Impacto de las neuronas intracardiacas sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis en un sistema de Langendorff Ex Vivo

El sistema de Langendorff ex vivo de la perfusión del corazón sigue siendo una herramienta relevante para la realización de un amplio espectro de fisiológicos, bioquímicos, morfológicos, y los estudios farmacológicos en forma centralizada denervado corazones^{1,2 ,3,4,5} desde su invención en los finales del siglo 19 de^{th 6}. Hasta la fecha, este sistema sigue siendo ampliamente utilizado para diversos temas (por ej., isquemia reperfusión) o estudiar cardiaca farmacológica efectos^7,8y es una herramienta básica en la investigación cardiovascular. La longevidad de este método resulta de varias ventajas (por ej., las mediciones se realizan sin la influencia del sistema nervioso central u órganos, circulación sistémica o circulación de las hormonas). Si es necesario, productos farmacéuticos pueden agregar en forma controlada al buffer de perfusión o aplicados a estructuras específicas directamente. Los experimentos son reproducibles, y un número relativamente alto de experimentos se puede realizar en un corto período de tiempo. El carácter abierto (en parte) de la configuración puede hacer difícil regular la temperatura y debe tenerse en cuenta. Aunque el sistema de Langendorff también se utiliza en grandes especies⁹, animales más pequeños se utilizan sobre todo como el montaje experimental es menos complejo y una mayor variabilidad biológica (e.g., transgénicos modelos del ratón) puede ser utilizado.

En la configuración experimental de este protocolo, la influencia del intracardiaco sistema nervioso autónomo en parámetros electrofisiológicos básicos, arritmogénesis ventricular, epicárdica conducción y dinámica del monofosfato de adenosina cíclico (campo) es evaluados. Un gran número de ganglios intracardiacos, que se encuentran principalmente en los cojines gordos atriales y ahora son bien conocidos para el control de electrofisiología cardíaca independiente de control neural central, son que ya sea a la izquierda intacto o quitado manualmente con cuidado mecánico disección. Una modulación farmacológica del sistema nervioso autónomo se realiza globalmente mediante la adición de productos farmacéuticos en el búfer de perfusión o localmente por la modulación específica de los ganglios auriculares. Después de los experimentos, los corazones son muy adecuados para una evaluación immunohistological como se han eliminado todas las células de la sangre debido a la perfusión continua, que puede aumentar la calidad de la coloración.

El objetivo general de las técnicas descritas es ofrecer nuevas perspectivas de estudios detallados sobre el impacto del sistema nervioso autónomo sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis en el corazón de ratón. Una razón para utilizar esta técnica es que es posible estudiar y alterar el sistema nervioso autónomo sin el impacto del sistema nervioso central. Una ventaja importante es el fácil empleo de experimentos farmacológicos, en que pro - o antiarrítmico propiedades potenciales de viejos y nuevos agentes pueden ser probados. Además, modelos con ratones transgénicos y knockout de diversas enfermedades cardiacas están disponibles para investigar los mecanismos subyacentes de arritmias, insuficiencia cardíaca o enfermedades metabólicas. Este enfoque ha mejorado nuestra comprensión de cómo pueden afectar el sistema nervioso autónomo en el nivel atrial ventricular electrofisiología cardíaca y la inducción de arritmias.

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por las autoridades locales del estado de Hamburgo, los comités de uso y cuidado Animal de la Universidad de Hamburgo.

1. preparación del aparato Langendorff

Nota: Se utiliza un sistema de perfusión de Langendorff comercialmente disponible.

