Introduction
אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית נפוצה אשר התקפים חוזרים להתרחש בכל אורך חיים של המטופל. רוב הישנויות אפילפטי יכול להיות נשלט היטב על ידי תרופות אנטי-אפילפטיות (AEDs). עם זאת, כ -30% מכלל חולי אפילפסיה לפתח עקשן אפילפסיה 1. הגורמים לאפילפסיה לישון הפרעות, אשר יכול להחמיר הישנות נוספת. ראיות מוכיחות כי אפילפסיה עלולה לשבש את השינה בלילה או עלול לגרום 2,3 ישנוניים בשעות יום מוגזמים. המחקרים הקודמים שלנו עוד מצביעי אפילפסיה המתרחשים בשלב צייטגבר (ZT) 0, כלומר, בתחילת תקופת אור האור: המחזור כהה, פוחתת שינה; זו מתווכת על ידי שחרור הורמון קורטיקוטרופין (CRH), גורם ההומיאוסטטית. אפילפסיה בבית ZT13 (תחילת התקופה האפלה) משפרת את הביטוי של גורם נוסף ההומיאוסטטית, interleukin-1 (IL-1), אשר מגביר שינה. מקצבי היממה שינה משתנים כאשר אפילפסיה מתרחשת ZT6, באמצע4,5 תקופת האור. מצד השני, בעיות השינה להחמיר עוד יותר את ההתקדמות והישנות של אפילפסיה 6. בהתבסס על הראיות הנ"ל, אנו מנסים לחשוף שיטת טיפול אופטימלית זמנית לשלוט אפילפסיה למנוע הפרעות שינה בחולי אפילפסיה. אנחנו בעבר מצאנו electroacupuncture כי (EA) עם תדר גירוי של 10 הרץ, שבו כמות מסוימת של זרם מועברת לתוך נקודת הדיקור באמצעות מחט נירוסטה, בהצלחה מדכאת electrocorticogram (ECOG) פעילויות אפילפסיה והפרעות שינה הנגרמת אפילפסיה 7 . EA עם תדר גירוי 100 הרץ נוסף מידרדר פעילויות אפילפסיה והפרעות שינה בחולדות 8,9. ניסוי מוצלח זה תלוי בשלושה גורמים: ראשית, במודל חיה אפילפטי ריאלי; ושנית, שיטת הקלטה וניתוח שינה במכרסמים; שלישית, ביצועים מדויקים של דיקור וטיפול הדיוק של נקודות הדיקור locatiלפיירפוקס.
אפילפסיה כבר מסווג לשני סוגים עיקריים: מוקדי אפילפסיה אפילפסיה כללית. אנחנו מעוניינים אפילפסיה של האונה הטמפורלית מוקדי (ייתכנו), אפילפסיה כללית, סטטוס אפילפטיקוס (SE), ואת הישנות של אפילפסיה כללית ספונטנית. לכן, מניפולציות שונות מוחלות ליצור מודלי אפילפסיה מתאימים לניסוי שלנו. כדי להקים מוקדי ייתכנו, מינון נמוך של pilocarpine מנוהל לתוך הגרעין המרכזי הותיר של האמיגדלה (CEA). כדי לאמת את המודל הזה, שש אלקטרודות ECOG מושתלים על חזיתית (F1 & F2), הקודקודית (P1 & P2), ו העורפית (O1 & O2) האונות ומשמאל ההמיספרות ימינה, ושוב שתי אלקטרודות הפניה (R1 & R2) מונחות על המוח הקטן בשתי מחציות המוח. צינורית מדריך microinjection נוסף מושתל בניתוח לתוך שמאל CEA (AP, 2.8 מ"מ מן גבחת; ML, 4.2 מ"מ; DV, 7.8 מ"מ ביחס גבחת). הקואורדינטות מותאמות מן Paxinos ו- Wעכברוש atson אטלס 10. אם מוקדי ייתכנו מושרה בהצלחה, רק ההקלטה מן האלקטרודה על קליפת הקודקודית השמאלית (P1), שנמצא ליד שמאל CEA, צריך לרכוש את ECoGs epileptiform דומיננטי, ללא ECoGs epileptiform משמעותי שנרשם בגין אלקטרודות ECOG אחרים. הזרקה (IP) זריקות של pilocarpine לעכברי לגרום להכליל אפילפסיה SE, אבל זה יכול להיות קטלני. חמש זריקות IP של pentylenetetrazol (PTZ) עם מרווח של יום אחד בין כל הזרקה בהצלחה לגרום לאפילפסיה כללית ספונטנית בעכברים וגם להבטיח את המשך קיומו של עכברים. שתי אלקטרודות חוט ECOG מושתלים לתוך הקורטקסים הקודקודית בעכברים לקבל אותות ECOG וכדי לאמת אפילפסיה חוזרים באופן ספונטני.
