نموذج إصابة المورفولوجية في فيفو لدراسة نيوروريجينيريشن في الطرفية والجهاز العصبي المركزي
Summary
نقدم هنا، بروتوكول باستخدام المورفولوجية الحسية العصبية-نموذج الإصابة العصبية الجذعية أربوريزاتيون (دا)، الذي يجمع في فيفو يعيش التصوير واثنين-فوتون الليزر أكسوتومي/ديندريوتومي والأدوات الوراثية يطير قوية، منصة لفحص المروجين ومثبطات نيوروريجينيريشن المحتملة.
Abstract
ويحكم قدرة نمو الخلايا العصبية التالفة نيوروريجينيريشن واسترداد الفنية بعد الصدمة العصبي. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تحديد الذاتية والخارجية المثبطة العوامل المختلفة المشاركة في تقييد التجدد إكسون. ومع ذلك، ببساطة إزالة هذه الإشارات المثبطة لا تكفي للتجديد الناجح، مما يشير إلى وجود إليه تنظيمية إضافية. وتشاطر melanogaster المورفولوجية، ذبابة الفاكهة، الجينات تقحم المصانة ومسارات الإشارات مع الفقاريات، بما في ذلك البشر. الجمع بين الأدوات الوراثية قوية من الذباب بالليزر اثنين-فوتون أكسوتومي/ديندريوتومي، ونحن تصف هنا العصبية الحسية المورفولوجية – نموذج الإصابة العصبية الجذعية أربوريزيشن (دا) كمنصة للفحص بشكل منتظم للرواية تجديد المنظمين. بإيجاز، يتضمن هذا النموذج أ) إعداد اليرقات، وتحريض ب) الآفة إلى dendrite(s) أو axon(s) استخدام الليزر اثنين-فوتون، ج) يعيش [كنفوكل] التصوير بعد الإصابة ود) تحليل البيانات. لدينا نموذج يمكن استنساخه بشدة إصابة واحدة من الخلايا العصبية المسماة ومحاور عصبية و dendrites من الأنواع الفرعية العصبية محددة تحديداً جيدا، في كل من الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي.
Introduction
عجز محاور عصبية لتجديد بعد إصابة الجهاز العصبي المركزي (CNS)، قد تؤدي إلى الإعاقة الدائمة في المرضى، وتلعب أيضا دوراً في العجز العصبية لا رجعة فيها في أمراض الأعصاب1،2 3، ،،من45. البيئة الجهاز العصبي المركزي، فضلا عن القدرة الجوهرية نمو الخلايا العصبية، تحديد ما إذا كانت محاور عصبية قادرة على تجديد بعد الصدمة. عوامل خارج الخلية من أوليجوديندروسيتي، أستروجليال، ومصادر الليفية قد ثبت أن تعوق نمو الخلايا العصبية4،6،،من78، ولكن القضاء على هذه الجزيئات يسمح فقط لمحدودة تنتشر5. يمكن أن تؤثر على نجاح التجدد5،9 إشارات التجديد الأصيلة وتمثل الأهداف العلاجية المحتملة، ولكن هذه العمليات التي لا تزال غير واضحة المعالم على المستوى الجزيئي. يمكن أن تؤدي الزيادات في إشارات العوامل التغذوية أو القضاء على الفرامل الذاتية، مثل الفوسفاتيز فتن10، تجديد محواري في ظروف معينة. تركيبات من الأساليب المختلفة التي وجدت لتكون فعالة على حدة أيضا إلا تقديم الإنعاش عموما محدود حتى الآن11،12،،من1314. ولذلك، هناك حاجة ماسة لتحديد مسارات إضافية للعلاج المستهدفة. بالإضافة إلى الشروع في إعادة نمو محور عصبي، وكيفية إعادة الأسلاك إلى الهدف الصحيح، إصلاح المشبك خصوصية، محاور عصبية وتحقيق الانتعاش وظيفية هي الأسئلة الهامة.
وباختصار، لا يزال الفهم الحالي لجهاز إملاء التجدد إكسون مجزأة جداً. جزء من المشكلة هو صعوبة التقنية دراسة إكسون التجدد في الثدييات في الوقت الحقيقي، ونهج التي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحديا لإجراء الشاشات الوراثية على نطاق واسع. من ناحية أخرى، melanogaster المورفولوجية، ثبت أن نظام استثنائي قوية لدراسة المسائل البيولوجية المعقدة. ذبابة الفاكهة كانت مفيدة في تحديد الجينات وإشارات المسارات التي يتم المحافظة عليها لافت للنظر في البشر وكان نموذجا ناجحاً لدراسة الظروف البشرية، مثل أمراض الأعصاب، من خلال أدوات هائلة في مجال علم الوراثة الجزيئي المتاحة للتلاعب بالجينات الدالة15. وتعتبر ذبابة الفاكهة على وجه الخصوص، لتكون أداة مثالية لاكتشاف الجينات المشتركة في الإصابة العصبية ونمو15،16. -تم تطوير نماذج الإصابة العصبية يطير عدة، بما في ذلك الرأس بالغ أو اليرقات البطني العصب الحبل (فنك) طعن بالإبر، فنك اليرقات أو سحق العصب مع الملقط، العصبية اليرقات أكسوتومي الليزر، وإزالة الخلايا العصبية مستقبلات الشم، إصابة explants الدماغ، والآفة الأعصاب الطرفية بالجناح قطع15،17،،من1819،20،21،،من2223. المثير، تقدمت الأخيرة العمل استخدام المورفولوجية نماذج الإصابة فهمنا للمسارات الخلوية والوراثية المستخدمة من قبل الجهاز العصبي للاستجابة للإصابات العصبية، البعض منها قد ثبت أن تكون حفظت في الثدييات24 ،25. مرة أخرى، وهذا يؤكد فائدة هذا الكائن نموذج لتحديد آليات الرواية لإصلاح العصبية.
