La combinación de doble fluorescencia In Situ La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Resumen

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

Resumen

La detección de la expresión de genes en diferentes tipos de células cerebrales, por ejemplo, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, precursores de oligodendrocitos y microglia, puede verse obstaculizada por la falta de anticuerpos primarios o secundarios específicos para la inmunotinción. Aquí se describe un protocolo para detectar la expresión de tres genes diferentes en la misma sección cerebral mediante doble fluorescencia de hibridación in situ con dos sondas de genes específicos, seguido de inmunotinción con un anticuerpo de alta especificidad dirigido contra la proteína codificada por un tercer gen. El gen Aspartoacyclase (ASPA), las mutaciones de que puede conducir a una enfermedad de la materia blanca humana rara - enfermedad de Canavan - se cree que está expresado en oligodendrocitos y microglia, pero no en astrocitos y neuronas. Sin embargo, aún no se ha establecido el patrón de expresión precisa de ASPA en el cerebro. Este protocolo nos ha permitido determinar que ASPA se expresa en un subconjunto de los oligodendrocitos maduros unand en general se puede aplicar a una amplia gama de estudios de patrones de expresión génica.

Introducción

Las células gliales, que son las células más abundantes en el sistema nervioso central (CNS), comprenden los oligodendrocitos (las células mielinizantes de CNS), oligodendrocitos precursores (PO, también conocidos como "células NG2"), astrocitos y microglia. Existe un creciente interés en las funciones de las células gliales y sus posibles funciones en enfermedades neurológicas ^1. Por ejemplo, la enfermedad de Canavan (CD) es una enfermedad neurodegenerativa hereditaria a partir de principios en la infancia con leucodistrofia espongiforme y una pérdida progresiva de las neuronas, lo que lleva a la muerte por lo general antes de los 10 años de edad ^2,3. Las mutaciones en el gen Aspartoacyclase (ASPA), que conducen a reducir drásticamente la actividad ASPA ⁴ en CD han sido identificados. ASPA es una enzima que cataliza la desacetilación de la N-acetil aspartato (NAA), una molécula altamente concentrado en el cerebro, acetato de generar y aspartato ^5-7. Muchos pacientes con EC presentan mayores niveles de NAA, debido a la falta de ASPA actividad. Algunos estudios especulan que el acetato derivado de NAA podría ser una fuente importante de ácidos grasos / lípidos en el cerebro durante el desarrollo y CD puede resultar de la disminución de la síntesis de mielina durante el desarrollo causada por el fracaso de NAA ser desglosado ^3,5,6.

ASPA se encuentra predominantemente en el riñón, el hígado y la materia blanca del cerebro, y dado el importante papel de ASPA en CD, la expresión celular de esta enzima en el cerebro ha sido estudiada por varios laboratorios. Al mirar a la actividad enzimática ASPA en el cerebro, los estudios anteriores encontraron que el aumento de la actividad ASPA durante el desarrollo del cerebro es paralela a la evolución temporal de la mielinización ^8-10. A nivel celular, los ensayos para la actividad enzimática, así como hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica (IHC) análisis sugieren que ASPA se expresa principalmente en oligodendrocitos en el cerebro pero no en las neuronas o astrocitos ^11-16. Algunos estudios encontraron que éstos también ASPAexpresarse en microglia en el SNC ^12,14. Hasta ahora los datos sobre la expresión de ASPA en OPs son limitadas. Según un estudio reciente en el que transcriptomes de diferentes tipos de células en la corteza cerebral de ratón incluyendo neuronas, astrocitos, PO, oligodendrocitos recién formados, los oligodendrocitos mielinizantes, microglia, células endoteliales, y los pericitos se analizaron mediante secuenciación de RNA ^17, ASPA se expresa exclusivamente en oligodendrocitos , en particular en myelinating oligodendrocitos (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). A pesar de estos estudios sobre el patrón de expresión de ASPA en el cerebro, una serie de incertidumbres permanecen.

