Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis (TB), es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. TB-Drogas sensible es una enfermedad tratable que requiere múltiples antibióticos para un período de 6 meses. A pesar de ser una enfermedad tratable, la mortalidad por tuberculosis se estimó en 1,5 millones en 2015 ^1. En los últimos 10 años, han aumentado las preocupaciones sobre la prevalencia de resistente a los medicamentos M. tuberculosis. Multirresistente TB (MDR-TB) se define como la tuberculosis que es resistente a al menos isoniazida (INH) y la rifampicina (RMP), y la mayoría de las cepas MDR-TB son también resistentes para seleccionar fármacos antituberculosos de segunda línea, lo que limita las opciones de tratamiento . Los efectos de la resistencia a los medicamentos crean un mayor desafío para el tratamiento de pacientes coinfectados con virus de inmunodeficiencia humana (VIH); 400.000 pacientes en todo el mundo murieron de tuberculosis asociada al VIH en 2015 ^1. Lamentablemente, los Estados Unidos de Alimentos y Medicamentos Administración ha aprobado sólo un nuevo medicamento contra la tuberculosis MDR-TB, bedaquiline, en los últimos 40 años ^2. Se necesitan con urgencia los avances en la búsqueda de mejores y más cortas las terapias de TB con el fin de mantenerse a la vanguardia en la lucha contra la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente.

Tradicionalmente, las pantallas de drogas TB se llevan a cabo en condiciones de crecimiento in vitro en medio de crecimiento, con lo que se añaden compuestos a un cultivo en crecimiento y de su eficacia en la erradicación de los microorganismos se determinó por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en medio sólido. Como recuentos de CFU requieren mucho trabajo, mucho tiempo, y costoso, diversos métodos indirectos se han desarrollado para aliviar este problema. Tales métodos incluyen el ensayo Alamar Blue viabilidad ^3, la determinación de la fluorescencia ⁴ de la proteína verde fluorescente (GFP) o luminiscencia ⁵ a partir de bacterias de luciferasa que expresan, y la estimación de la adenosina trifosfato total de (ATP) ^{6, 7.}

TB típica se caracteriza por una infección por M. tuberculosis del pulmón, donde las bacterias residen y se replican dentro de las fagosomas de los macrófagos alveolares ^8. El simple pantalla fenotípica en caldo puede adaptarse a los patógenos extracelulares; sin embargo, en la perspectiva histórica, golpean compuestos contra M. tuberculosis identificados mediante este método a menudo no logran cumplir con las expectativas durante las etapas de validación aguas abajo en modelos de infección. Proponemos que los medicamentos antituberculosos se realiza mejor en un modelo de infección de la célula huésped intracelular. Sin embargo, los modelos intracelulares poseen muchas barreras tecnológicas y biológicas a screening (HTS) el desarrollo de alto rendimiento. Un gran obstáculo es la complejidad del proceso de infección, ejemplificada por numerosos pasos y el elaborado eliminación de bacterias extracelulares en el medio de lavado. Un segundo obstáculo importante es el largo tiempo de requirements, como la detección de crecimiento, normalmente realizado por CFU contando en placas de cultivo, es un proceso que toma más de 3 semanas en completarse. Una solución para reemplazar los recuentos de CFU ha sido proporcionada por microscopía fluorescente automatizado en combinación con las bacterias fluorescentes. Sin embargo, esta solución requiere una inversión inicial del equipo que está fuera del alcance de muchos laboratorios de investigación. A simple, de bajo costo, y el método HTS-enfermedad pertinente mejoraría en gran medida el proceso de descubrimiento de fármacos.

En este estudio, se presenta un nuevo sistema, HTS modular que está dirigido a proporcionar un rápido y altamente escalable, con todo económica, ensayo adecuado para determinar la actividad de los compuestos contra M. tuberculosis intracelular. Este sistema se compone de tres módulos: (i) intracelular, (ii) la citotoxicidad, y (iii) ensayos in-caldo. El resultado final combinado proporciona una descripción completa de las propiedades del compuesto, con información adicional en cuanto al modo de acción potencial. este SCsistema reening se ha utilizado en varios proyectos con diversas bibliotecas de compuestos que modo de acción objetivo, incluyendo el análisis de la sinergia de drogas ^9, la estimulación de la autofagia ^10, y la inhibición de M. tuberculosis -secreted factor de virulencia (no publicado). Los compuestos de modo de acción desconocido también se han estudiado ^11. Una versión modificada de este método fue también adoptado por nuestro socio industrial como método de cribado primario de identificar nuevos compuestos contra intracelular M. tuberculosis ^11.