1. Preparar una solución de Krebs-Henseleit modificada (119 mM de cloruro de sodio, 25 mM de bicarbonato de sodio, 4,6 mM de cloruro de potasio, 1,2 mM de fosfato de potasio monobásico, 1,1 mM de sulfato de magnesio, 2.5 mM de cloruro de calcio, 8,3 mM de glucosa y 2 mM de sodio piruvatocinasa). Añadir una mezcla de 95% oxygen/5% de dióxido de carbono a la solución de perfusión para evitar la precipitación de calcio. Filtrar el solución tampón con un tamaño de poro de 0,22 μm.
2. Añadir a un agente farmacológico en el búfer para investigar su efecto sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis según sea necesario.
3. Iniciar el baño de agua y coloque la solución de perfusión, incluyendo una mezcla de dióxido de carbono 95% oxygen/5% en él. Ajustar la temperatura del baño María, para que la temperatura de la solución de perfusión directamente antes de la cánula es de ~ 37 ° c.
4. Arranque la bomba de rodillo y llene el aparato con la solución de perfusión tan pronto como se alcance la temperatura correcta.
5. Ajustar la velocidad de la bomba antes de colocar el corazón, por lo que no quedan burbujas de aire en la cánula al montar el aparato.

2. hard - y Software

1. Conectar un sistema de adquisición de datos digitales y su software correspondiente al aparato Langendorff para un registro continuo de la presión de perfusión, flujo y frecuencia cardíaca.
   1. Ajustar la presión de perfusión específica en la configuración general a 80 mmHg.
   2. Iniciar la grabación.
2. Utilizar un catéter de electrofisiología (Tabla de materiales) con electrodos de platino, una superficie de electrodo de 0,5 x 0,5 mm y un espaciamiento de electrodo de 0,5 mm para la grabación de datos y la estimulación con un generador de estímulo digital señalado.
   1. Coloque el catéter cerca de la zona donde se colocará el corazón después de la fijación en el aparato.
   2. Preparar la estimulación seleccionando 2 electrodos en el catéter y utilizar una longitud de ciclo del ms 100.

3. preparación del corazón

1. Añadir el frío (~ 2-4 ° c) tampón de perfusión (10-20 mL y 40-50 mL, por lo que se cubre el plato entero) las 2 cajas Petri (diámetro de 6 cm y 10 cm) y el plato con la cánula y el lugar en hielo directamente siguiente y bajo el microscopio. Preparar un nudo doble alrededor de la cánula.
2. Suprimir rápidamente el corazón después de la dislocación cervical al abrir el tórax utilizando tijeras de Mayo y pinzas de estrecharlo. Entonces agarre la aorta y la vena cava por encima del diafragma con el fórceps de Londres y suprimir el bloque de corazón y pulmón, cortando todos los vasos y del tejido conectivo cerca de la columna vertebral con las tijeras de estrabismo.
3. Transferir el bloque de corazón y pulmón en el primer plato (6 cm diámetro) con el tampón de helada y retire con cuidado los pulmones sin dañar el corazón mediante el uso de estrabismo tijeras y pinzas de Londres. Luego coloque el corazón bajo el microscopio y con cuidado quitar el timo, el esófago y la tráquea mediante resorte tijeras y pinzas Dumont SS.
4. Utilice las tijeras del resorte para cortar un agujero de 1.5-2 mm en la parte superior de la aurícula derecha para la inserción del catéter. Corte un agujero en la arteria pulmonar. Luego la aorta directamente bajo las ramas supraaortic y extirpar el tejido de la aorta, por lo que el nudo se puede conectar fácilmente.
5. Mantener el auriculares cojines gordos, incluyendo las principales atrially encuentra plexi Enterico, alrededor del atrio izquierdo intacto o eliminarlos completamente por disección cuidadosa.
6. Transferir el corazón en el plato con la cánula y colocarlo bajo el microscopio. Tire de la aorta en la cánula con las pinzas Dumont SS y nudo dispuestos alrededor de la aorta. Asegúrese de que la cánula no se coloca muy profundo en la aorta para que se dejan libres la válvula aórtica y los vasos coronarios.
7. Sujetar la cánula rápidamente al aparato Langendorff. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja en la cánula.
8. Interruptor de la presión de perfusión a 80 mmHg, lo que permite una perfusión de presión constante.
9. Inserte con cuidado el catéter en la aurícula derecha y ventrículo derecho sin tocar ni dañar el corazón y conectar el catéter a la cánula con la cinta.
10. Iniciar la estimulación con la duración del ciclo preparado de 100 ms durante un período de equilibrio inicial de 20 minutos.
11. Cerca de la cámara para permitir una temperatura estable.

