebro, y dado el importante papel de ASPA en CD, la expresión celular de esta enzima en el cerebro ha sido estudiada por varios laboratorios. Al mirar a la actividad enzimática ASPA en el cerebro, los estudios anteriores encontraron que el aumento de la actividad ASPA durante el desarrollo del cerebro es paralela a la evolución temporal de la mielinización ^8-10. A nivel celular, los ensayos para la actividad enzimática, así como hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica (IHC) análisis sugieren que ASPA se expresa principalmente en oligodendrocitos en el cerebro pero no en las neuronas o astrocitos ^11-16. Algunos estudios encontraron que éstos también ASPAexpresarse en microglia en el SNC ^12,14. Hasta ahora los datos sobre la expresión de ASPA en OPs son limitadas. Según un estudio reciente en el que transcriptomes de diferentes tipos de células en la corteza cerebral de ratón incluyendo neuronas, astrocitos, PO, oligodendrocitos recién formados, los oligodendrocitos mielinizantes, microglia, células endoteliales, y los pericitos se analizaron mediante secuenciación de RNA ^17, ASPA se expresa exclusivamente en oligodendrocitos , en particular en myelinating oligodendrocitos (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). A pesar de estos estudios sobre el patrón de expresión de ASPA en el cerebro, una serie de incertidumbres permanecen.

Las diferentes técnicas se pueden utilizar para estudiar los patrones de expresión de genes. IHC es un método comúnmente utilizado para detectar el producto funcional (es decir, proteína) de un gen de expresión en secciones de tejido. A pesar de su gran utilidad, esta técnica tiene limitaciones en cuanto a su aplicación y especificidad están sujetas to la disponibilidad y la especificidad del anticuerpo sea necesario. En comparación, la ISH tiene la ventaja de ser capaz de revelar la expresión de cualquier gen en el nivel de mRNA. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil de utilizar varias sondas al mismo tiempo con el fin de localizar una expresión de genes a determinados tipos de células. En este artículo, se describe un protocolo que combina ARN de doble fluorescencia de hibridación in situ con fluorescencia immunolabelling de una proteína. Hemos utilizado este conjunto de técnicas para examinar el patrón de expresión de Aspa en cerebro de ratón. Este método permite el estudio preciso de la expresión génica utilizando microscopía confocal.

Declaración de Ética:
Ratón cría y manejo están en conformidad con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y las directrices del comité de ética de la UCL, el cumplimiento de la Ley de 1986 del Reino Unido y su Reglamento Enmienda 2012 Animales (Procedimientos Científicos).

NOTA: Todas las soluciones deben realizarse con pirocarbonato de dietilo (DEPC) - tratado con agua para destruir cualquier RNasa residual. Para el tratamiento DEPC, añadir DEPC (1 ml por litro), agitar vigorosamente hasta que todos los glóbulos DEPC han desaparecido continuación en autoclave para degradar la DEPC.