Las diferentes técnicas se pueden utilizar para estudiar los patrones de expresión de genes. IHC es un método comúnmente utilizado para detectar el producto funcional (es decir, proteína) de un gen de expresión en secciones de tejido. A pesar de su gran utilidad, esta técnica tiene limitaciones en cuanto a su aplicación y especificidad están sujetas to la disponibilidad y la especificidad del anticuerpo sea necesario. En comparación, la ISH tiene la ventaja de ser capaz de revelar la expresión de cualquier gen en el nivel de mRNA. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil de utilizar varias sondas al mismo tiempo con el fin de localizar una expresión de genes a determinados tipos de células. En este artículo, se describe un protocolo que combina ARN de doble fluorescencia de hibridación in situ con fluorescencia immunolabelling de una proteína. Hemos utilizado este conjunto de técnicas para examinar el patrón de expresión de Aspa en cerebro de ratón. Este método permite el estudio preciso de la expresión génica utilizando microscopía confocal.

Protocolo

Declaración de Ética:
Ratón cría y manejo están en conformidad con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y las directrices del comité de ética de la UCL, el cumplimiento de la Ley de 1986 del Reino Unido y su Reglamento Enmienda 2012 Animales (Procedimientos Científicos).

NOTA: Todas las soluciones deben realizarse con pirocarbonato de dietilo (DEPC) - tratado con agua para destruir cualquier RNasa residual. Para el tratamiento DEPC, añadir DEPC (1 ml por litro), agitar vigorosamente hasta que todos los glóbulos DEPC han desaparecido continuación en autoclave para degradar la DEPC.

1. ARN sonda Síntesis

1. PRECAUCIÓN: Al manipular formamida, llevar equipo de protección personal (EPP) y el uso de una cabina de seguridad. Preparar tampón de hibridación: tratada con DEPC agua desionizada con 50% (v / v) de formamida desionizada, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH ₂ PO _4, 5 mM Na ₂ HPO _4, 0,01 mg / ml tRNA de levadura, 1 x de Denhardt solutien, y 10% w / v de sulfato de dextrano.
2. Elija un clon de ADN que contiene la secuencia de ADNc del gen de interés en un plásmido con promotores de ARN polimerasa. Para este ejemplo, utilice un clon pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), con promotores T7 y polimerasa de ARN SP6 para Aspa (Figura 1).
3. Preparar ADN de plásmido linealizado como molde.
   1. Crecer el clon de ADN, extraer el plásmido con un kit de purificación de plásmido a pequeña escala de acuerdo con el protocolo del fabricante y la secuencia con la T7 y cebadores universales SP6.
   2. Se digiere el plásmido de ADN 1020 g con una enzima de restricción que corta en el extremo 5 'de la hebra codificante del ADNc. Para este ejemplo, utilice 100 unidad de Sal I para digerir el plásmido pCMV-SPORT6- Aspa. Incubar durante 1,5 horas a 37 ^° C.
   3. Ejecutar una pequeña alícuota en un gel de agarosa para comprobar que el plásmido se linealizó completamente.
4. Se purifica elplásmido linealizado utilizando fenol-cloroformo.
   1. Añadir 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M, un volumen de 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - fenol equilibrado y un volumen de cloroformo / alcohol isoamílico (IAA) (24: 1).
   2. Centrifugar a 16.000 xg durante 1 min a TA (20 - 25 ° C, RT) y se extrae la fase acuosa superior.
   3. Añadir un volumen de cloroformo / IAA, centrifugar a 16.000 xg durante 1 min y se extrae la fase acuosa superior.
   4. Repita el paso 1.4.3.
   5. Añadir 2 volúmenes de etanol y dejar a -20 ^° C durante 1 hora u O / N.
   6. Centrifugar a 16.000 xga 4 ° C durante 10 min. Descartar el sobrenadante.
   7. Lavar el precipitado con etanol al 70% frío y resuspender en aproximativamente 1 g de ADNc por 2,5 l de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
5. Sintetizar las dos sondas, uno marcado con digoxigenina (DIG) y la otra con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
   1. Seleccione la ARN polimerasa apropiada para hacer que el anti-SEsonda NSE (complementario al ARNm diana). Para este ejemplo, el uso de T7 ARN polimerasa para hacer sonda Aspa.
   2. Preparar reacción de transcripción in vitro: añadir al menos 1 g de ADN linealizado, 4,0 l 5 tampón de transcripción x, 6,0 l de DTT 100 mM, 2,0 l de dNTPs que contienen 10 veces más DIG o FITC ARN mezcla de marcaje, 1 l inhibidor de RNasa, y 20 - 40 unidades de la ARN polimerasa; hacer que el volumen final hasta 20 l con agua tratada con DEPC.
   3. Se incuba a 37 ^° C durante 1,5 horas.
6. l run1 de la reacción de transcripción en un gel de agarosa al 1,0% para comprobar que la reacción ha funcionado. El gel debe mostrar la plantilla lineal y una banda brillante de la sonda.
7. Completar el volumen hasta 100 l con tampón de hibridación y almacenar 10 ml de alícuotas a -80 ° C.