4. arritmogénesis y parámetros electrofisiológicos

1. Aplicar un estímulo programado vía los electrodos proximal o distales del catéter en dos veces el auricular o ventricular estimulación umbral para evaluar los parámetros electrofisiológicos, como se describe en los pasos siguientes.
   1. Determinar el tiempo de recuperación del nodo sinusal como la longitud de ciclo máximo de retorno después de 10 s de estimulación en una longitud de ciclo S1S1 de 120 ms, 100 ms y 80 ms con tasa fija.
   2. Determinar el punto de Wenckebach como la mayor longitud de ciclo S1S1 (8 estímulos; S1S1: 100 ms; reducción gradual de 2 ms) con una pérdida de 11 conducción nodal AV. Determinar los períodos refractarios nodales auriculoventriculares como la más larga S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, 110 ms y 100 ms; un corto acople extraestímulo con una reducción gradual de S1S2 de 2 ms) con una pérdida de la conducción nodal AV.
   3. Determinar los períodos refractarios auriculares y ventriculares como la más larga S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, 110 ms y 100 ms; un corto acople extraestímulo con una reducción gradual de S1S2 de 2 ms) con una respuesta ventricular o atrial ausente^10,11.
2. Realizar un extrastimulation programado (S1S1: 120 ms, 100 ms y 80 ms, seguidos por un máximo de 3 golpes extras; 60-20 ms con una reducción gradual de 2 ms) o ráfaga protocolos de estimulación (5 s en S1S1: 50-10 ms con una reducción gradual de 10 ms) conforme a los convenios de Lambeth a eva luate la arritmogénesis ventricular^10,11,12.

5. las medidas de conducción epicárdico

Nota: Registro unipolar epicárdicos electrogramas mediante un sistema de grabación informática 128 canales con una frecuencia de muestreo de 25 kHz para la cartografía de alta resolución. Usar una matriz multi-electrodo 32 (MEA; distancia entre electrodo: 300 μm; 1,8 x 1,8 mm). Nota que los datos eran banda filtrada (50 Hz) y digitalizan con 12 bits y un rango de señal de 20 mV.

1. Coloque el MEA en la zona del corazón y añadir a la tierra a otra parte del corazón^13,14,15.
2. Coloque un catéter de estimulación epicárdica cerca el MEA y comenzar una estimulación constante.
3. Iniciar la grabación después de la confirmación del buen contacto de los electrodos por comprobación de la calidad de la señal y la amplitud.
4. Utilizar un análisis fuera de línea para la determinación de la velocidad de propagación de la onda y la dispersión en la dirección de conducción.

6. traste de transferencia de Förster Resonancia energética basada en cíclico del monofosfato de adenosina (campo) la proyección de imagen

Nota: Para medidas basadas en el traste, cosecha de corazones de ratones transgénicos de CAG-Epac1-campos¹⁶.

