Procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado

Inmunoensayos electroforéticos capilares medida expresión de la proteína en los lysates de la célula utilizando sistemas de separación de tamaño o carga y ofrecen varias ventajas sobre el tradicionales inmunoensayos. Por ejemplo, en comparación con western blot, el procedimiento automatizado basado en el tubo capilar elimina la necesidad de geles, dispositivos de transferencia, y lavado manual. Además, la cantidad absoluta de proteínas necesaria es aproximadamente 10 veces menos, haciendo sistemas de tubo capilar ideal para el uso con tipos raros de la célula o limitada muestra^1,2. Resultados se obtienen en tan sólo 3 h utilizando sistemas automatizados y anteriormente se han demostrado para ser más cuantitativa y reproducible que convencional occidental blot procedimientos^3,4,5. El proceso de ensayos de tamaño consiste en cargar las muestras que contienen sulfato de sodio dodecyl (SDS), dithiothreitol (DTT) y fluorescencia con la etiqueta marcadores de peso molecular en columnas capilares que contienen matrices de apilamiento y de separación. Voltaje aplicado a los tubos capilares separa las proteínas en las muestras según el tamaño, y la luz UV inmoviliza las proteínas separadas de la pared capilar. El capilar es inmuno-sondeado con destino específico primaria rábano picante y el anticuerpo peroxidasa (HRP)-anticuerpo secundario conjugado. Luminol y peróxido de catalizan la generación de luz quimioluminiscente que es medido por una cámara de carga dispositivo acoplado (CCD) y analizada para cuantificar proteínas.

A pesar de la relativa facilidad y velocidad de una plataforma automatizada basada en tubo capilar electroforético inmunoensayo, optimización de condiciones de ensayo como el tiempo de exposición, dilución de anticuerpo y la concentración de proteína es importante para la obtención precisa y reproducible resultados. En general, los siguientes procedimientos se deben realizar para optimizar un análisis para estos sistemas:

1) una pantalla se debe realizar para evaluar y elegir los anticuerpos para la señal y especificidad a la meta de proteína. Si está disponible, proteína purificada o epitopo de destino puede utilizarse para evaluar la especificidad; sin embargo, sigue siendo importante evaluar potencial señal inespecífica en proteína total proviene del sistema modelo.

2) a continuación, el rango dinámico del ensayo debe ser determinado. En una situación ideal, señal de doblar (medido mediante el área de pico) se observa como se duplica la concentración de la muestra; sin embargo, en la práctica, un cambio proporcional en la señal de entrada de manera predecible (p. ej., linear fit) es suficiente para la cuantificación de proteína. Además, esta optimización define la concentración de proteína con alta señal, pero todavía dentro del rango lineal para el modelo experimental.

3) determinar la concentración óptima del anticuerpo con la concentración de proteína fijo elegida en el paso 2 de la optimización. Como la concentración de anticuerpos aumenta, la señal aumenta hasta mesetas en saturación. Una concentración de anticuerpo cerca de este nivel de saturación es necesaria para una medición precisa de la concentración de la proteína.

El proceso utilizado para optimizar las concentraciones de proteína, las diluciones de anticuerpo y tiempos de exposición para un tamaño basado en el tubo capilar automatizado análisis⁶ se demuestra usando los extractos de células enteras aislados de BEAS-2B, un humano de SV-40 transformado bronquial línea de células epiteliales. Aislamiento de proteínas de los extractos de célula o tejido se puede realizar usando un número de protocolos publicados^7,8,9 y no se tratarán aquí. Resultados de un experimento de prueba usando las condiciones optimizadas son también registrados por total y fosforila p53 (serina 15, serina 20) en cultivos expuestos a doxorrubicina (un agente quimioterapéutico común que induce la apoptosis de la célula¹⁰) en 1.2, 1.8, y media de 2,4 μg/mL para 4 h antes de la cosecha. Las áreas de pico de p53 se normalizan para ɑ-tubulina, que se utiliza como un control de carga.