Polysomnography (PSG) היא שיטה מקיפה להקליט שינויים פיזיולוגיים המתרחשים בזמן השינה, וזה יכול לסווג שינה באופן אובייקטיבי לשלבים שונים של תנועות עיניים בלתי מהירה (NREM) ו rתנועות עיניים apid שינה (REM). PSG רושמת פרמטרים של תפקודי הגוף, כולל גלי המוח (אלקטרואנצפלוגרם, EEG), תנועות עיניים (electrooculogram, EOG), צלילים שרירי השלד (electromyogram, EMG), קצב לב (רל, ECG), ורמות החמצן בדם ופרמטרים הנשימה. בחולדות, אנחנו מתעדים ECoGs, EMGs, טמפרטורת קליפת מוח, פעילות של תנועה לסווג מדינות ערנות למצב של ערות, שנת NREM, ולישון REM. ניתוח שינה בעכברים מתנהל באמצעות ECoGs, EMGs, ותוצאות הפעילות של תנועה. חולדות בניתוח מושתלים עם שלושה ECOG בורג אלקטרודות ליד חזיתית, הקודקודית, ואת הקורטקס של המוח הקטן הנגדי באמצעות ניתוח stereotaxic. נחישות שלאחר רכישה של מדינות הערנות (ערות, שנת NREM, ולישון REM) מתנהלת על פי הפרמטרים רכשו מן ECoGs, EMG, טמפרטורת מוח, פעילות של תנועה. קריטריונים מפורטים לסיווג התנהגות בעלי החיים בשתי חולדות ועכברים מתוארים tהוא פרוטוקול.
חולדות ועכברים שניהם צריכים להיות מורדם עם מינון נמוך של zoletil (25 מ"ג / ק"ג), המהווה מחצית המינון של הרדמה מנוהל בדרך כלל במהלך ניתוח stereotaxic, לפני ביצוע דיקור ידנית או EA. מינון זה מאפשר חיות להתעורר 30 עד 35 דקות לאחר ההזרקה. כך או דיקור ידני או EA מתבצע בתחילת התקופה החשוכה, עם פרק זמן קבוע של 30 דקות, ולאחר כל חית מטופל ברציפות במשך שבועות עד שלושה ימים. EA זרמי גירוי מועברים לתוך נקודות דיקור בפרט באמצעות מחט מפלדת אלחלד מוכנסת לתוך נקודות הדיקור. זרם גירוי רכבת של פולסים מרובעים biphasic, שבו משך הדופק הוא 150 ms ואת עוצמת הגירוי היא 1 mA. אם מחט יבש משמש דיקור ידני, המחט מוכנסת לתוך נקודות הדיקור היא התעוות 10 פעמים כל 5 דקות. החלק הקשה של דיקור ידני או EA הוא למקם את נקודות הדיקור במכרסמים. location של נקודות דיקור ב חולדות או עכברים דומה המיקום האנטומי שלהם בבני אדם. לדוגמה, נקודות דיקור Fengchi הבילטרליים ממוקמים במרחק של כ -3 מ"מ מקו החציוני האחורי על הצוואר, בין שתי האוזניים, הדומה המיקום האנטומי שלה בבני אדם 11. יתר על כן, נקודות הדיקור עם עכבה נמוכה על העור ניתן אישור נוסף. מניפולציה EA דיקור או אחיזת עיניים אחיזת עיניים הוא הכרחי עבור דיקור או ניסויים EA. דיקור דמה או EA דמה צריך להתבצע בכל נקודת דיקור אי הממוקם סמוך דיקור, כגון בסמוך לבית השחי 12.
כדי בהצלחה לחקור את ההשפעות של דיקור או EA על אפילפסיה והפרעות שינה בעזרת אפילפסיה, מהגורמים הבאים חייבים להיות במקום: במודל חית אפילפטי ריאלי, הניתוח המדויק של ECoGs epileptiform ואת ההישנות של אפילפסיה, שיטה לסווג מדינות ערנות , ואת הביצועים של דיקור או EA המדויקים במכרסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית טייוואן.
1. ניתוח Stereotaxic עבור אלקטרודות ECOG להשתיל, אלקטרודות EMG, המוח Thermistor, צינורית מדריך הזרקה
- עבור חולדות (250 - 350 גר ', 6 עד 8 שבועות בן ספראג-Dawley חולדות)
- להרדים את החולדות על ידי הזרקת ה- IP עם 50 מ"ג / ק"ג zoletil. אשר את העומק הנאות של הרדמה על ידי התבוננות חוסר התגובה לאחר צובט את הכף האחורית. החל משחת עין, לגלח את הפרווה, לעקר את העור עם פתרון povidone- יוד 75% אתנול. להזריק (G פניצילין) אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום.