1. cepa bacteriana y el medio de crecimiento

1. Hacer dextrosa albúmina y solución de sal de stock (ADS) por solubilización de 25 g de albúmina de suero bovino, 10,0 g de dextrosa, y 4,05 g de cloruro de sodio en 460 ml de agua desionizada. Filter-esterilizar el ADS y almacenar a 4 ° C.
2. Hacer caldo 7H9 mediante la adición de 4,7 g de 7H9 en polvo y 2 ml de glicerol a 900 ml de agua purificada. Autoclave el caldo 7H9 a 121 ° C durante 10 min y permitir que se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder. Hacer 7H9ADST mediante la adición de 100 ml de ADS y 0,5 ml de Tween 80 a 900 ml de caldo 7H9. Almacenar a 4 ° C.
3. Pesar 50 mg de sulfato de kanamicina y se disuelven en 1 ml de agua desionizada; la concentración final es de 50 mg / mL. Filter-esterilizar y almacenar a -20 ° C. Añadir 0,5 ml de kanamicina solución madre por 1 L de 7H9ADST.
   NOTA: Este medio debe hacerse fresco, así escalar los volúmenes apropiadamente de acuerdo con el tamaño cultura.
4. Crecer M. tuberculosis en 7H9ADST suplementado con kanamicina en pie cultura. Agitar la cultura diaria y diluir antes de que la DO600 alcanza 1,0 para evitar la formación de grumos.
   NOTA: La cepa de M. tuberculosis utilizado para el desarrollo de este método fue H37Rv transformó con pJAK2.A plásmido ^12. pJAK2.A es un plásmido integrativo basado en el vector pMV361, que permite la expresión de alto nivel del gen de la luciferasa de luciérnaga a partir del promotor hsp60 y se pueden seleccionar utilizando kanamicina.

2. THP-1 Medium y mantenimiento

1. Añadir 50 ml de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS) y 5 ml de 200 mM de L-glutamina a 500 ml de RPMI 1640 para hacer RPMI medio incompleto (aproximadamente 10% de FBS y glutamina 2 mM).
2. Mantener un cultivo de células THP-1 según el protocolo estándar de ^13. Brevemente, crecer células THP-1 en medio RPMI incompleto mientras se mantiene una densidad celular de 0,2 a 1 millón por ml de medio de entre passabios.

3. Alto rendimiento Screening intracelular Uso de luciferasa que expresan M. tuberculosis H37Rv

1. Medir la densidad óptica de una suspensión bacteriana en crecimiento activo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Calcular la densidad bacteriana usando el factor de conversión de 0,1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ bacterias por ml.
2. Pipeta de las bacterias suficientes para una multiplicidad de infección (MOI) de 10: 1 en un nuevo tubo de centrífuga. Se precipitan a 3.000 xg durante 10 min y aspirar el líquido. Añadir 50 l de suero humano a 450 l de RPMI1640. Escala el volumen de apropiarse de los valores para el experimento.
3. Para opsonizar las bacterias, resuspender el precipitado a una densidad de 1 x 10 ⁸ bacterias por 500 l de RPMI1640 que contiene suero humano al 10%. Dejar que la mezcla se incuba a 37 ° C durante 30 min. Determinar la densidad de cultivo de células THP-1 mediante el recuento con un hemocitómetro y un microsco invertidaEducación física.
4. Sedimentar las células en tubos de centrífuga estériles a 100 xg y 37 ° C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI incompleto a una densidad de 1 millón de células por ml. Añadir forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) a una 40 ng / ml de concentración final.
   NOTA: Esto se conoce como la mezcla diferenciación.
5. Combinar opsonizado M. tuberculosis con THP-1 mezcla diferenciación a una MOI de 10: 1 y alícuota la mezcla final a 100! L por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano. Regularmente se agita la mezcla para asegurar la uniformidad. Permitir a la diferenciación y la infección de proceder durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de _CO2.
6. Lavar los pocillos dos veces con 100! L de medio RPMI cada uno. Añadir compuestos diluidos a las concentraciones deseadas en RPMI incompleto e incubar durante 3 días.
7. Aspirar el medio de los pocillos. Añadir 50 l de reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo. Sellar las placas con tRansparent selladores de placas adhesivas. Permitir 5 min de incubación a 22 ° C y luego obtener una lectura en un luminómetro en 1 s por pocillo.

