Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, 360 millones de personas en todo el mundo sufren de pérdida auditiva con profundas consecuencias en la vida profesional y privada. Los audífonos pueden restaurar la función sensorial en formas moderadas de pérdida auditiva; sin embargo, para los casos más graves, la opción de tratamiento más eficaz es un dispositivo protésico llamado implante coclear (IC). Los IC contienen una guía de electrodos lineal de hasta 24 electrodos, que se inserta quirúrgicamente en la rampa timpánica de la cóclea. Los electrodos estimulan directamente las neuronas ganglionares espirales, formando el nervio auditivo ¹.

Con más de 300.000 dispositivos implantados en todo el mundo, los IC son implantes médicos muy exitosos y se encuentran entre los procedimientos más rentables jamás reportados. A pesar de su éxito, el implante coclear todavía tiene limitaciones, como la reducción de la resolución de frecuencia en comparación con la audición fisiológica. Esto puede conducir a déficits en la comunicación efectiva en grupos o entornos ruidosos, y en la capacidad de descifrar sonidos muy complejos como la música. Esta resolución de frecuencia reducida se debe probablemente a la brecha entre los electrodos de CI y las neuronas ganglionares espirales, lo que lleva a la estimulación de grandes grupos de neuronas. Esta brecha está en el rango de cientos de micrómetros ^2,3. La eliminación de esta brecha facilitaría la estimulación de grupos más pequeños de neuronas por electrodo, aumentando así la resolución de frecuencia y el rendimiento general del dispositivo.

Para estudiar la influencia del espacio entre el electrodo y la neurona y el efecto de varios protocolos de estimulación optimizados, hemos desarrollado un bioensayo in vitro basado en una caracterización electrofisiológica no invasiva de SGNs en matrices de electrodos múltiples (MEAs) ⁵. Además, los MEA se pueden modificar fácilmente para variar la forma, el tamaño, el material y la rugosidad de la superficie del electrodo, para optimizar la interfaz neurona-electrodo. A continuación se presenta un protocolo paso a paso para obtener de forma reproducible grabaciones de cultivos de neuronas ganglionares espirales murinos y evaluar la dependencia de los parámetros mencionados anteriormente.

cuidado de los animales y la experimentación se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de las autoridades locales suizos (Amt für Landwirtschaft und Natur del Cantón de Berna, Suiza).

1. Preparar las soluciones para los Experimentos

1. Preparar la solución de revestimiento de matriz extracelular (ECM) (véase la Tabla de Materiales, punto 6): Mezcla de deshielo ECM en hielo. Se diluye la mezcla ECM 1:10 en medio de cultivo básico (sin factores neurotróficos o de suero bovino fetal (FBS)) y almacenar en hielo.
2. Preparar el medio de cultivo (véase la Tabla de Materiales, punto 1): Preparar una reserva de medio Neurobasal no contiene FBS o factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Suplemento medios neurobasal con FBS fresco (10%) y BDNF (5 ng / ml) justo antes de la adición al cultivo celular.
3. Preparar la solución extracelular (véase la Tabla de Materiales, punto 2).

2. Lavado y esterilización de los AMA

(Figura 1E). Cada electrodo tiene un tamaño de 40 x 40 m ² con una separación de 200 micras de centro a centro. Los electrodos están hechos de platino. Los electrodos están conectados a los contactos correspondientes por un circuito de óxido de indio y estaño. Este circuito está aislada por una capa de 5 micras de SU-8. Ver tabla de materiales para obtener información sobre el proveedor. Otros diseños de MEA pueden ser adecuados para estos experimentos.

1. Para los nuevos AMMA: Enjuague por inmersión en etanol al 70% durante 30 segundos y se lava con agua destilada durante 30 segundos. Trabajar en una campana de flujo laminar.
2. Dejar que el MEA seca durante 30 min en una campana de flujo laminar.
3. Ponga cada MEA en una placa de Petri estériles individuales (35 mm x 10 mm) y selle con papel de aluminio. Los MEA se pueden almacenar hasta su uso.
4. Para los AMA usadas: Incubar los AMA en una placa de Petri (35 mm x 10 mm) que contiene 1 ml de solut enzimáticaión (ver Tabla de Materiales, punto 6) O / N en un agitador orbital a temperatura ambiente para eliminar el material biológico. Después continúe como en el paso 2.1.
   NOTA: Manejar los AMUMA con cuidado con unas pinzas con puntas de goma cubierta.