1. ARN sonda Síntesis

1. PRECAUCIÓN: Al manipular formamida, llevar equipo de protección personal (EPP) y el uso de una cabina de seguridad. Preparar tampón de hibridación: tratada con DEPC agua desionizada con 50% (v / v) de formamida desionizada, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH ₂ PO _4, 5 mM Na ₂ HPO _4, 0,01 mg / ml tRNA de levadura, 1 x de Denhardt solutien, y 10% w / v de sulfato de dextrano.
2. Elija un clon de ADN que contiene la secuencia de ADNc del gen de interés en un plásmido con promotores de ARN polimerasa. Para este ejemplo, utilice un clon pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), con promotores T7 y polimerasa de ARN SP6 para Aspa (Figura 1).
3. Preparar ADN de plásmido linealizado como molde.
   1. Crecer el clon de ADN, extraer el plásmido con un kit de purificación de plásmido a pequeña escala de acuerdo con el protocolo del fabricante y la secuencia con la T7 y cebadores universales SP6.
   2. Se digiere el plásmido de ADN 1020 g con una enzima de restricción que corta en el extremo 5 'de la hebra codificante del ADNc. Para este ejemplo, utilice 100 unidad de Sal I para digerir el plásmido pCMV-SPORT6- Aspa. Incubar durante 1,5 horas a 37 ^° C.
   3. Ejecutar una pequeña alícuota en un gel de agarosa para comprobar que el plásmido se linealizó completamente.
4. Se purifica elplásmido linealizado utilizando fenol-cloroformo.
   1. Añadir 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M, un volumen de 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - fenol equilibrado y un volumen de cloroformo / alcohol isoamílico (IAA) (24: 1).
   2. Centrifugar a 16.000 xg durante 1 min a TA (20 - 25 ° C, RT) y se extrae la fase acuosa superior.
   3. Añadir un volumen de cloroformo / IAA, centrifugar a 16.000 xg durante 1 min y se extrae la fase acuosa superior.
   4. Repita el paso 1.4.3.
   5. Añadir 2 volúmenes de etanol y dejar a -20 ^° C durante 1 hora u O / N.
   6. Centrifugar a 16.000 xga 4 ° C durante 10 min. Descartar el sobrenadante.
   7. Lavar el precipitado con etanol al 70% frío y resuspender en aproximativamente 1 g de ADNc por 2,5 l de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
5. Sintetizar las dos sondas, uno marcado con digoxigenina (DIG) y la otra con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
   1. Seleccione la ARN polimerasa apropiada para hacer que el anti-SEsonda NSE (complementario al ARNm diana). Para este ejemplo, el uso de T7 ARN polimerasa para hacer sonda Aspa.
   2. Preparar reacción de transcripción in vitro: añadir al menos 1 g de ADN linealizado, 4,0 l 5 tampón de transcripción x, 6,0 l de DTT 100 mM, 2,0 l de dNTPs que contienen 10 veces más DIG o FITC ARN mezcla de marcaje, 1 l inhibidor de RNasa, y 20 - 40 unidades de la ARN polimerasa; hacer que el volumen final hasta 20 l con agua tratada con DEPC.
   3. Se incuba a 37 ^° C durante 1,5 horas.
6. l run1 de la reacción de transcripción en un gel de agarosa al 1,0% para comprobar que la reacción ha funcionado. El gel debe mostrar la plantilla lineal y una banda brillante de la sonda.
7. Completar el volumen hasta 100 l con tampón de hibridación y almacenar 10 ml de alícuotas a -80 ° C.

2. Perfusión, Fijación y Recogida de tejido

1. PRECAUCIÓN: Al manipular paraformaldehído (PFA), tanto sólidos comoacuosa, usar el PPE y el uso de una cabina de seguridad. Preparar la solución de formaldehído por disolución de 4% de solución de PFA en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (v w /) usando calor (55 ° C). Se filtra la solución de formaldehído con papel de filtro.
2. Preparar la solución de sacarosa disolviendo 20% (w / v) de sacarosa en agua destilada y añadir 0,1% (v / v) de solución de DEPC. Deja O / N a temperatura ambiente con una tapa suelta y luego autoclave.
3. Terminal anestesiar un ratón mediante inyección intra-peritoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Evaluar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie y la ausencia de reflejo de retirada indica anestesia profunda.
4. Una vez que el ratón está bajo anestesia profunda, hacer una incisión debajo de la caja torácica y cortar a través de la caja torácica en ambos lados, levántela para exponer el corazón.
5. Inserte una aguja 25-G en el ventrículo izquierdo del corazón. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón.
6. Perfundir el animal con 20 ml de PBS y luego una solución de formaldehído 40 ml. Para P30 y mayoresratones, utilice una velocidad de perfusión de 12 ml / min, pero para los animales más jóvenes utilizan una tasa más baja (7-10 ml / min).
7. Diseccionar el cerebro.
   1. Cortar la cabeza del ratón con tijeras quirúrgicas, haciendo un corte posterior de las orejas. Hacer una incisión en la línea media en la piel caudal y rostral trabajar para eliminar la piel de cráneo.
   2. A partir de la parte caudal, cortar a través de la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media y entre los ojos con unas tijeras iris. Retire el parietal y placas óseas frontales por la inclinación de un lado de una placa de hueso cada vez y encajándola con pinzas.
   3. inclinar suavemente el cerebro hacia arriba desde la parte anterior con pinzas y cortar los nervios ópticos y otros nervios craneales. Levante con cuidado el cerebro fuera del cráneo.
8. Coloque el cerebro en una matriz coronal del cerebro del ratón. Cortar el cerebro en aproximadamente 4 piezas 3 mm con una cuchilla de afeitar de plumas.
9. Transferir las rebanadas en solución PFA 4% e incubar O / N a 4 ° C.
10. transferencia cerebrorebanadas de tratada con DEPC 20% de solución de sacarosa y se incuban O / N a 4 ° C
11. Coloque cada corte de cerebro en un cryomould seca, rodear con la temperatura óptima de corte (OCT) medio y la congelación en hielo seco. Almacenar a -80 ° C.