4. Análisis de citotoxicidad El uso de un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) Ensayo ¹⁴

1. Diferenciar las células THP-1 en medio RPMI incompleto suplementado con 40 ng / ml de PMA en claras placas de 96 pocillos. Mantener una densidad celular de 1 millón por ml y alícuota de 100 l por pocillo. Permitir la diferenciación de proceder durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de _CO2.
2. Aspirar el medio de los pocillos y lavar dos veces con RPMI 1640. Añadir compuestos diluidos en medio RPMI incompleto a los pocillos. Incubar durante 3 días.
3. Disolver 0,5 g de MTT en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una solución madre de 5 mg / mL. Filtro estéril y se almacena a -20 ° C, lejos de la luz; lo mejor es hacer que esta solución fresca.
4. 2,5 h se acabene el final del período de incubación de 3 días, se añaden 25 l de solución de MTT a cada pocillo y completar el período de incubación.
5. Preparar 50% de N, N -dimetil formamida (DMF) mediante la mezcla de 250 ml de DMF con 250 ml de agua desionizada.
6. Preparar tampón de extracción MTT como sigue: Pesar 100 g de SDS en una botella de 500 ml y añadir 300 ml de DMF al 50%. Aplicar calor suave para permitir que el SDS se disuelva. Añadir 10 ml de ácido acético puro y 12,5 ml de HCl 1 M. Llenar hasta la marca de 500 ml con 50% de DMF; la composición final de tampón de extracción es de 50% de DMF, 20% de SDS, ácido acético 2,5%, y 2,5% de ácido clorhídrico 1 M.
7. Al final del período de tratamiento, añadir 100 l de tampón de extracción (calentado a 45 ° C para disolver cualquier cristales) a cada pocillo. Dejar que la mezcla se incuba durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de _CO2. Leer la absorbancia a 570 nm.
   NOTA: El ensayo de citotoxicidad se realiza mejor en paralelo con un intracelularpantalla ular usando el mismo lote y la edad de las células THP-1.

5. En caldo Actividad análisis utilizando un resazurina Ensayo ³

1. Crecer M. tuberculosis en 7H9ADST a la fase semilogarítmica (~ 0,5-0,8 OD _600). Diluir el cultivo con la 7H9ADST a 0,01 OD _600. Diluir los compuestos en 7H9ADST a 2x las concentraciones de ensayo y alícuota de 100 l de cada compuesto diluido en cada pocillo.
2. Transferir 100 l de la suspensión bacteriana diluida en cada pocillo. Permitir a las placas incubar a 37 ° C en un incubador humidificado durante 5 días. Disolver 10 mg de resazurina en 100 ml de agua desionizada y el filtro estéril.
3. Añadir 30 l de solución de resazurina y controlar el cambio de color después de 48 h; el crecimiento bacteriano se indica mediante una conversión de color de azul a rosa.
   NOTA: Un análisis cuantitativo también se puede realizar mediante la medición de ya sea la fluorescencia a 590 nm con excitación a 530 hasta 560nm o la absorbancia a 570 nm y 600 nm ^15.

Detección intracelular de alto rendimiento usando M. tuberculosis que expresa el gen de la luciferasa

La figura 2A y en la Tabla 1 contienen los datos brutos recogidos por el luminómetro, expresados en unidades luminiscentes relativas (RLU), que muestra el efecto de una concentración creciente de la rifampicina fármaco TB en M. tuberculosis dentro de las células THP-1. La Figura 2A es un gráfico de dispersión de la luminiscencia medida en bruto en RLU para varias concentraciones de rifampicina. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). La figura 2B muestra el porcentaje de reducción en la luminiscencia en pocillos tratados en comparación con los pocillos no tratados. Los datos muestran que la rifampicina es capaz de reducir> 99,9% de RLU de intracelular M. tuberculosis a una concentración de 0,1 g / ml. Esto está de acuerdo con el previously publicó MIC entre 0,1 y 0,4 g / ml 16. Luminiscencia producida en cada pocillo es una indicación de la luciferasa total expresado por M. tuberculosis y por lo tanto es un indicador del estado metabólico de M. tuberculosis dentro del pozo. Es normal que los niveles luminiscentes primas para variar entre los experimentos. Como tal, una comparación de los datos en bruto generaría conclusiones fiables. Por lo tanto, los datos deben ser normalizaron frente a un control negativo definido, lo que sería las muestras tratadas sólo con DMSO. Los valores resultantes pueden expresarse como el porcentaje de reducción en M. tuberculosis en los pocillos (Figura 2B).

análisis de citotoxicidad utilizando el ensayo MTT

El ensayo MTT es un ensayo bien establecido para la citotoxicidad eucariota. Este ensayo colorimétrico indica células vivas a través de la conversión de MTT (amarillo) aformazán de color púrpura. Este ensayo se realiza sin una infección por M. tuberculosis debido a que las bacterias son capaces de metabolizar MTT, lo que reduce la toxicidad observada de los compuestos. Una sugerencia común para el ensayo de MTT es el uso de medios de comunicación sin el indicador de pH rojo fenol debido a la absorción a 570 nm 17. Sin embargo, el tampón de extracción acidificado se describe en este método es capaz de minimizar la interferencia causada por el rojo de fenol 17.

La Figura 3 ilustra la citotoxicidad causada por una concentración creciente de una G1-1H codificado compuesto de ensayo. Normalmente, se emplea una concentración inhibitoria del 50% (IC 50) para indicar el nivel de citotoxicidad. En el caso de G1-1H, las concentraciones de 10? M y 3 M son claramente por debajo de la concentración IC 50.