2. Perfusión, Fijación y Recogida de tejido

1. PRECAUCIÓN: Al manipular paraformaldehído (PFA), tanto sólidos comoacuosa, usar el PPE y el uso de una cabina de seguridad. Preparar la solución de formaldehído por disolución de 4% de solución de PFA en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (v w /) usando calor (55 ° C). Se filtra la solución de formaldehído con papel de filtro.
2. Preparar la solución de sacarosa disolviendo 20% (w / v) de sacarosa en agua destilada y añadir 0,1% (v / v) de solución de DEPC. Deja O / N a temperatura ambiente con una tapa suelta y luego autoclave.
3. Terminal anestesiar un ratón mediante inyección intra-peritoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Evaluar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie y la ausencia de reflejo de retirada indica anestesia profunda.
4. Una vez que el ratón está bajo anestesia profunda, hacer una incisión debajo de la caja torácica y cortar a través de la caja torácica en ambos lados, levántela para exponer el corazón.
5. Inserte una aguja 25-G en el ventrículo izquierdo del corazón. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón.
6. Perfundir el animal con 20 ml de PBS y luego una solución de formaldehído 40 ml. Para P30 y mayoresratones, utilice una velocidad de perfusión de 12 ml / min, pero para los animales más jóvenes utilizan una tasa más baja (7-10 ml / min).
7. Diseccionar el cerebro.
   1. Cortar la cabeza del ratón con tijeras quirúrgicas, haciendo un corte posterior de las orejas. Hacer una incisión en la línea media en la piel caudal y rostral trabajar para eliminar la piel de cráneo.
   2. A partir de la parte caudal, cortar a través de la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media y entre los ojos con unas tijeras iris. Retire el parietal y placas óseas frontales por la inclinación de un lado de una placa de hueso cada vez y encajándola con pinzas.
   3. inclinar suavemente el cerebro hacia arriba desde la parte anterior con pinzas y cortar los nervios ópticos y otros nervios craneales. Levante con cuidado el cerebro fuera del cráneo.
8. Coloque el cerebro en una matriz coronal del cerebro del ratón. Cortar el cerebro en aproximadamente 4 piezas 3 mm con una cuchilla de afeitar de plumas.
9. Transferir las rebanadas en solución PFA 4% e incubar O / N a 4 ° C.
10. transferencia cerebrorebanadas de tratada con DEPC 20% de solución de sacarosa y se incuban O / N a 4 ° C
11. Coloque cada corte de cerebro en un cryomould seca, rodear con la temperatura óptima de corte (OCT) medio y la congelación en hielo seco. Almacenar a -80 ° C.