Nota: Asegúrese de que todos los reactivos y las muestras se preparan de acuerdo con el fabricante ' protocolo de s, se indica a continuación. Por favor, use equipo de protección personal apropiado durante este procedimiento, que incluye guantes de nitrilo, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad. Una tabla de materiales, reactivos y equipo necesario se suministra por separado. Concentración de proteína de las muestras debe determinarse previamente mediante metodologías establecidas que son compatibles con el lisado buffer utilizado, como el ensayo de Bradford ¹¹.

1. preparación de muestras y reactivos del paquete estándar como suministrado por el fabricante de

1. para preparar la solución de trabajo de 400 mM de Ditiotreitol (DTT), añadir agua desionizada μl 40 para el tubo transparente que contiene la stock suministrado por el fabricante. Es importante evitar la introducción de burbujas a la solución al mezclar la solución con lentos y suaves pipeteo.
2. Añadir 20 μl 10 X tampón y 20 μl de la solución preparada 400 mM TDT rosa tubo que contiene 5 fluorescente X master mix (véase la Tabla de materiales).
   Nota: El Master Mix (MM) es sellada por el fabricante con una cubierta de aluminio y debe ser traspasado por una punta de pipeta. Mezcla suavemente transfiriendo lento para evitar salpicaduras de TDT en la pipeta.
3. a continuación, añadir agua desionizada μl 16, suministra de 2 μl de 10 X tampón de muestra y 2 μl de la solución TDT preparado 400 mM blanco biotinilado escalera tubo suministrado por el fabricante. Mezclar suavemente y transferir a un tubo de 0.6 mL para desnaturalización.
4. Preparar 0.1 x tampón diluyendo el suministrado 10 X solución 1: 100 con agua. Preparar suficiente 0.1 x tampón para diluir todas las muestras de.
5. Calcular la cantidad de buffer de muestra x 0.1 que es agregado a una muestra, que dependerá de la concentración final deseada de la proteína total. Mezclar 1 parte 5 x fluorescente MM con 4 partes de muestra para conseguir la concentración final deseada diluida.
   1. Calcular volúmenes como sigue: (i) volumen 5 x fluorescente MM = (concentración de proteína final deseada) / 5; (ii) volumen de stock de proteína = (concentración de proteína final deseado x volumen Total necesario) / proteína accionario concentración; (iii) volumen 0.1 x buffer de la muestra = volumen Total - 5 x volumen m - proteína stock volumen.

2. Desnaturalización de las muestras y la escala

1. lugar preparado muestras y escalera biotinilado en un bloque de calor de 95 ° C por 5 min los tubos Vortex inmediatamente después de la incubación, ejecutar un giro de ~ 5 s en un lugar de hielo y centrífuga de mesa
   Nota: Algunas proteínas pueden exigir más condiciones de desnaturalización (p. ej., 70 ^o C durante 10 min) para evitar la agregación de la proteína y mejorar la migración en la matriz capilar. Considerar esta opción si hay manchas pesadas en los más altos pesos moleculares (ver video por ejemplo).

3. Preparación de anticuerpos

1. según lo determinado por la optimización (véase Resultados de representante y video), preparar el deseado añadir de anticuerpo primario (p. ej., 1:50, 1: 100) de los anticuerpos suministrados Diluyente 2.
   Nota: Los anticuerpos se utilizan generalmente en concentraciones más altas para inmunoensayo basado en el tubo capilar que por borrar occidental tradicional. El anticuerpo secundario suministrado está listo para usar sin dilución.

4. Preparación de Luminol-S y peróxido de

1. preparar una mezcla de 1:1 de luminol-S y peróxido de.
2. Vortex para mezclar y almacenar en hielo.
   Nota: Es importante que esta mezcla se prepara fresca para cada ensayo experimental. mezcla total 250ul se necesita para ejecutar un plato completo.