- כן אזמלים, מספריים, hemostats, gauzes, ומכונת כווייה לניתוח. לעקר הילוך gauzes כירורגית ידי חיטוי ואת הכווייה ידי אתנול 75%.
- הוסף אוזן בר לתוך תעלת האוזן ואת הר חולדה אל stereotaxis.
- שימושאזמל, עושה חתך קו אמצע משוער 2 סנטימטר על הגולגולת לאורך קו בין שתי האוזניים, נע caudally. קליפ את שולי העור עם hemostats כדי לחשוף את הגולגולת להסיר את הרקמה על הגולגולת באמצעות אזמל.
- לקדוח חורים שמונה (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1, R2 ו), כל כ 0.7 מ"מ קוטר, על הגולגולת עם כלי רוטרי. בורג שמונה אלקטרודות ECOG על חזיתית, הקודקודית, ואת האונות העורפיות ואת המוח הקטן בשני שמאל ההמיספרות הימנית. אלקטרודות אלה משמשות לגילוי אפילפסיה מוקד.
- השתמש הקואורדינטות הבאות עבור אלקטרודות הקלטה: חזיתית (F1 ו- F2): הקדמי 2.0 מ"מ עד גבחת ו 2.5 מ"מ מן קו האמצע, הקודקודית (P1 ו- P2): הקדמי -2.0 מ"מ עד גבחת ו +3.0 מ"מ מן קו האמצע , ו עורפי (O1 ו- O2): -5.5 מ"מ קדמי גבחת ו +3.0 מ"מ מן הקו האמצע.
- מניחים שתי אלקטרודות התייחסות (R1 ו- R2) מעל המוחון (קדמית -11.0 מ"מ עד גבחת ו 4.0 מ"מ מן midline).
- בעוד קבוצות נפרדות של חולדות, מקדחה שלושה חורים ומניחים שתי אלקטרודות EEG בורג מעל הקדמית הימנית (F2) או האונה הקודקודית (P2) של הקורטקס עם אותן נקודות הציון כמתואר בשלב 1.1.5.1. מניחים אלקטרודה EEG השלישי מעל המוחון שמאל (R1), אשר משמש כדי לבצע הארקה של בעלי חיים ולהפחית חפצים האות. אלקטרודות אלה משמשות המאשרים אפילפסיה כללית וניתוח בשלבי ערנות.
- הפרד את עור הצוואר ושריר והכנס שתי אלקטרודות EMG לתוך שריר הצוואר.
- לקדוח חור נוסף על הגולגולת ומקום צינורית מדריך microinjection לתוך CEA (AP, 2.8 מ"מ מן גבחת; ML, 4.2 מ"מ; DV, 7.8 מ"מ ביחס גבחת) שמאל בחולדות. הקואורדינטות מותאמות מאטלס עכברוש Paxinos ווטסון 10.
- לקדוח חור גדול (בקוטר של 1.6 מ"מ) על הגולגולת והכניס thermistor 30 kV מכויל על פני השטח של קליפת המוח הקודקודית, אשר יהיה בצר מאוחר יותר, כדי מוניםTOR טמפרטורת קליפת המוח אצל חולדות.
- השתמש גזה כויה כדי לעצור את הדימום כאשר היא מתרחשת.
- כביש המוביל המבודד מן האלקטרודות ECOG ואלקטרודות EMG כדי דום ולחבר את thermistor אל הגבול. מלט הכן ולהדריך צינורית אל הגולגולת עם אקריליק שיניים.
- פנקו את החתך מקומי עם polysporin (אבץ Bacitracin / polymyxin סולפט B) כדי למנוע זיהום. תן החיות הן איבופרופן פניצילין G במים למשך שבוע לאחר הניתוח.
- עבור עכברים (20 - 30 גרם, 6 עד 8 שבועות בן C57BL / C עכברים)
- להרדים את העכברים בזריקת IP עם 50 מ"ג / קילו zoletil ולאשר את העומק הנאות של הרדמה על ידי התבוננות חוסר התגובה לאחר צובט את הכף האחורית. החל משח עין. אחרי גילוח הפרווה, לעקר את העור עם פתרון povidone יוד ואתנול 75%. להזריק (G פניצילין) אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום.
- הוסף אוזן בר לתוך תעלת האוזןהר את העכבר על stereotaxis.
- באמצעות אזמל, עושים חתך קו האמצע 1.5 ס"מ בקירוב על הגולגולת לאורך קו בין שתי האוזניים, נע caudally. קליפ את שולי העור עם hemostats כדי לחשוף את הגולגולת להסיר את הרקמה על הגולגולת עם אזמל.