1. Utilizar un sistema de imagen auto construido alrededor de un estereomicroscopio^15,17.
2. El estereomicroscopio frente el corazón y ajuste de agudeza.
3. Excitar el campo sensor con una fuente de luz [por ejemplo, utilizar una sola longitud de onda diodo electroluminoso (440 nm)]. Dividir la emisión ligera en donante y receptor de canales usando un divisor de viga (para un par de proteína fluorescente de la proteína fluorescente cian/amarillo, uso un 565dcxr espejo dicroico y filtros de emisión D480/30 y D535/40).
4. Garantizar una temperatura estable por poner una envoltura de plástico alrededor de la cámara.
5. Tomar imágenes utilizando una cámara científica metal-óxido-semiconductor complementario (sCMOS). Coordinar la fuente de luz y la cámara de captura de imágenes con un software como Micro-administrador de imágenes de código abierto.
6. Para iniciar la adquisición de la imagen, presione Multi-D Acq. botón y configurar un time-lapse, que adquiere una imagen cada 10 s, con el tiempo de exposición adecuado, que depende de la fuerza de la señal fluorescente (alrededor de 100 ms).
7. Utilice el previamente descrito y disponible en línea del traste y traste 2 online plugins¹⁷ a dividir la imagen en dos canales, seleccione las regiones de interés y supervisar el seguimiento de la relación.
8. Durante la adquisición, inundar el corazón con la solución de Krebs-Henseleit modificada que contiene diferentes sustancias, dependiendo de la naturaleza del experimento.
9. Al final del experimento, apague la compra presionando el botón Stop y guarde la pila de imágenes.
10. Analizar los datos de traste fuera de línea utilizando un software de análisis dedicada que puede dividir imágenes en dos secciones idénticas de los canales del donante y del aceptador y puede realizar análisis de traste en varias regiones de interés.
    Nota: Una dedicada plug-in (traste fuera de línea) es necesario, que se proporciona en Sprenger et al. ¹⁷.
    1. Inicie el software. Abierto el análisis por ir al menú de Plugins , haga clic en microgerentey después en Abrir el archivo Micro Gerente.
    2. Ejecutar el plugin offline del traste para dividir el Time-lapse en dos imágenes idénticas para los canales PPC y YFP.
    3. Utilice la herramienta Selección a mano alzada para marcar la región de interés en la imagen YFP. Presione el botón Agregar para añadir la selección a la ventana Multi medida .
    4. Elija la región de interés en la ventana Multi medida y pulse Multi para obtener una tabla con valores promedio de gris para cada marco y de la región. Copiar y pegar todos los datos en una hoja de Excel.
    5. Haga clic en la imagen pila de PPC. Realizar las mismas acciones que en el paso 6.10.4 para la pila de PPC y pegar los valores promedio de gris en la misma hoja de Excel.
11. Corregir los datos en bruto sin conexión para el factor de repintado del donante en el receptor canal¹⁷.
    1. Utilice la siguiente fórmula, donde B es el factor de repintado:
       Cociente = (YFP - B x CFP) / PPC
    2. Determinar el factor de repintado B por proyección de imagen un corazón expresando sólo PPC y medir el porcentaje de la fluorescencia del donador en el canal YFP (B = YFP / PPC).

7. Neuromorfología

Nota: Analizar intracardiaco sistema nervioso autónomo mediante immunostainings todo montaje de corazones murino intacto. Tenga en cuenta que la mayoría de los ganglios intracardiacos se localiza en el tejido adiposo epicárdico cerca de las venas pulmonares.