5. Preparación de la placa de ensayo

1. como se muestra en la figura 1, cargar las muestras y los reactivos preparados anteriormente en la placa de ensayo. Ver instrucciones detalladas a continuación para cada fila. Para minimizar la evaporación de los pozos, asegúrese que la tapa de la placa se sustituye entre adiciones de reactivo.
2. En fila A, pipeta de 5 μl de escalera biotinilado en A1 bien. Para la fila restante, pipeta preparado muestras (5 μl) en los pocillos A2-A25.
   Nota: Es imperativo que el A1 siempre contiene escalera, como el primer capilar en el cartucho está optimizado para ejecutar esta norma.
3. En fila B, pipetee 10 μl de anticuerpo diluyente 2 en cada pocillo (B1-B25).
4. En la fila C, pipetee 10 μl de anticuerpo diluyente 2 en pozo C1. En la fila restante C pozos, pipetee 10 μl de anticuerpo primario (pozos C2-C25).
5. En la fila D, pipetee 10 μl de estreptavidina-HRP en D1 bien. En la fila restante D pozos, pipetee 10 μl de anticuerpo secundario (pozos D2-D25).
6. En fila E, pipetee 10 μl de la mezcla recién preparada de peróxido de luminol en cada pocillo (E1-E25).
7. Por último, Añadir 500 μl de tampón de lavado por compartimiento a cada una de las filas del top 3 de los pozos de búfer.
   Nota: Es importante minimizar la formación de burbujas pipeteando suavemente y no expulsando el volumen final de la punta como burbujas pueden interferir con el tubo capilar carga y ejecutar.
8. Una vez que se cargan todos los pozos, centrifugar la placa a ~ 1000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar las burbujas y el líquido esté en el fondo de los pozos. Pop burbujas visibles con una pequeña pipeta o aguja limpia (p. ej., estéril de calibre 25 " top rep " aguja).

figura 1 . Plantilla de pipeteado para la placa de ensayo. Código de colores representa correctamente reactivos y las muestras (total hasta 24) añadidas a la placa de ensayo. Añadir biotinilado escalera a (naranja), bien A1 preparado muestras de pozos A2 hasta A25 (azul claro), anticuerpo 2 diluyente en los pocillos B1-B25 y C1 (verde claro), anticuerpo primario en los pocillos C2 hasta C25 (azul), estreptavidina-HRP a bien D1 (rosa oscuro), anticuerpo secundario para pozos D2 hasta D25 (verde oscuro) y la mezcla de peróxido de luminol en los pocillos E1 hasta E25 (morado). Tampón de lavado se añade a las primeras tres filas de la placa media grande pozos (azul oscuro). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. a partir del instrumento capilar inmunoensayo

1. Asegúrese de encienden el instrumento y el equipo que lo acompaña. No tiempo de calentamiento es necesario.
2. Abra el software de instrumentación en la computadora. En primer lugar, seleccione la " ensayo " ficha a la derecha de la ventana y " nuevo ensayo " bajo la " menú Archivo " a la izquierda. Seleccionar el tamaño, rango de tamaño (p. ej., 12-230 kDa) y cartucho de tipo (p. ej., tubo capilar 25) que fue utilizado para el ensayo particular.
   Nota: Una entrada también de mayo ensayo los parámetros, incluyendo la concentración de proteína, el tipo de anticuerpo y dilución, si lo desea, pero éstos no están obligados a iniciar el análisis.
3. Abrir la puerta en el instrumento presionando el botón en la parte superior del panel naranja.
4. Cuidadosamente Desembale el cartucho capilar. Sin tocar los tubos capilares de vidrio, coloque el cartucho en el soporte del cartucho. Verificar asientos de cartucho mediante la observación de la luz interior cambia de naranja a azul.
5. Sujetan firmemente sobre el Banco y retire cuidadosamente el sello de la evaporación de la parte inferior de la placa. Pop burbujas en estos pozos de matriz de separación con un smtodos los punta de la pipeta o aguja limpia (p. ej., estéril de calibre 25 " top rep " aguja).
6. Coloque la placa de ensayo en el sostenedor de la placa, asegurando que esté completamente colocado y cierre la puerta instrumento.
7. Haga clic en la " Inicio " en botón software.
   Nota: Si no aparece ningún botón de inicio, la conexión con el instrumento se ha perdido. Elegir el instrumento en el menú superior izquierdo, luego conecte. Debe aparecer una ventana emergente con el número de serie del instrumento; Seleccione esta opción, a continuación, haga clic en conectar. El botón de inicio debería aparecer ahora.
8. Cuando el plazo termine, deseche la placa. Quite el cartucho y coloque en un contenedor de objetos punzantes para su eliminación, junto con cualquier agujas que pueden haber sido usados para burbujas de pop. Deja el poder en para evitar problemas de conexión si se utiliza regularmente el instrumento (p. ej., al menos semanalmente).