3. cryosectioning

1. Cortar 15 micras secciones de tejido congelado en un criostato y recoger las secciones en portaobjetos de microscopio. Si es necesario, humedecer las secciones con PBS tratada con DEPC y se aplanan con un pincel fino.
2. Deja las diapositivas secar durante aproximadamente 1 hr para asegurar que el tejido se adhiere a la diapositiva.

4. La hibridación

1. Preparar 65 ° C tampón de lavado: NaCl 150 mM, 15 mM Na ₃ C ₃ H ₅ O (COO) ₃ (= 1x solución salina de citrato de sodio), 50% (v / v) de formamida y 0,1% (v / v) de Tween- 20.
2. Preparar tampón MABT: mM ácido maleico 100, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5.
3. Diluir las dos sondas (DIG-etiquetados y FITC-Labelled) 1 / 1.000 en tampón de hibridación precalentado a 65 ° C y mezclar bien.
4. Aplicar alrededor de 300 l de mezcla de hibridación en cada diapositiva, coverslipwith (C 200 ^o) cubreobjetos al horno y se incuba O / N a 65 ° C en una cámara húmeda.
5. Transferir los portaobjetos en una jarra Coplin que contiene tampón de lavado pre-calentado. Se lavan los portas durante 30 minutos dos veces a 65 ° C con tampón de lavado.
6. Se lavan los portas durante 10 minutos tres veces con MABT a TA.

5. La visualización de la sonda FITC

1. Preparar tampón de bloqueo ISH: MABT con 2% de reactivo de bloqueo y suero de oveja inactivado por calor 10%.
2. Opcional: utilizar una pluma hidrófobo para dibujar círculos alrededor de las secciones de tejido en la diapositiva para reducir el volumen de soluciones de anticuerpos requeridos.
3. Incubar los portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente con ISH tampón de bloqueo en una cámara húmeda.
4. Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una peroxidasa de rábano picante (POD) - conjugadod anticuerpo anti-FITC diluido 1/500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo.
5. Colocar los portaobjetos en un tarro Coplin que contenía PBS con 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBST y reemplazar con PBST fresco cada vez.
6. Inmediatamente antes de su uso, preparar la tiramida fluorescente mediante la dilución de 100 veces en el diluyente de amplificación. Para este ejemplo, utilizar FITC-tiramida.
7. Agregue esto a los portaobjetos y dejar actuar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Colocar los portaobjetos en una jarra Coplin y lavar 3 veces en PBST durante 10 minutos.

6. La visualización de la sonda DIG

1. Preparar 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
2. Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo ISH durante 1 hora a RT.
3. Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una fosfatasa alcalina (AP) conjugado con anticuerpo anti-DIG diluido 1 / 1.500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo.
4. Lavar con MABT durante 10 minutos tres veces.
5. Lavar dos veces con 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 durante 5 min a RT.
6. Inmediatamente antes de su uso, preparar la solución Fast Red por disolución de las tabletas en Tris 0,1 M pH 8,2. Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 M.
7. Incubar los portaobjetos a 37 ° C con una solución de Fast Red en una cámara húmeda. A medida que el tiempo para el desarrollo óptimo varía, compruebe las diapositivas regularmente con un microscopio de fluorescencia para monitorizar la formación de precipitado. Para este ejemplo, detener la reacción después de 2 - 3 hr.
8. Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces.

7. La inmunohistoquímica

1. Preparar el tampón de bloqueo IHC: 10% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) en PBST.
2. Incubar los portaobjetos con IHC tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
3. Preparar el anticuerpo primario: diluir el anticuerpo primario a una dilución apropiada en PBST con 5% de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario). Para este ejemplo, utilizar un anticuerpo de conejo anti-Olig2 a 1/400 (v / v) de dilución.
4. Incubar en la solución de anticuerpo primario a 4 ° CO / N.
5. Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces.
6. Preparar el anticuerpo secundario: diluir un anticuerpo secundario fluoróforo conjugado a una dilución apropiada en PBST con 5% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) y 0,1% (v / v) de Hoechst 33258. Para este ejemplo , utilizar un burro anti-conejo Alexa647 anticuerpo secundario a 1 / 1.000 (v / v) de dilución.
7. Incubar en la solución de anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hr.
8. Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces.