- נקבו שני חורים בגולגולת עם מספריים כירורגיות ומניחים שתי אלקטרודות ECOG חוט על באונה הקדמית הימנית (F2: 2.0 מ"מ עד גבחת ו 1.5 אל קו האמצע) ואת האונה הקודקודית השמאלית (P1: -3.0 מ"מ עד גבחת ו -2.5 מ"מ עד קו האמצע).
- הפרד את עור הצוואר ושריר והכנס שתי אלקטרודות EMG לתוך שריר הצוואר.
- חבר המוביל המבודד מן האלקטרודות ECOG תיל אלקטרודות EMG למסופי הנקבה למחבר 2.54 מ"מ, ולאחר מכן מלט לגולגולת עם אקריליק שיניים.
- פנקו את החתך מקומי עם polysporin (אבץ Bacitracin / polymyxin סולפט B) כדי למנוע זיהום. תן החיות הוא איבופרופן פניצילין G במי פיפי אחדk לאחר הניתוח.
- אפשר את כל החיות להתאושש במשך שבעה ימים לפני תחילת הניסויים.
- חולדות או עכברי בית בנפרד, בכלובי הקלטת פרט, בחדר המבודד שבו הטמפרטורה נשמרה 23 ± 1 ° C והאור: כהה (L: D) קצב נשלט בתוך 12: מחזור 12 שעות (40 W x 4 צינורות תאורה). ספק כרצונך מזון ומים.
- חבר את ECOG, EMG, ו thermistor דרך לקשור אל מגברים שבוע לאחר הניתוח כדי להתחיל את ההקלטות.
2. הקמת אפילפסיה ייתכנו מיקוד, SE, ובספונטניות אפילפסיה חוזרות
- לחולדות
- נהל 0.5 μL של pilocarpine (2.4 מ"ג / μL) לתוך CEA השמאלי דרך צינורית הזרקת מדריך באמצעות משאבת microinjection. שיעור ההזרקה צריך להיות מוגדר ב 0.2 μL / דקה כדי לגרום מוקדי ייתכנו.
- IP להזריק 300 מ"ג / ק"ג של pilocarpine לגרום EPI כלליתlepsy עם חוזרות SE.
- עבור עכברים
- IP לנהל PTZ (0.035 מ"ג / g משקל גוף עכבר) בנקודת ZT מסוימת בכל יום אחר. חמש זריקות רצופות תגרום להתפתחות של אפילפסיה כללית ספונטני recurrently.
- עבור שתי חולדות ועכברים
- להגביר את אותות ECOG ידי 5,000 ולסנן את bandpass האנלוגי בין 0.1 ו 40 רץ.
- השתמש A / D המרת לוח כדי להמיר את אותות ECoGs האנלוגיים לאותות דיגיטליים עם קצב דגימה של 128 רץ.
- השתמש תוכנה עבור בקיע חזותי ולנתח את ההופעה ומשך אפילפסיה. מדוד את ציר הזמן על מנת לייצג את משך הזמן.
- גדר אפילפסיה ECOG ידי הופעתו של קוצים אפילפטי עם אמפליטודות יותר מ -2 mV ועם משכים של יותר מ -30 s 13.
סיווג 3. ערנות הברית
- לחולדות
- לקבוע את מצבי הערנות באמצעות הפרמטרים רכשו ECoGs, EMG, טמפרטורות מוח, תנועה בתוך פרק 12-s של הקלטה. חבר את ECOG, EMG, ו thermistor דרך לקשור אל מגברים שבוע לאחר הניתוח כדי להתחיל את ההקלטה. ציון המדינות עם תוכנת מחוייט פי שלבי 3.1.5 - 3.1.7.
- מדוד פעילויות של תנועה באמצעות גלאי תנועה אינפרא אדומים, לשלב את האותות כל 1 s, ולאחסן את האותות.
- למדידת טמפרטורה קליפת המוח ולאחסן את האותות.
- לסווג מדינות ערנות פי הקריטריונים שהוגדרו בעבר שלנו 14.
- ציון ער באמצעות המאפיינים הבאים: ECoGs-משרעת קטנה עם ספקטרום בתדירות גבוהה, כוח דלתא גבוה (0.5 - 4.0 הרץ), וכוח תטא נמוך (6.0 - 9.0 הרץ); פעילות של תנועה דומיננטית; פעילות EMG גבוהה; ובהדרגה הגדלת הטמפרטורה קליפת המוח.
- ציון שנת NREM באמצעות followinמאפייני g: ECoGs הדומיננטי-גל דלתא עם אמפליטודות גדול, ירד פעילות EMG, טמפרטורת קליפת מוח מופחתת, ולא פעילות של תנועה.
- ציון שנת REM באמצעות המאפיינים הבאים: ירידה משרעת של ECoGs עם תדר תטא הדומיננטי, טמפרטורת קליפת המוח גדלה פתאום, פעילות EMG מינימאלית, פעילות של תנועה נמוכה עם עוויתות גוף.