3. cryosectioning

1. Cortar 15 micras secciones de tejido congelado en un criostato y recoger las secciones en portaobjetos de microscopio. Si es necesario, humedecer las secciones con PBS tratada con DEPC y se aplanan con un pincel fino.
2. Deja las diapositivas secar durante aproximadamente 1 hr para asegurar que el tejido se adhiere a la diapositiva.

4. La hibridación

1. Preparar 65 ° C tampón de lavado: NaCl 150 mM, 15 mM Na ₃ C ₃ H ₅ O (COO) ₃ (= 1x solución salina de citrato de sodio), 50% (v / v) de formamida y 0,1% (v / v) de Tween- 20.
2. Preparar tampón MABT: mM ácido maleico 100, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5.
3. Diluir las dos sondas (DIG-etiquetados y FITC-Labelled) 1 / 1.000 en tampón de hibridación precalentado a 65 ° C y mezclar bien.
4. Aplicar alrededor de 300 l de mezcla de hibridación en cada diapositiva, coverslipwith (C 200 ^o) cubreobjetos al horno y se incuba O / N a 65 ° C en una cámara húmeda.
5. Transferir los portaobjetos en una jarra Coplin que contiene tampón de lavado pre-calentado. Se lavan los portas durante 30 minutos dos veces a 65 ° C con tampón de lavado.
6. Se lavan los portas durante 10 minutos tres veces con MABT a TA.

5. La visualización de la sonda FITC

1. Preparar tampón de bloqueo ISH: MABT con 2% de reactivo de bloqueo y suero de oveja inactivado por calor 10%.
2. Opcional: utilizar una pluma hidrófobo para dibujar círculos alrededor de las secciones de tejido en la diapositiva para reducir el volumen de soluciones de anticuerpos requeridos.
3. Incubar los portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente con ISH tampón de bloqueo en una cámara húmeda.
4. Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una peroxidasa de rábano picante (POD) - conjugadod anticuerpo anti-FITC diluido 1/500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo.
5. Colocar los portaobjetos en un tarro Coplin que contenía PBS con 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBST y reemplazar con PBST fresco cada vez.
6. Inmediatamente antes de su uso, preparar la tiramida fluorescente mediante la dilución de 100 veces en el diluyente de amplificación. Para este ejemplo, utilizar FITC-tiramida.
7. Agregue esto a los portaobjetos y dejar actuar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Colocar los portaobjetos en una jarra Coplin y lavar 3 veces en PBST durante 10 minutos.

6. La visualización de la sonda DIG

1. Preparar 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
2. Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo ISH durante 1 hora a RT.
3. Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una fosfatasa alcalina (AP) conjugado con anticuerpo anti-DIG diluido 1 / 1.500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo.
4. Lavar con MABT durante 10 minutos tres veces.
5. Lavar dos veces con 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 durante 5 min a RT.
6. Inmediatamente antes de su uso, preparar la solución Fast Red por disolución de las tabletas en Tris 0,1 M pH 8,2. Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 M.
7. Incubar los portaobjetos a 37 ° C con una solución de Fast Red en una cámara húmeda. A medida que el tiempo para el desarrollo óptimo varía, compruebe las diapositivas regularmente con un microscopio de fluorescencia para monitorizar la formación de precipitado. Para este ejemplo, detener la reacción después de 2 - 3 hr.
8. Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces.