En caldo nos análisis de la actividading el ensayo resazurina

El ensayo de resazurina se utiliza comúnmente para el análisis de la citotoxicidad en células eucariotas, pero también puede ser usado para monitorear bacterias vivas en caldo 3. El ensayo resazurina es un ensayo basado en redox similar al ensayo MTT. Se mide los niveles de NADPH y la actividad deshidrogenasa NADPH a través de la conversión de la resazurina en resorufina, un fluoróforo rojo. La manera más fácil y rápida para determinar la eficacia del fármaco es la búsqueda de la concentración de tratamiento más bajo, donde los pozos se mantienen de color azul. La Figura 4 muestra parte de una placa de 96 pocillos que muestra los efectos diferentes concentraciones de los apramicina antibióticos tienen sobre resazurina conversión por M. tuberculosis. El MIC en caldo se determinó que era entre 2,5 y 5 mg / ml. Esta cifra es ligeramente mayor que el valor publicado previamente de 1,5 g / ml 18, pero aún está dentro de la acceptabgama le. En muchos casos, el cambio de color es más bien gradual, por lo que es difícil hacer una determinación segura. En estas condiciones, es mejor para cuantificar la cantidad real de resazurina conversión utilizando la absorbancia o fluorescencia. Debido a las características de absorbancia similares de resazurina y resorufina, la determinación MIC utilizando la absorbancia requiere mediciones utilizando dos longitudes de onda diferentes y cálculos complejos 15. Por lo tanto, el mejor método es para medir la fluorescencia usando 530- a 560-nm longitudes de onda de excitación y una longitud de onda de emisión de 590-nm, como se describe en la literatura del fabricante 15.

La Figura 4 ilustra una posible fuente de inconsistencia asociado con incubaciones de varios días que podrían alterar drásticamente los resultados del cribado. Debido a humidificación inadecuada de la incubadora a 37 ° utilizado para este experimento, los pocillos en los bordes de la p lates sufrieron significativamente más evaporación. Todos los 15 pozos tratados con DMSO se supone que son idénticos, pero los pocillos a lo largo de los bordes izquierdo y superior habían reducido volúmenes. Estos pozos también parecen tener diferentes colores que los otros pocillos tratados con DMSO en el medio de la placa. La misma inconsistencia también se puede observar en 2,5 g / ml pozos apramicina tratada. En este caso, el volumen reducido también daría lugar a una lectura cuantitativa mediante un espectrofotómetro y fluorímetro. La evaporación se vuelve significativo para todos los experimentos con tiempos de incubación prolongados, por lo que se debe tener cuidado para mantener así incubadoras humidificadas-para evitar esta fuente de inconsistencia.

Figura 1: Método Esquemas. Diagrama que representa los esquemas de ensayo por 3 módulos separados del sistema de cribado de alto rendimiento. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Los datos representativos de una intracelulares para examinar la eficacia de rifampicina en la eliminación de M. tuberculosis dentro de células THP-1. (A) Gráfica de la luminiscencia media lectura (en unidades relativas de luminiscencia) para cada tratamiento de concentración (rifampicina). Las barras de error indican el error estándar de la media para cada triplicado. (B) Gráfica de la reducción porcentual calculada de la luminiscencia causada por un tratamiento de rifampicina, donde los valores más altos indican una mayor eficacia. La concentración inhibitoria 90% (IC 90) en este caso es en algún lugar entre 0,01 y 0,1 g / ml.nk "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: datos representativos de un ensayo de citotoxicidad (MTT) para examinar los efectos tóxicos de G1-1H compuesto sobre diferenciadas THP-1 células. Gráfica de la "porcentaje de control" calculado valores para cada concentración de la G1-1H compuesto de tratamiento, donde los valores más altos indican más saludables células THP-1. El IC 50 en este caso es en algún lugar entre 10 y 30? M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los datos representativos de un ensayo para examinar la resazurina EFICACIA de apramicina en la inhibición de M. tuberculosis en-caldo. Sólo los datos cualitativos se recoge en este caso debido a las limitaciones del equipo en el laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (BSL3). La foto muestra parte de una placa de 96 pocillos que contenía M. tuberculosis tratados con DMSO o cantidades variables de apramicina. Los pocillos tratados con DMSO exhibió una conversión de la resazurina a resorufina, como se indica por la conversión de color de azul a rosa. Las muestras apramicina tratado se sometieron claramente la conversión de color por debajo de 5 mg / ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Datos sin procesar desde el ensayo de luciferasa para la determinación de la intracelular IC 90 de rifampicina.

Tabla 2: Datos sin procesar a partir del ensayo MTT para la determinación de la citotoxicidad de prueba G1-1H compuesto a DiffereLas concentraciones nt.

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos para este trabajo.