8. montaje

1. Parcialmente secar los portaobjetos a TA, y montar con un medio de montaje de fluorescencia. Deja las diapositivas secar y luego la imagen en un microscopio confocal bajo 10X, 20X y 63X objetivos utilizando 4 canales diferentes con las siguientes longitudes de onda de excitación: 570 nm para Fast Red, 488 nm para FITC, 647 nm para Olig2 immunolabelling y 350 nm para Hoechst .

Resultados

Este artículo describe un método para un ISH doble fluorescencia seguido de inmunomarcaje en las secciones de cerebro de ratón. Una breve descripción de este protocolo se muestra en la Figura 1. El primer paso fue sintetizar sondas específicas para Aspa y MBP (proteína básica de mielina). Para comprobar que las sondas se han sintetizado, una pequeña alícuota de cada reacción se realizó en un gel de agarosa. La plantilla lineal débil y una gran cantidad ...

Discusión

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para un ARN de doble hibridación in situ seguido de inmunotinción. Hemos utilizado este protocolo para confirmar que Aspa se expresa en oligodendrocitos maduros en varias áreas del cerebro.

Este procedimiento de múltiples etapas tiene muchos peligros potenciales que pueden afectar a la sensibilidad y debe ser evitado. En primer lugar, todas las soluciones y tampones de almacenamiento para la reacción de transcripción n...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Formamida desionizada	Sigma	F9037	para tampón de bloqueo de ISH
Cloruro de sodio	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Ácido clorhídrico	VWR International	20252.290
Fosfato de sodio monobásico anhidro	Sigma	S8282
Fosfato de sodio dibásico dihidratado	Sigma	30435
ARNt de levadura	Roche	10109495001
50x Solución de Denhardt	Technologies	750018
Sulfato de dextrano	Sigma	D8906
Aspa clon de ADNc	Fuente: Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Acetato de sodio	Sigma	S2889
Fenol equilibrado	Sigma	P4557
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432
Alcohol isoamílico	Aldrich	496200
Etanol	VWR International	20821.321
T7 ARN polimerasa	Promega	P4074
Tampón de transcripción	Promega	P118B
100 mM TDT	Promega	P117B
UTP-DIG Mezcla NTP Roche		11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehído	Sigma	P6148
Papel de filtro	Fisher científico	005479470
sacarosa	Sigma	59378
Pirocarbonato de dietilo	Sigma	D5758
Pentobarbitona	Animalcare Ltd	BN43054
tijeras de disección	World Precision Instruments	15922
aguja de calibre 25	Terumo	300600
Bomba peristáltica	Cole-Parmer Instrument Co., Ltd	WZ-07522-30
Tijeras de iris	Weiss	103227
No.2 pinzas	World Precision Instruments	500230
Matriz cerebral coronal	World Precision Instruments	RBMS-200C
Hoja de afeitar Personna	Medical	PERS60-0138
OCT	medio Tissue tek	4583
Portaobjetos de criostato/micrótomo	Bright
Superfrost plus	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Citrato de sodio	Sigma	S4641	para 65 ° C tampón de lavado
Formamida	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Cubreobjetos	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Reactivo de bloqueo	Roche	11096176001
Suero de oveja inactivado por calor	Sigma	S2263
Pluma hidrofóbica	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-anticuerpo conjugado Roche		11426346910
TSA™ Plus Sistema de fluoresceína	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP conjugado	Roche	11093274910
Fast tabletas rojas	Roche	11496549001.22
µ Filtro M	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Cuerpo de hormiga de conejo	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugado α-anticuerpo de conejo	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimida H 33258	sigma	B2883
Medio de montaje	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscopio	Leica