- עבור עכברים
- חזור על הסיווג של מדינות ערנות בעכברים כפי שנערך בחולדות, למעט אין טמפרטורת קליפת מוח שנרשמה בגין thermistor.
4. ביצוע דיקור ידני EA בחולדות
- העכברוש הוא מורדם לפרוטוקול EA.
- אתר את נקודות הדיקור על ידי האנטומיה ולאשר עכבת עור נמוכה על נקודות הדיקור. הנורית מהבהבת כאשר לזהות עכבת העור הנמוכה. הערה: נקודות דיקור Fengchi ממוקמים 3 מ"מ מן הקו החציוני האחורי להיותtween שתי האוזניים, על הצוואר.
- הכנס מחטי נירוסטה אל נקודות הדיקור בעומק של 2 מ"מ.
- עווית המחטים המוכנסות 10 פעמים כל 5 דקות.
- באמצעות חשמלי פונקציונלי, לספק רכבת של פולסים biphasic (משך 150-מיקרו-שניות כל אחד) בעוצמה של 1 מילי-אמפר אל נקודות דיקור באמצעות מחט.
- בצע דיקור דמה או דמה EA כביקורת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ישנם דגמי חולדה ועכבר שונים כדי לספק את הצרכים של סוגי אפילפסיה שונים. כדי לגרום מוקדי ייתכנו, 0.5 μL של pilocarpine (2.4 מ"ג / μL) מנוהל לתוך שמאל CEA. ECoGs epileptiform השולט נרכשים מן האלקטרודה ECOG על האונה הקודקודית של האונה השמאלית (איור 1 א: ב), ופעילויות אפילפטיים נדירים נאספות משאר האלקטרודות ECOG (איור 1 א: א, ג, ד, ה , ו-ו ') כאשר הוא ניהל את pilocarpine. ECoGs Epileptiform נזקפים מיידית בעיקר לאחר מתן pilocarpine. תוצאות אלו יאומצו מ -8. תוצאות אלו מצביעות על האינדוקציה המוצלחת של מוקדי ייתכנו בחולדות לאחר ההזרקה הישירה של pilocarpine במינון נמוך לתוך CEA.
תוך 5 דקות, IP בjection של pilocarpine 300 מ"ג / ק"ג גורם תופעות כולינרגית חמורות על התנהגות, כגון piloerection, ריור, עיניים אדומות, רועדת, automatisms פנים. חומרת הסימנים התנהגותיים אלה מגדילה בהדרגה עד תקף להכליל ECOG מתרחש (איור 1B, קופסא כחולה). SE גם מתרחש בעקבות אפילפסיה הכללית (איור 1 ב ', תיבה אדומה). תוצאות אלו יאומצו מ -13. התוצאות שלנו מראות כי זריקת IP של pilocarpine 300 מ"ג / קילו היא שיטה אמינה לגרום לאפילפסיה כללית מתועדת ECOG ו SE. עם זאת, שיעור ההישרדות לאחר פיתוח SE הוא בין 15% לבין 20%. מודל דלקת-PTZ לאפילפסיה בקרב עכברים משמש יתפתח באופן ספונטני, recurrently אפילפסיה כללי. PTZ במינון של משקל גוף עכבר 0.035 מ"ג / g הוא IP מוזרק בנקודת ZT מסוימת (למשל, תחילת התקופה האפלה, ZT13) בכל יום אחר, וכל הזרקה מופרד על ידי מרווח של יום אחד. אין epileptiformECoGs נמצא בתקופה הכהה לאחר 1 זריקת st של PTZ (איור 1 ג: א) או במהלך תקופת החושך הבאה, כאשר הוא יום מנוחה להזרקה (1C איור: ב). אין פעילות אפילפטית משמעותית נמצאה לאחר 2 nd, 3 rd, ו -4 זריקות ה (מידע לא מוצג כאן). עם זאת, ECoGs epileptiform הם המושרה לאחר ההזרקה 5 th PTZ (איור 1 ג: C ו- D), יחד עם ספונטני recurrently אפילפסיה כללית (איור 1 ג: E ו- A ').