7. Análisis de experimento

1. antes del análisis, garantizar que se realizan los siguientes controles de calidad.
   1. Estándares fluorescentes verificar seleccionando la " Mostrar normas " icono. Verificar que las normas están correctamente identificadas en la " vista gráfico " ficha. Si son incorrectas, ir a la " sola vista " icono, haga clic en el pico correcto y seleccione " estándar de fuerza ", o haga clic en el pico incorrecta y seleccione " no un estándar ". Realizar esta comprobación para cada tubo capilar nuevo.
   2. Verificar biotinilado escalera haciendo clic en el " muestras de " y " vista solo " los iconos. Seleccione la escalera en la ficha del experimento. Si un pico es incorrectamente, haga clic derecho sobre él en " vista gráfico " y seleccione " pico de quitar ".
      Nota: por ejemplo, la escalera biotinilado utilizada para el kit de kDa 12-230 debe mostrar 12, 40, 66, 116, 180 y 230 kDa picos de tamaño. Si no se realiza este paso, el tamaño de los picos muestra incorrectamente se calculará, producir falsos resultados.
   3. Ver y analizar los picos de la muestra. Obtener datos de la tabla de picos, como peso molecular, área de pico, altura máxima y señal a ruido (S/N), según sea necesario para los cálculos experimentales.

Tiempo de exposición - Burnout de señal de determinación

Quemadura de la señal puede ocurrir cuando el sustrato peróxido y luminol se agota demasiado rápido. Se puede determinar mediante el examen de los datos en tiempos de exposición distintos de la quimioluminescencia. En el software de análisis, vaya a "Editar – > análisis – > imágenes". Las exposiciones van desde 5 hasta 480 s. El eje y en un electroferograma informa/tiempo de la señal, por lo que los datos de cada exposición deben tener un coeficiente de tiempo de la señal similar. Este coeficiente disminuye con exposiciones prolongadas secuencialmente si luminol se convierte en agotados, como se ha visto con el p53-1 anticuerpo (figura 2). Por agotamiento del substrato, este ensayo puede considerarse medible hasta la concentración de μg/μl 0.2 sólo en las exposiciones de s 5-30. Por lo tanto, en este ejemplo, 15 s se determinó que el tiempo de exposición de análisis de datos óptima para p53.

Valoración de lisado - Determinar el rango dinámico lineal

Es importante que se tomen medidas dentro del rango dinámico lineal de cada ensayo, donde los cambios en la señal medida por el área de pico son proporcionales a los cambios en la cantidad de proteína en la muestra. Utilizando el tiempo de exposición óptimo de 15 elegidos de s en la sección anterior, se demuestra linealidad de ensayo para p53 y ɑ-tubulina durante más de una gama de 15 dobleces de concentración (figura 3). En nuestra experiencia, un valor de R2 de > 0.9 de una regresión lineal de ajuste se considera aceptable para un rango de dilución de la proteína purificada de cantidad conocida (si es una medida cuantitativa absoluta) o muestra lisado de proteínas objetivo desconocido (si ensayo es una medida cuantitativa relativa).

Optimización de dilución del anticuerpo

Usando los anticuerpos a saturar las concentraciones ayuda a asegurar que los cambios de señal medidos sean debidos a cambios en la cantidad de proteína. Como demostración, dos líneas de células BEAS-2B (0,2 μg/μl proteína total cargado en el ensayo) los extractos de células enteras se sondeaba con concentraciones de anticuerpos diluidos en serie ɑ-tubulina que van desde 1:25 - 1: 800 (figura 4). Señal quimioluminiscente (aquí, medida como área de pico) se traza contra la dilución del anticuerpo. Saturación fue observada cerca de la 1:50 donde la curva comienza una notable meseta de dilución.