1. Utilizar los stainings diferentes para la representación de neurofilamentos (general estructuras neuronales; pollo anti-NF-H, 1:3, 000), tirosina hidroxilasa (TH, estructuras neuronales simpáticas; conejo α TH, 1:1, 000) y la colina acetiltransferasa (ChAT, parasimpático estructuras neuronales; α de cabra ChAT, 1:50).
2. Después de la perfusión en el aparato Langendorff, arreglar los corazones de ratón en 10 mL de formalina durante 24 h y almacenarlas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° c.
3. Bleach los corazones en lejía de Dent (4:1:1 metanol: solución de peróxido de hidrógeno al 30% (w/w) en H₂O: dimetil sulfóxido (DMSO)) durante 1 semana a 4 ° c y rehidratarlos posteriormente a PBS en una serie de descenso metanol en PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) ¹⁸.
4. Realizar las incubaciones siguientes en un formato de placa de 24 pozos con una suave agitación a 4 ° c:
   1. Permeabilizar los corazones en 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) para 3 x 1 h a temperatura ambiente antes de bloqueo durante la noche en una solución amortiguadora de bloqueo [5% albúmina de suero bovino (BSA) / PBS-T + azida sódica al 0,2%].
   2. Diluir los anticuerpos como sigue: α cabra ChAT (1:50), conejo α de (1:1, 000), del neurofilament pollo α (1:3, 000); anticuerpos secundarios para etiquetado fluorescente (1: 500; o según las instrucciones del fabricante); anticuerpos secundario biotinilado etiquetado cromogénicos (1: 200; o según las instrucciones del fabricante).
5. Incubar a las muestras en anticuerpos primarios diluidos en una solución amortiguadora de bloqueo durante 1 semana a 4 ° c.
6. Lave los corazones 3 x 15 min en PBS-T antes de la incubación del anticuerpo secundario en una solución amortiguadora de bloqueo durante 4 días.
7. Lavar los corazones 3 x 15 min en PBS-T y almacenarlas en un medio de montaje para la tinción fluorescente de 3 h a temperatura ambiente o usar un kit de detección complejo avidina-biotina según las instrucciones del fabricante.
8. Pre-incubar los corazones para 1 h en un almacenador intermediario comercial para 3, 3'-diaminobenzidina (DAB), antes de desarrollar bajo un control visual en un búfer que contiene el lenguado según las instrucciones del fabricante.
9. Almacenar a las muestras en agua bidestilada.
10. Para secciones de parafina, deshidratar e incrustar los corazones en parafina.
    1. Corte secciones de 4 μm de espesor y Desparafinizar según procedimientos rutinarios del laboratorio. Si y cómo recuperación de antígeno debe realizarse debe establecerse para cada instalación individual ya que depende de la combinación del anticuerpo.
    2. Permeabilizar las secciones de 10 min en 0,2% Tritón X-100/Tris-tampón salino (TBS), seguido de lavados 3 veces, 5 minutos en TBS.
    3. Bloque con 3% BSA/TBS por 1 h a temperatura ambiente.
    4. Incúbelos durante la noche a 4 ° c [anticuerpos primarios: cabra α ChAT (1:50), TH α de conejo (1: 500), pollo neurofilament α (1:1, 000)] o 2 h a temperatura ambiente (marcado con fluorescencia de anticuerpos secundarios, 1: 500) en el 1% BSA/TBS con 3 x 5 min lava TBS en el medio.
    5. Añadir 1 μg/mL de bisbenzimide H33342 trihydrochloride a la solución de anticuerpo secundario o utilizar un método de tinción nuclear diferente.
    6. Montar las diapositivas en un medio de montaje para la tinción fluorescente.

La figura 1 muestra una imagen de la configuración de Langendorff incluyendo 2 electrodos múltiples órdenes (MEAs). Antes del experimento, el catéter intracardíaco se coloca cerca de la cánula para facilitar una inserción rápida y fácil en el ventrículo derecho aurícula derecha y para un corto período de tiempo hasta que el equilibrio puede empezar. La parte inferior de la cámara puede ser aumentada (ver las flechas en la figura 1) para que la cámara está totalmente cerrada y garantiza una temperatura estable.

Figura 2 muestra los stainings cardiacos representativos diferentes. En la figura 2A una hematoxilina y eosina (H & E) tinción de una sección de la parafina se presenta. En la ampliación de ejemplar (figura 2B), una tinción inmunohistoquímica del ganglio auricular uno demuestra las células predominantemente parasimpáticas (rojo, ChAT positivo) en comparación con menos numerosas células simpáticas (verde, TH positivo). En la figura 2-E una coloración de immunohistochemical de nervios (figura 2, verde, neurofilamentos) y fibras comprensivas (Figura 2D, rojo, TH) así como la superposición de las dos imágenes (Figura 2E) describe cómo nerviosas fibras recorrer desde las aurículas a través del seno coronario hacia los ventrículos posteriores.