אנחנו מסווגים מדינות ערנות למצב של ערות, שנת NREM, ולישון REM פי הקריטריונים שהזכרנו בפרוטוקול. ערות הוא הבקיע חזותית על ידי ECoGs desynchronized עם משרעת נמוכה ותדירות גבוהה. ערכי צפיפות ספק בטווח תדרי דלתא (0.5 - 4 רץ) הם בדרך כלל גדולים יותר מאלוהתדרים תטא (6 - 9 הרץ) בשעות הערות, ספקטרה תדירות גבוהה יותר (> 10 הרץ) נמצאים. ערות מפגין משרעת גבוהה של EMG והרבה פעילות של תנועה. יתר על כן, טמפרטורת קליפת מוח בהדרגה מגבירה כאשר עבר מדינת ערנות משינה או NREM או רע"מ לערות (איור 2). שנת NREM מאופיינת ECoGs המסונכרן עם משרעת גבוהה ותדירות נמוכה. ערכי צפיפות ההספק דומיננטיים בטווח תדרי דלתא. משרעת EMG יורדת בהדרגה, ולא פעילות של תנועה מוצגת במהלך שנת NREM. טמפרטורה קורטיקלי יורדת כאשר עבר מדינת ערנות מ ער בשנת NREM (איור 2). במהלך שנת REM, גל ECOG הוא desynchronized, משרעת מצטמצם, צפיפות הספק EEG השולט מתרחשת בתוך תדר תטא (6.0 - 9.0 הרץ), פעילות EMG היא עווית הגוף הנמוכה ביותר, phasic הוא ציין, וטמפרטורת קליפת המוח מגבירה במהירות(איור 2).
הפגנו את ההשפעות הברורות של EA על פעילות אפילפסיה בעת EA ממגרת את נקודות דיקור Fengchi גם עם גירוי בתדירות גבוהה (100 הרץ) או גירוי בתדירות נמוכה (10 הרץ). באיור 3 א, microinjection של 0.5 μL של pilocarpine (2.4 מ"ג / μL) לתוך CEA שמאל גורם מוקדי ייתכנו, כאמור (B). עם זאת, 100-הרץ EA של נקודות דיקור הבילטרליים Fengchi מחריפה את ECoGs epileptiform הנגרמת pilocarpine (C). תוצאות אלו מותאמות מ -8. לעומת זאת, 10-הרץ EA של הבילטרליים Fengchi מדכא את ECoGs epileptiform הנגרמת pilocarpine (איור 3 ב: C). תוצאות אלו מותאמות מ -7. מנהל של pilocarpine לתוך שמאל CEA גם מדכא שנת NREM בתקופה לאור אור 12 השעות: המחזור כהה (איור 4 א & 4B). צמצום שנת NREM במהלך afשעות EW של התקופה האפלה נובעות בעיקר השפעת ההרדמה, והוא אינו מהווה השפעה ישירה של EA 15. יישום של 100 הרץ EA עוד מידרדר הדיכוי נגרם pilocarpine שנת NREM (איור 4 א). לעומת זאת, 10-רץ EA של נקודות דיקור הבילטרליים Fengchi מגביר שנת NREM כשלעצמה בתקופת כהה חוסמת את הפחתת נגרמת pilocarpine שנת NREM בתקופת האור (האיור 4B). תוצאות אלו יאומצו מ -9.
איור 1: מודלים אפילפסיה שונים אצל חולדות ועכברים. מדגים את מוקדי ייתכנו בחולדות. B מבהיר את אפילפסיה כללית עם SE בחולדות. C מציין את ECoGs epileptiform הספונטני החוזר. (א) (א), (ב), (ג), (ד), (ה), (ו) מייצג את Eאותות בורג שנרשמו בגין אלקטרודות המונחות על המצח השמאלי, הקודקודית שמאלית, עורפי שמאל, קדמית ימני, הקודקודית ימנית, ואת הקורטקס עורפית ימינה, בהתאמה. (ב) החץ מציין את זריקת IP של pilocarpine. התיבה האפורה (א) מדגימה את ECoGs הבסיס שהושג לפני זריקת pilocarpine. הקופסה הכחולה מציגה את epileptiform ECoGs של אפילפסיה כללית. תיבת אדום (ב) מייצגת את SE. אותות ECOG מופקים (א) ו- (ב) מוצגים (א ') ו- (ב'). (ג) (א) מייצג את ECoGs שנרכש לאחר הזרקת -1 PTZ ו (ב) מייצג את ECoGs רשמה היום שאחרי 1 הזריקה PTZ רח בעכברים. פעילויות אפילפטיים להתרחש לאחר הזרקת PTZ 5 th (ג) ולאחריה. ECoGs אפילפטיים החוזר המתרחש היום לאחר 5 th הזרקת PTZ מוצג (ד). ECoGs אפילפטיים חוזר רשם 5 ימים לאחר הזרקת PTZ 5 th מוצגים (ה) . הדמות בתחתית (א ') מייצגת את ECoGs שחולץ מן התיבה האדומה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: סיווג של דריכות הברית: ערות, NREM לישון, REM Sleep. מדינות הערנות של חולדות והם מסווגים על פי הפרמטרים מן ECoGs, ספקטרה ECOG, EMGs, פעילות של תנועה, וטמפרטורת קליפת המוח. מדינות הערנות של עכברים מאופיינות אותם הפרמטרים, למעט טמפרטורת קליפת המוח אינה ישימה.
אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
pload / 54,896 / 54896fig3.jpg "/>
איור 3: השפעות של 100-הרץ ו EA 10-הרץ על אפילפסיה. ב (א), עקבות ECOG הראשונות מדגימות את ECoGs הבסיס (א). Microinjection של pilocarpine לתוך CEA שמאל גורם מוקדי ייתכנו (ב). יישום של EA 100-רץ נקודות דיקור הבילטרליים Fengchi מחריף את ECoGs epileptiform (ג). ב (ב), עקבות ECOG הראשונות מדגימות את ECoGs הבסיס (א). את microinjection של pilocarpine לתוך CEA שמאל גורם מוקדי ייתכנו (ב). היישום של EA 10-הרץ נקודות דיקור הבילטרליים Fengchi מדכא את ECoGs epileptiform (ג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: השפעות של 100-הרץ ו EA 10-הרץ על Epiהפרעות שינה נגרמת lepsy. (א) מרחק ייתכנו המושרה על ידי microinjection של pilocarpine לתוך CEA שמאל מפחית שנת NREM בתקופת האור. 100-הרץ EA עוד מידרדר הפרעות שינה הנגרמת אפילפסיה. (ב) הבקשה של 10 רץ EA בלוקי הפחתת נגרמת אפילפסיה שנת NREM בתקופת האור. יתר על כן, 10-הרץ EA משפר שנת NREM במהלך התקופה האפלה. ערכים מיוצגים ממוצע ± SEM. העיגול השחור מייצג את הערכים שהתקבלו לפני microinjection של pilocarpine, המעגל הפתוח מתאר את הנתונים רכשו לאחר הזרקת pilocarpine, והמשולש הפתוח מדגים את הערכים שהתקבלו לאחר גירויי EA. הפס השחור מייצג את התקופה האפלה של אור 12 שעות: מחזור כהה, ואת הפס הלבן מתאר את תקופת האור. * מייצג את הבדל סטטיסטי בין EA 100-הרץ + קבוצת pilocarpine ואת השליטה (ANOVA, p <0.05) ו # מציין את הבדלים סטטיסטייםדואר בין EA 10-הרץ + קבוצת pilocarpine והקבוצה pilocarpine (ANOVA, p <0.05). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בחירת מודל חית אפילפסיה ריאלית חיונית לכל מטרה ניסיון. אחת המטרות שלנו היא להבהיר את ההשפעות של EA על דיכוי אפילפסיה. EA היא רפואה אלטרנטיבית עשוי להפגין האפקט הטיפולי ב אפילפסיה תועד בספרות הסינית העתיקה. עם זאת, קיים מחסור של ראיות מדעיות כדי להוכיח את זה. כדי לקבוע את ההשפעות של EA על אפילפסיה, התמקדנו בעיקר על ההשפעות של EA על אפילפסיה מוקד קלה, ולא על תפיסה חמורה כללית או SE. במחקר הקודם שלנו השתמשו במודל ייתכנו מוקדי בחולדות כדי להדגים את ההשפעות של בתדירות נמוכה (10 הרץ) בתדר גבוה (100 הרץ) EA של נקודות דיקור Fengchi הבילטרליים על הפרעות שינה pilocarpine-induced מוקדי ייתכנו ואת מוקדי ייתכנו הנגרמת 7- 9. התוצאות שלנו מראות כי 10-הרץ EA של נקודות דיקור הבילטרליים Fengchi מדכאות שיבוש ייתכנו ולישון מוקדים, ואילו 100-הרץ EA מחריף הוא מוקדי ייתכנו והפרעות שינה בעזרת ייתכנו. דוגמא נוספת היא to להדגים את ההשפעות של גירוי מוחי עמוק על אפילפסיה עקשן, במיוחד תפיסה כללית SE. קבענו כי גירוי מוחי חד-צדדי עמוק של הגרעין הקדמי של התלמוס (ANT) עם זרמים בתדירות גבוהות בעצימות נמוכות בהצלחה מעכב את הישנותם של אפילפסיה כללית ואת משך SE 13. גם פיתחנו ספונטני להכליל recurrently אפילפסיה בשיטת הדלקת PTZ בעכברים. מודל PTZ-הצתה זה יכול להיות מיושם באופן נרחב מחקרי אפילפסיה. השלב הקריטי לקביעת מודלי אפילפסיה אלה הוא השימוש של המינונים המתאימים. Microinjection של כמויות גדולות יותר של pilocarpine לתוך CEA עלול לפתח אפילפסיה כללית משנית. IP הממשל של יותר מ -300 מ"ג / ק"ג pilocarpine גורם אפילפסיה כללית ו SE; עם זאת, רוב החולדות לא שרדו לאחר SE מפותחת. בנוסף, מינונים נמוכים מ -280 מ"ג / ק"ג לא יכולתי לבסס אפילפסיה כללית בהצלחה SE. זה אותו סיtuation קורה עם מודל הצתה-PTZ. גדולות יותר מנות של PTZ עלולות לגרום SE, אבל רבי עכברים אינם שורדות. לעומת זאת, מינונים נמוכים של PTZ דורשים יותר זריקות להקים אפילפסיה חוזר באופן ספונטני.