Ensayo experimental - tratamiento de doxorrubicina en las células BEAS-2B

Usando las condiciones analíticas optimizadas, cultivo de células BEAS-2B fue tratado con tres diferentes concentraciones de doxorrubicina (1.2, 1.8 y 2.4 μg/mL) durante 4 h (figura 5, tabla 1). Activación de p53 a través de modificaciones poste-de translación media varias respuestas celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, senescencia y apoptosis12. Específicamente, la fosforilación de la serina 15 se ha atribuido a la activación transcripcional de p53, resultando en la apoptosis después de la doxorrubicina tratamiento13. En esta demostración, ɑ-tubulina normalizado pico áreas se presentan como doble del control. Curiosamente, 3.5 aumentos 4 veces en p53 fosforilación en serina se observaron incrementos de 15 y 2 veces en el nivel de p53 fosforilada en serina 20 después de la exposición de 4 h a la doxorrubicina. Estos resultados indican la activación de p53; sin embargo, no hay respuesta a la dosis se considera para las concentraciones elegidas (por el contrario, la dosis más baja probada produce la respuesta más alta). Total p53 no demostró una respuesta clara en este sistema de modelo. Previamente hemos observado la activación de la fosforilación de p53 en la ausencia de aumento de los niveles de p53 total bajo condiciones similares en tratados con zinc de las células BEAS-2B14.

Figura 2 . Comparación de exposición de imagen para detectar señales de agotamiento. Lane vistas mostrar disminución de las concentraciones de proteína para lisados de BEAS-2B sondeado con p53-1 anticuerpo a una dilución 1: 500. Coeficientes de señal QL, como alturas de pico en el software del instrumento, se superponen. A diferencia de las alturas de pico, las intensidades de la banda visual se generan automáticamente y ajustar el instrumento para facilitar la visualización de las bandas y no es comparable de un panel a otro. Tenga en cuenta la disminución en la señal de la quimioluminescencia como aumento del tiempo de exposición, con la señal comienza a desaparecer (split pico) en las dos exposiciones más largas, que indica agotamiento de sustrato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Valoración lisado que muestra las vistas de carril. Valoración lisado mostrando el carril considera (A) de BEAS-2B lisado cuando sondeado con 1: 500 p53-1 o 1:50 ɑ-tubulina. A diferencia de los valores de área de pico, las intensidades de la banda visual se generan automáticamente y ajustar el instrumento para facilitar la visualización de las bandas y no es comparable de un panel a otro. Análisis de regresión lineal (B) confirma que los análisis son lineales en toda la gama probada, de 0.01 a 0.20 μg/μl y 0.025 a 0.40 μg/μl, con valores de2 R de 0.999 y 0.985, respectivamente. Las concentraciones de proteínas totales en el medio de la gama lineal fueron escogidas para dar cabida a posibles variaciones de proteína objetivo en cualquier dirección (e.g., 0,2 μg/μl de α-tubulina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 . Curvas de dilución del anticuerpo α-tubulina para dos BEAS-2B separadas proteína lisados con y sin normalización de la línea de base. Una definitiva departura de linealidad se ve en el 1:50 (0,02) dilución, lo que indica saturación. 1:50, por tanto, fue elegida como la dilución óptima para este anticuerpo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Efecto del tratamiento con doxorrubicina (DXN) 4 h en total y la serina fosforilados expresión de la proteína p53 de las células BEAS-2B. Áreas de pico son normalizadas a α-tubulina y trazadas como doble del control (CTL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Efecto del tratamiento con doxorrubicina (DXN) 4 h en total y la serina fosforilados expresión de la proteína p53 de las células BEAS-2B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta mesa.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten. Este manuscrito ha sido revisado por la salud nacional y el laboratorio de investigación de efectos ambientales y aprobado para su publicación. El contenido no refleja necesariamente las opiniones de la EPA ni mención de nombres comerciales o productos comerciales constituye aprobación ni recomendación para su uso.