La figura 3 muestra el murino corazón conectado a la cánula del aparato Langendorff con un catéter octapolar insertado en la aurícula derecha y ventrículo derecho y una matriz de multi electroda epicárdica (MEA) colocado en el ventrículo izquierdo anterior ( Figura 3A). Sensibilidad a arritmia ventricular a través de los electrodos en Vd se presenta en la figura 3B. La inducción de una taquicardia ventricular en corazón ocurrió más con frecuencia después de la desnervación parcial de auricular. En el MEA ampliado (figura 3) se presenta el diseño esquemático de los electrodos. Es importante asegurar un contacto epicárdico estable de todos los electrodos. En la figura 3D se representa la conducción epicárdica fuera analizado por un MEA.

La figura 4 muestra mediciones de traste en todo corazón retrogradely siendo perfundido en el aparato de Langendorff. Diferentes zonas del corazón pueden ser analizadas como sea necesario (Figura 4A). Una aplicación tópica tanto global como local de productos farmacéuticos es fácilmente posible en esta configuración (Figura 4B).

Figura 1: configuración de Langendorff incluyendo electrodos múltiples arreglos de discos (MEAs). El catéter octapolar estimulación y grabación se coloca cerca de la zona en la que se unirá el corazón. La parte inferior de la cámara se moverá hacia arriba (flechas blancas) después de que el corazón se ha colocado en el aparato para garantizar una temperatura estable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: cardiaco todo Monte stainings con partes del sistema nervioso autónomo. A) representación de un cardiaco H & parafina teñida E sección (escala de la barra 1 mm). B) una ampliación ejemplar de un immunohistochemically manchadas del ganglio auricular muestra las células predominantemente parasimpáticas (rojo, ChAT positivo) en comparación con menos numerosas células simpáticas (verde, TH-positivo; escala de la barra 75 μm). C-E) Los stainings de immunohistochemical de la representante de nervios (Figura 2, verde, neurofilamentos, NF) y fibras comprensivas (Figura 2D, rojo, TH y su superposición en la Figura 2E) recorrer desde las aurículas a través del seno coronario (CS) hacia el ventrículos posteriores. Fibras ejemplares están marcadas por las puntas de flecha. Asteriscos indican los ganglios atriales. Escala de la barra 1 mm. LA, aurícula izquierda; LV, ventrículo izquierdo; NF, neurofilament; PV, las venas pulmonares; RA, aurícula derecha; RAA, orejuela derecha; RV, ventrículo derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 3: Intra - y epicárdicas mediciones utilizando la configuración de Langendorff. A. este panel muestra un ejemplo de un corazón murino dentro del sistema de Langendorff. El catéter octapolar intracardiaco, que se inserta en una matriz de multi electroda epicárdica (MEA), la aurícula derecha y ventrículo están representados. B. arritmia mediante las pruebas de susceptibilidad burst estimulación sin (control) o con la inducción de una uno mismo-terminar la taquicardia ventricular [después de la desnervación parcial de auricular (PAD)] se representan. C. MEA epicárdico es representado con una ampliación de la disposición del mismo electrodo. D. velocidad de propagación de la onda se analizó utilizando un software a medida. La distancia entre la isócronas es 2 m/s. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: traste las mediciones en una configuración de Langendorff. A. los dos differentcAMP biosensor fluorescencia canales [proteína amarilla fluorescente (YFP) y proteína fluorescente ciánica (PPC)] durante las mediciones de traste en el corazón de perfusión retrógrada son representados. Si es necesario, pueden analizarse diferentes partes del corazón (p. ej., aurícula y ventrículo) (barra de escala: 1 m m). B. este panel muestra un experimento representativo de traste, que mide los niveles de campo durante una estimulación farmacológica en la aurícula y el ventrículo izquierdo. En primer lugar, el corazón sistémico fue inundado con el activador de la ciclasa del adenylyl NKH477, un analogon forskoline, a aumentar los niveles de cAMP. Luego nicotina fue aplicada tópicamente y dirigida a los ganglios atriales, que agudo redujeron niveles de campo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.