3. Preparación de los AMA para los experimentos de cultivo

1. Retire la hoja de cierre hermético y dejar el MEA en la placa de Petri (35 mm x 10 mm) para todo el experimento.
2. Escudo de los AMUMA con la solución preparada en 1.1: Utilice una punta de pipeta de l fría 200 (almacenado a -20 ° C) para pipetear 50 l de solución de revestimiento a cada MEA, que cubre toda el área del electrodo.
3. Permitir a los AMA capa de 30 minutos a 1 hora a temperatura ambiente.
4. Eliminar la solución de recubrimiento con una pipeta. Aplicar 100 l de medio de cultivo suplementado con 10% de FBS y 5 ng / ml de BDNF y se deja a temperatura ambiente hasta que el tejido del chapado.
5. Coloque 2 placas de Petri que contienen los AMA recubiertas en una gran placa de Petri (94 mm x 16 mm) y añadir una tercera pequeña placa de Petri que contiene 1,5ml de Tampón fosfato salino (PBS) para la humidificación.
   NOTA: La adición de una pequeña placa de Petri (paso 3.5) que contenía PBS es crucial para minimizar significativamente la evaporación del medio de cultivo.

4. La disección del ganglio espiral

NOTA: la disección bruto se puede hacer fuera de la campana de flujo laminar (Paso 4.1 a 4.4). Para condiciones estériles fina disección (campana de flujo laminar) son obligatorios (del paso 4.5).

1. La eutanasia de los animales (ratones de 5-7 días) por decapitación sin anestesia previa.
2. Esterilizar la cabeza por pulverización con 70% de etanol.
3. Con la celebración de la cabeza, cortar la conexión entre la piel y el cráneo con una tijera afilada / afilado a lo largo de la línea sagital.
4. Corte sagital del cráneo y retire el cerebro usando unas tijeras afiladas / romos.
5. Cortar los huesos temporales del cráneo y colocar los de una placa de Petri que contiene solución salina equilibrada de hielo estéril frío de Hanks (HBSS).
6. Usando una disecciónmicroscopio ción, diseccionar la bulla timpánica usando unas pinzas finas y aislar el oído interno.
7. Retirar el hueso de la cóclea, utilizando unas pinzas finas.
8. Retire el ligamento espiral y la estría vascular (SV) junto sujetando con pinzas la porción basal del ganglio espiral (SG) y el SV y desenrollar lentamente el SV de la base -to-ápice
9. Aislar el órgano de Corti (OC), la SG y el modiolus (Figura 1A - C)
10. Separar el CO de la SG y modiolo sujetando con pinzas la parte basal de la SG y el CO y desenrollar lentamente el OC desde la base-a-ápice.
11. Explantes laterales cortados (200 a 500 micras de diámetro) del ganglio espiral todavía unido a la modiolo (Figura 1D) utilizando unas pinzas y un bisturí micro.

5. Espiral Cultura Ganglio explante en los AMA

1. Coloque dos explantes del ganglio espiral próximos a los electrodos en el MEA preparada previamente con 100 l de medio de cultivo.
2. Coloque el órgano de Corti de aproximadamente 5 mm de distancia de la zona de electrodo.
3. El uso de fórceps para fijar los explantes y el órgano de Corti en el MEA y evitar dañar el tejido.
4. Coloque los AMUMA con cuidado en la incubadora y la cultura a 37 ° C y 5% de _CO2. Al día siguiente, inspeccionan visualmente que los explantes han unido a la MEA.
   NOTA: Si no se adjunta explantes S / N, ellos rara vez lo hacen en los próximos días. El CO se coloca adyacente a la cultura de soporte trófico / neurotrófico.
5. Añadir 100 l de medio de cultivo que contiene 10% de FBS y BDNF al día durante 5 días consecutivos.
6. En el día 6 añadir 2 ml de medio de cultivo que contiene 10% de SFB y 5 ng / ml de BDNF y la cultura del tejido durante otros 13 días.

6. Registros electrofisiológicos para investigar la actividad espontánea y dependiente electrodo de estimulación

1. Lavar la cultura MEA con extracelular por lolución preparado en la etapa 1.3, a temperatura ambiente.
2. Seque los contactos con un pañuelo de papel y montar la MEA en la configuración de MEA.
   NOTA: Para mantener la cultura húmedo durante el montaje, añadir una pequeña gota de la solución extracelular a la cultura.
3. Añadir 300 l de solución extracelular y esperar 10 min antes de la grabación, para permitir que el sistema se estabilice.
4. Registro de actividad espontánea durante 2 min de todos los electrodos pulsando sobre el botón de grabación del software / adquirir e identificar electrodos de registro.
5. Estimulación del electrodo MEA: Seleccione la amplitud / duración / forma del estímulo en el software adecuado y se aplican a varios electrodos de forma consecutiva como se ha descrito ^13. Seleccionar los electrodos en base a los que muestran actividad espontánea (como en el paso 6.4). Registro de todos los electrodos restantes.
6. Para excluir artefacto de estimulación, estimular desde el mismo electrodo 10 veces. Si el cultivo responde al menos 8 de cada 10 veces, se puede asumir como unarespuesta positiva a la estimulación inducida por el electrodo.
7. Para identificar el ruido de fondo, aplicar tetrodotoxina (TTX) a la cultureat una concentración de 1 mM, para bloquear los canales de sodio dependientes de voltaje y grabar durante 2 min. Utilice esta opción para realizar la detección de pico (7.1 y 7.2).