7. La inmunohistoquímica

1. Preparar el tampón de bloqueo IHC: 10% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) en PBST.
2. Incubar los portaobjetos con IHC tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
3. Preparar el anticuerpo primario: diluir el anticuerpo primario a una dilución apropiada en PBST con 5% de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario). Para este ejemplo, utilizar un anticuerpo de conejo anti-Olig2 a 1/400 (v / v) de dilución.
4. Incubar en la solución de anticuerpo primario a 4 ° CO / N.
5. Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces.
6. Preparar el anticuerpo secundario: diluir un anticuerpo secundario fluoróforo conjugado a una dilución apropiada en PBST con 5% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) y 0,1% (v / v) de Hoechst 33258. Para este ejemplo , utilizar un burro anti-conejo Alexa647 anticuerpo secundario a 1 / 1.000 (v / v) de dilución.
7. Incubar en la solución de anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hr.
8. Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces.

8. montaje

1. Parcialmente secar los portaobjetos a TA, y montar con un medio de montaje de fluorescencia. Deja las diapositivas secar y luego la imagen en un microscopio confocal bajo 10X, 20X y 63X objetivos utilizando 4 canales diferentes con las siguientes longitudes de onda de excitación: 570 nm para Fast Red, 488 nm para FITC, 647 nm para Olig2 immunolabelling y 350 nm para Hoechst .

Este artículo describe un método para un ISH doble fluorescencia seguido de inmunomarcaje en las secciones de cerebro de ratón. Una breve descripción de este protocolo se muestra en la Figura 1. El primer paso fue sintetizar sondas específicas para Aspa y MBP (proteína básica de mielina). Para comprobar que las sondas se han sintetizado, una pequeña alícuota de cada reacción se realizó en un gel de agarosa. La plantilla lineal débil y una gran cantidad de la sonda de ARN se pueden ver (Figura 2). ISH de fluorescencia doble para Aspa y MBP, seguido de Olig2 immunolabelling y Hoechst tinción nuclear, se realizó en secciones de cerebro de ratón. Se realizaron búsquedas en las secciones de cerebro en un microscopio confocal y se cosen las imágenes para revelar la distribución de señales de expresión genética en el cerebro. Aspa expresión de la PAM -positivo se observó células (MBP +) a lo largo del sujetador en la (Figura 3). También examinó la expresión de Aspa en diferentes estructuras cerebrales que utilizan un mayor aumento. Expresión Aspa en oligodendrocitos en la corteza y el cuerpo calloso se muestra en la Figura 4. La co-localización de Mbp, Olig2, y Aspa indica que Aspa se expresa en un subconjunto de oligodendrocitos maduros en la corteza y el cuerpo calloso (Figura 4). estos resultados demuestran que este protocolo se puede detectar simultáneamente la expresión de tres genes diferentes en secciones del cerebro.

Figura 1. Protocolo para la Doble Hibridación Fluorescente In Situ Seguido por inmunotinción. Este protocolo se ejecuta sobre 5 días y detecta la expresión de tres genes./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. El examen de Aspa ARN sonda en gel de agarosa. La plantilla lineal y una gran cantidad de la sonda de ARN de un peso molecular inferior se puede observar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Doble hibridación in situ fluorescente para Aspa y MBP en las secciones de cerebro de ratón. Aspa (rojo) y MBP (verde) en el cerebro. Barra de escala:. 500 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Expresión de Aspa en oligodendrocitos en la corteza y el cuerpo calloso. Paneles muestran imágenes representativas de ISH para Aspa (rojo) y MBP (verde), seguido de la inmunotinción de Olig2 (azul) en combinación con Hoechst tinción. Aspa se expresó en algunos Mbp + / + Olig2 células de la corteza (a y B) y en el cuerpo calloso (C y D). M pb + / + Olig2 / Aspa + células se indican con flechas y MBP + / + Olig2 / Aspa - células se indican con cabezas de flecha en los paneles agrandadas (B y D). Barras de escala: 100 micras (A y C); 20 m (B y D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Que complementa la figura 1. Secuencia y mapa de Aspa Clone (IRAVp968C0654D). 1,5 kb de secuencia de cDNA de Aspa fue insertado en pCMV-SPORT6 plásmido (A). El mapa de pCMV-SPORT6-Aspa plásmido se muestra en (B).m / archivos / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.