הסיווג של מדינות ערנות שונות אצל חולדות ועכברים מתבסס בעיקר על תכונות של polysomnography רשמו מבני האדם. שינינו את הפרוטוקול כדי לנתח פעילות שינה והערות מערכיה רשמו ECOG, בהתפלגות ספקטרום EMG, פעילות של תנועה, וטמפרטורת קליפת המוח. המאפיינים של ECOG, בהתפלגות ספקטרום EMG, פעילות של תנועה, וטמפרטורת קליפת המוח רשמו ער לשנת NREM דומים לאלה רכשו מבני האדם. עם זאת, שנת רע"מ היא לפעמים מעורפלת וקשה לסווג במכרסמים. רוב הספרות מתארת רע"מ במכרסמים פי ECoGs ו EMGs שלה. התדרים תטא של ECoGs הוא השולט ואת טונוס השרירים של EMG הוא חולדות או עכברים כאשר הנמוך ביותרמחדש ב שנת REM. על מנת להגדיל את האמון של שנת רע"מ ניקוד, עוד הקלטנו פעילות של תנועה וטמפרטורת קליפת המוח. עווית גוף phasic הוא ציין וטמפרטורת קליפת המוח מגבירה במהירות כאשר חולדות להיכנס לשנת REM. תנועת פעילות וטמפרטורת קליפת המוח, בנוסף ECoGs, בהתפלגות ספקטרום ו EMGs, לשפר את הדיוק לניתוח שנת רע"מ. ככל פרמטרים כלולים, הסיווגים המדויקים יותר יכולים להתבצע.
שתי נקודות מרכזיות תמיד זכו לביקורת כאשר חוקר לבצע דיקור ידני או ניסויי EA. הסוגיה הראשונה היא כיצד חוקר לזהות ולאשר את נקודות הדיקור בחולדות. מערכת המרידיאנים ואת נקודות הדיקור בבני האדם מבוססות היטב, אולם אין מפת מערכת דיקור מרידיאן אשרה במכרסמים. לכן, הלוקליזציה של נקודות דיקור מקבילות מכרסמים נקבעת על פי המיקום האנטומי יחסית. לדוגמה, נקודות דיקור Fengchi (GB 20) הםממוקם דיכאון בין החלק העליון של sternocleidomastoideus musculus ואת הטרפז musculus בבני אדם. מצאנו את המיקום האנטומי קשור מכרסם עוד חזקתי את זה על ידי מדידת עכבת עור נמוכה. העכבה של נקודת דיקור הוא נמוך מזה של העור שמסביב. הנושא השני הוא כיצד במינוני הדיקור נשלטים במהלך הניסוי. אם דיקור ידני משמש לצורך הניסוי, המניפולציה של מחט מתעוות צריכה להתבצע על ידי אותו חוקר באותו אופן עבור כל מניפולציה. זה יהיה קל יותר לשלוט על מינון הדיקור אם EA ישימה, כמו EA מבטיחה בתדירות גירוי עקבית עוצמת זרם. יתר על כן, ב שיכוך כאבים, EA מפגין יותר יעיל מאשר דיקור ידני 16. עם זאת, דיקור ידני EA עם בתדירות נמוכה וגירוי בתדירות גבוהה באותו הדיקור יכולים להפעיל אזורים שונים במוח 17, אשר עשויים לרמז underly השונהing מנגנונים.
לסיכום, מאמר זה ממחיש כמה מודלים אפילפסיה הנגרמת כימיים אצל חולדות ועכברים, כולל מוקדי ייתכנו, אפילפסיה כללית, SE ו- ספונטני recurrently אפילפסיה כללית. גם הקמנו את מודל אפילפסיה החשמל-דלקת המסורתית ומהיר בחולדות. אם הקוראים מעוניינים במודל חשמל-הצתה, עיין הפניות 4 ו -5 כמו כן אנו מספקים את הקריטריונים לניתוח פעילות השינה והערות אצל חולדות ועכברים. כדי להעריך את ההשפעה של EA על פעילות אפילפטית שינה, אנו מתארים כיצד למקם את נקודות הדיקור הקשורות בחולדות כיצד לבצע את הדיקור, ואנחנו גם להציג כמה תוצאות נציג להמחיש את ההשפעות של EA על אפילפסיה והפרעות שינה בעזרת אפילפסיה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X.
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W.
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