7. Los datos de análisis

NOTA: El análisis de datos se ha descrito anteriormente en detalle en ⁶ y ^5. Para obtener información específica sobre el software utilizado en este estudio ver Tabla de Materiales, punto 7.

1. Usando el software apropiado detectar actividad espontánea para cada electrodo empleando un detector basado en las desviaciones estándar y un posterior discriminador. Este procedimiento se describe en ^6. Actividad aparece transitorios de tensión tan rápido (<5 ms).
2. Elija un umbral que da lugar a ninguna actividad en el análisis de la TTX tratada samples.Adapt el valor umbral para cada experimento para discriminar entre la falsa positivelectrónico y las detecciones de falsos negativos.
3. El uso de software apropiado observar la actividad neuronal detectado de cada electrodo como una trama de la trama de acuerdo con procedimientos estándar (véase la Figura 2A - C).
4. Determinar y mostrar la actividad total de la red mediante la suma de todos los eventos detectados dentro de una ventana deslizante de 10 mseg, desplazado por pasos de 1 mseg.
5. Detectar la actividad de la estimulación inducida por la visualización de los datos en bruto utilizando el software de análisis apropiados. Identificar los puntos solo sin conexión manualmente. Puntos solo aparecen transitorios de tensión tan rápido, que se produce después de que el artefacto de estimulación (cabeza de flecha en la Figura 2E). Un ejemplo se muestra en la Figura 2E.
6. Dependiendo del experimento, analizar el número de electrodos que responden, el umbral necesario para lograr una respuesta, el número de potencial de acción por electrodos y otros parámetros de interés ^5.

8. Tejido La fijación y Immunohistochemistry

NOTA: El proceso de tinción destruirá el MEA. Véase la Tabla de Materiales (punto 4) para los reactivos.

1. Directamente después de la grabación de lavar los cultivos con 37 ° C cálidos PBS tres veces. Desechar el PBS y aplicar 4% de paraformaldehído (PFA) (en PBS), precalentado a 37 ° C durante 10 min.
   PRECAUCIÓN: PFA es tóxico. Trabajo en una campana química con la protección adecuada y desechar la solución, de acuerdo con las directrices.
2. Lavar los cultivos tres veces con PBS y bloquear con 2% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS (0,01% de Triton-X100) durante 2 horas.
3. Añadir el primer anticuerpo (Anti-βIII tubulina, anticuerpo TUJ) diluido en PBS (2% de BSA y 0,01% Triton-X100) y dejar O / N a 4 ° C. Se lava el cultivo tres veces con PBS.
   NOTA: A partir de ahora a mantener la muestra en la oscuridad tan a menudo como sea posible para minimizar la decoloración del anticuerpo secundario marcado con fluorescencia.
4. Añadir el anticuerpo secundario, se diluyó en PBS (2% BSA unad 0.01% Triton-X100) e incubar durante 1 a 2 horas a RT. Para la tinción de los núcleos añaden 1: 10.000 DAPI (1 mg / ml de stock) para 10 min.
5. Lavar tres veces con PBS y montar las muestras hacia atrás para cubrir las caídas delgadas (24 x 50 mm ²⁾ utilizando medio de montaje (véase la Tabla de Materiales, punto 4). Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia con 5X y 20X.

La Figura 1 resume el procedimiento para el aislamiento de los tejidos, la preparación y la cultura de MEA. Mostramos los pasos consecutivos de la disección de tejidos para aislar el ganglio espiral (SG) del epitelio sensorial del órgano de Corti (OC) y estría vascular (SV) y anejas ligamento espiral (Figura 1 A - C). Explantes de ganglio espiral (3-4 en número) se cortan con micro-tijeras del ganglio como se ilustra esquemáticamente en la figura 1D y se coloca en MEA (Figura 1E), sobre el área ocupada electrodo (2,2 mm 2). El OC es colocado en proximidad, fuera de la superficie del electrodo. El crecimiento del cultivo se puede controlar a través del tiempo (Figura 1G). Un diagrama esquemático del protocolo se muestra en la Figura 1F. actividad electrofisiológica se puede detectar después de 6 días de cultivo, que aumentan con el tiempo de cultivo prolongado. Nosotros somosecommend evaluación de 18 culturas día, que producen un número significativamente mayor de electrodos de registro en comparación con los puntos de tiempo anteriores 5.