الموصوفة هنا اثنين-فوتون الليزر المورفولوجية العصبية حسية يرقات إصابة نموذج يستند. كان أول من استخدم ليزر اثنين-فوتون قطع محاور عصبية في الزرد في فيفو في 200326. في نفس العام، أجرى ديندريوتومي الليزر الأول في المورفولوجية استخدام ليزر النبضي نيتروجين27. بعد ذلك بقليل، يستخدم عدد من معامل C. ايليجانس ليزر femtosecond لوضع نماذج ل التجدد إكسون28. في عام 2007، وو والزملاء مقارنة والإبلاغ عن الاختلافات بين إصابات الليزر في C. ايليجانس الناجمة عن أنواع مختلفة من أشعة الليزر29. في عام 2010، تبين إكسون التجديد بعد الليزر أكسوتومي أول مرة تحدث في المورفولوجية30. بناء على هذا الأدب إصابة ليزر مكثفة، قمنا بتطوير نموذج إصابة العصبية يطير باستخدام الليزر اثنين-فوتون، الذي يسمح تعريفية دقيقة الإصابة إلى المواقع المستهدفة مع اضطراب الحد الأدنى من الأنسجة المجاورة، توفير بيئة نظيفة نسبيا نظام لدراسة الخصائص الذاتية والخارجية كلا من نيوروريجينيريشن مع القرار خلية واحدة. على وجه التحديد، أنشأنا مجموعة من الأساليب إصابة للخلايا العصبية الحسية أربوريزيشن الجذعية (دا) في كلا الجهاز العصبي المحيطي (PNS)، والجهاز العصبي المركزي. يمكن تجميع الخلايا العصبية دا في أربع فئات متميزة تتميز أساسا بتعقيداتها التفريع تغصن: الفئة الأولى إلى الرابع31. أعمالنا المنشورة يوضح أن تجديد الخلايا العصبية دا يشبه نماذج إصابة الثدييات على المستوى الجزيئي والمظهرية: الخلايا العصبية دا عرض خصائص فئة محددة التجدد، مع الفئة الرابعة ولكن لا الطبقة الأولى أو الخلايا العصبية دا الثالث العارضة التجدد في السندات الإذنية؛ الفئة الرابع دا محاور عصبية العصبية تجديد قوة في المحيط، ولكن إمكاناتها التجدد يتم تقليل كبير في الجهاز العصبي المركزي، وهكذا تشبه الخلايا الجذرية الظهرية العقدة (DRG) العصبية في الثدييات؛ تعزيز النشاط mTOR عبر فتن الحذف أو Akt overexpression يعزز تجديد إكسون في الطيران والملاحة والمراقبة19. استخدام هذا النموذج الإصابة، قد تم أداء شاشات الجينية، وحددت الإنزيم تجهيز الجيش الملكي النيبالي Rtca كعامل مثبطة تقحم مصانة للتجدد إكسون، ربط إكسون الإصابة بالإجهاد الخلوية وتعديل الحمض النووي الريبي20 .
في النموذج المقدم، وهو الناجم عن الإصابة عن طريق الليزر أكسوتومي/ديندريوتومي من فئة اليرقات الرابع أو الثالث دا الخلايا العصبية، المسمى ppk-CD4–تدجفب أو الريبو UAS-CD4–تدجفب،، 19-12-Gal4-Gal80، على التوالي. تتم الإصابة على 2nd ليرقات الطورrd 3 في حوالي 48-72 ساعة بعد بيضة زرع (ح AEL). للسندات الإذنية يستهدف أكسوتومي الآفة إلى المقطع من محور عصبي ~ 20-50 ميكرون بعيداً عن جسم الخلية, أكسوتومي الجهاز العصبي المركزي إلى منطقة ~ 20 ميكرومتر في القطر عند تقاطع كوميسوري في فنك، وديندريوتومي إلى النقاط فرع الجذعية الأولية. يتم تصويرها العصبية نفسها في 8-24 ساعة بعد الإصابة (منظمة العفو الدولية) لتأكيد ترانسيكشن كاملة، وفي ح 48-72 منظمة العفو الدولية لتقييم التجدد. من خلال الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، يمكن رصدها بالانحطاط والتجديد لكل محاور عصبية/dendrites التي تم المصابين في فيفو على مر الزمن.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند تقاطع إعداد الطيران، يمكن أن تختلف عدد الإناث والذكور المستخدمة تبعاً الأنماط الجينية وعدد اليرقات بحاجة لإجراء تجارب محددة. لوزن الذباب، يستخدم الصليب النموذجية 10 من الإناث والذكور 5. وقد ضاقت الإطار مجموعة، تبعاً لدقة سن اليرقات المطلوبة. على سبيل المثال، سوف تسفر عن فترة جمع 2-ح يرق…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر جيسيكا جولدشتيين لتقديم الدعم التقني. العمل في مختبر أغنية تموله المنحة المعاهد الوطنية للصحة R00NS088211، والفكرية وجائزة تنمية البرنامج الجديد مركز البحوث العاهات الخلقية (إيدرك).
Materials
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
Referencias
- Yakura, J. S. . Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?. Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