Figura 1. Preparación del cultivo celular. (A) diseccionó recién oído interno de ratón. Blanco línea discontinua indica la ubicación de la cóclea, negro línea discontinua indica la región vestibular. Oído interno (B) de ratón después de la eliminación de la pared ósea coclear. giros cocleares se indican mediante líneas de trazos blancos. (C) La espiral ganglio (SG) y modiolo, el órgano de Corti (OC) y la estría vascular (SV) y el ligamento espiral se muestran después de la disección. (D) Esquema de la SG y la disección y preparación OC SG explante {figure adaptado de 5 con la aprobación del editor}. (E) Ilustración de la matriz de electrodos múltiples utilizado en este estudio. recodificaciónelectrodos están organizados en una cuadrícula rectangular en el centro y ocupan un área de 2,2 mm 2. se ilustran electrodos de tierra 4 y contactos secundarios. (F) Esquema del protocolo de cultivo. Las grabaciones se realizaron en el día 18. (G) Representante imágenes (imágenes de campo claro) y esquemas de los explantes SG sobre MEA monitoreado en la cultura en el día 1, 6 y 18. Las barras de escala = 400 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La actividad espontánea puede ser detectada en MEA y se muestra como un gráfico de trama, donde cada línea del gráfico representa un pico detectado. Un ejemplo representativo que muestra la actividad espontánea detectada a partir de varios electrodos (diferentes colores en los gráficos) se muestra (Figura 2A, 2B y 2C).

(Figura 2D), 5 electrodos que respondieron (trazas rojas) y electrodos de no responder (huellas azules) se muestra en la Figura 2E. Para estos experimentos se utilizó un electrodo para la estimulación y todos los otros electrodos para la grabación. los potenciales de acción individuales aparecieron 1 ms después de que el artefacto de estimulación (cabeza de flecha negro). El MEA se puede immunostained al final del procedimiento con el fin de evaluar la cobertura de los procesos neuronales sobre el área del electrodo. El electrodo se indica en verde en la figura 2F se utilizó para la estimulación, y los electrodos indicados en rojo se utiliza para registrar las respuestas (Figura 2E).

Figura 2. Los datos sobre las grabaciones. MEA (A </ Strong>) Las huellas de las grabaciones originales de seis de cada 63 electrodos que muestran actividad espontánea. Plot (B) de la trama de los seis electrodos de la Figura 2A después de la detección pico. Cada barra representa un potencial de acción. (C) parcela Raster incluyendo todos los electrodos (como en A y B) La actividad se registró a partir de 63 electrodos (canales con un número 0-63) para 2 min. (D) Un estímulo bifásica con una duración total de 80 microsegundos y una amplitud de 80 mu se utilizó para la estimulación de la cultura de un electrodo (E58 en la Figura 2F). (E) Ejemplo representativo de trazas de datos en bruto obtenidos tras la estimulación del electrodo 58 que muestra los potenciales de acción (trazas rojas) o sin respuestas (huellas azules) después de la estimulación (negro punta de flecha). (F) cultura ganglio espiral en MEA a inmunotinción para el marcador neuronal TUJ (verde) en el final del experimento para visualizar neuro la cobertura final del área del electrodo {figure adaptado de 5 con la aprobación del editor}. Electrodo 58 utilizado para la estimulación se indica en verde, los electrodos que respondieron se indican en rojo. Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por último, la configuración MEA permite estudiar la posible modificación superficie del electrodo que puede aumentar la sensibilidad de grabación. Dos electrodos MEA comercialmente disponibles se utilizaron en este estudio con dos superficies de platino diferentes: gris platino (gris Pt), que consiste en un 150 gruesa capa Pt nm (impedancia: 400 KOhmios / 1 KHz) y Negro Platinum, (Negro, Pt), obtenido por deposición electroquímica de Pt al final del proceso de micro-fabricación (impedancia: 20 KOhmios / 1 KHz). Ver Tabla de Materiales (punto 6) para más detalles.

Figura 3. Comparación de gris vs Negro electrodos de Pt. Hay dos tipos de electrodos (Gris y Negro Pt) se compararon lado a lado usando 12 culturas MEA independientes, 6 de cada tipo MEA. (A) El número total de reelectrodos correspon- por experimento se muestra. Se muestra (B) umbral de amplitud para obtener una respuesta, medida con 30-35 pares de electrodos independientes en 6 experimentos independientes MEA. Los datos se muestran como la media +/- SD. (Prueba de la t de Student p <0,001) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.