Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

La reprogramación metabólica ha sido identificado en muchas enfermedades neurológicas, incluyendo Glioblastoma Multiforme (GBM), enfermedad de Huntington y desorden depresivo importante (MDD)^1,2,3. Como metabolismo se convierte en el foco de las estrategias terapéuticas, herramientas para la investigación metabólica básica han avanzado. Sin embargo, la mayoría de estos métodos fueron diseñada para el estudio de líneas celulares y células primarias o analizar grandes tejidos posteriores a la fijación o - congelación. Algunos enfoques han dependido de los kits a medida simplista metabolitos específicos, mientras que otros han utilizado más costosos y complejos análisis utilizando cromatografía en combinación con la espectrometría de masas⁴ para el mismo objetivo. Para entender el paisaje metabólico mayor,^5,6 y el análisis de flujo metabólico de perfiles metabólicos (MFA)⁷ surgió para complementar los estudios de Genómica proteómica a gran escala. Perfiles proporciona una representación cuantitativa de los metabolitos de una célula o tejido en un punto en el tiempo, mientras que la AMF se amplía sobre esto por que permite el seguimiento de los metabolitos marcados en el tiempo. Esta última ha sido útil en revelar cómo las fuentes de energía se utilizan diferentemente en una célula o tejido en un estado de enfermedad⁸. Sin embargo, estos métodos incluyen la medición de la tasa metabólica en general.

Para interrogar el estado metabólico general de los sistemas de modelo pequeño, métodos tradicionales, como el electrodo de Clark⁹ y¹⁰de la calorimetría indirecta, pueden ser utilizados para medir el consumo de oxígeno o configurados para parada de respirometría de flujo, a medir la concentración de dióxido de carbono y oxígeno respectivamente. Estas técnicas, ofreciendo con precisión conocer la lectura de reprogramación metabólica a nivel de organismo, tienen limitaciones. El uso del electrodo de Clark puede ser técnicamente difícil y no está diseñado para estudios de alto rendimiento. El respirómetro de flujo de parada no puede funcionar con la sensibilidad necesaria para análisis de células o tejidos. Hace varios años, la nueva tecnología fue desarrollada específicamente para estas pequeñas aplicaciones¹¹. Estos instrumentos fueron diseñados inicialmente para medir el consumo de oxígeno y la acidificación extracelular de líneas celulares y células primarias en un formato de 24 o 96 pocillos. La simplicidad de la configuración y datos de salida había establecido este método como alternativa a los enfoques tradicionales. Esta metodología es una herramienta poderosa para las células, y los avances recientes han permitido la medición de tejido golpes^12,13,14. Sin embargo, los métodos utilizados en estos ensayos no permiten la medición de órganos completos de sistemas modelo pequeño.

El análisis metabólico de modelos de la enfermedad a menudo implica la interacción entre las células de función especializada que se encuentra en el mismo tejido. Por ejemplo, las células gliales producen metabolitos utilizados por las neuronas. Estas interacciones metabólicas son necesarias para la supervivencia neuronal¹⁵. Sistemas modelo pequeño son ventajosos para investigar preguntas como éstas. Estudios para medir el metabolismo de un órgano entero, que contiene una variedad de tipos celulares, se sumará a la comprensión de la utilización de energía en vivo. Becker et al informó recientemente, un método para medir el consumo de oxígeno en toda mosca cabezas¹⁶. Poniendo un número de cabezas juntos en un pocillo de una placa de 24 pocillos celular, las lecturas de consumo de oxígeno fueron obtenidas usando un analizador metabólico. Aunque esto funciona bien para las cabezas, que se separan fácilmente del cuerpo, es mucho más difícil para órganos como el cerebro de larvas, ya que una gran cantidad necesita ser disecado para este método. Por lo tanto, se desarrolló un método utilizando una placa de 96 pocillos de la célula, que aumenta la sensibilidad de las lecturas de acidificación extracelular y consumo de oxígeno, para ensayo un solo cerebro entero larval.

El analizador metabólico utilizado en este estudio requiere que la muestra se mide para permanecer en el fondo del pozo de una placa celular de 96 pozos. Para las células y tejidos relativamente planos, esto no es un reto; sin embargo, para D. melanogaster cerebros de larvas y adultos, no es posible usando protocolos de capa de placa tradicional. La forma tridimensional esférica de los cerebros no fiable se adhiere a la superficie de la placa, y los que lo hacen a menudo están dañados al intentar colocarlos correctamente en el pozo. Una parte crítica de este nuevo protocolo es el diseño y desarrollo de micro-tejido restricciones¹⁷ que proporcionar un compartimiento pequeño para el cerebro a residir en sin interferir con las mediciones metabólicas. La cámara generada es de aproximadamente 0,016 en altura y ofrece suficiente espacio para contener fácilmente muchos cerebros de D. melanogaster . Las restricciones consisten en malla de nylon unido a un anillo de polímero inerte y se discutirá más en los Resultados de representante. Usando estas restricciones minimiza el tiempo necesario para preparar la medición metabólica cerebros disecados. Optimizar el proceso de medición genera acidificación extracelular tarifas y consumo de oxígeno constante, reproducible después de seis ciclos de medición (de 25 min). Los cerebros siguen siendo metabólicamente activos bajo estas condiciones durante un mínimo de 2 h, que permite inyecciones de terapéutica, los inhibidores u otros tratamientos a través de los puertos de la entrega de la droga de analizador metabólico cartucho. Este protocolo también puede ser fácilmente adaptado para otros tejidos y sistemas de modelo pequeño¹⁸.

El protocolo que se detalla a continuación describe cómo analizar el consumo de oxígeno en un todo cerebro larvas de Drosophila cuando con estrés mitocondrial. Al estrés del cerebro, oligomycin se agrega al inhibir la sintasa de ATP¹⁹. La disminución en el consumo de oxígeno basal lecturas muestra una medida de la cantidad de ATP dependiendo de la respiración en el cerebro. Otras disminuciones en el consumo de oxígeno después de tratamientos con rotenona²⁰ y antimycin A²¹, inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones I y III, respectivamente, indican la cantidad de consumo de oxígeno no mitocondrial en el cerebro. Este ensayo es un ejemplo de respiración mitocondrial como en un cerebro de mosca puede compararse y cómo este protocolo se puede utilizar para comparar el metabolismo en diferentes genotipos. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para medir consumo de oxígeno basal simplemente y tipos de acidificación extracelular, así como en cuanto a diseño más elaborados estudios investigando la utilización de la energía específica o hipótesis de utilización de sustrato.

1. ensayo de preparación (día 1)

1. Coloque el analizador metabólico (Tabla de materiales) en una incubadora o un cuarto de control de temperatura a 11 ° C.
   Nota: Esta temperatura es ideal para las mediciones a 25 ° C, ya que permite la fluctuación de temperatura ~ 14 ° C que se produce mientras se ejecuta el ensayo. Esto es causado por el calor generado por el instrumento durante la ejecución.
2. Abra el software apropiado en el ordenador conectado al analizador metabólico. Haga clic en la temperatura numérica en el lado izquierdo de la parte inferior de la pantalla. En la nueva ventana que se abre, haga clic en la casilla al lado del comando "Calentador" y aparece una marca de verificación. Ajustar la temperatura a 25 ° C y ajustar el rango de tolerancia de 0,2 ° C usando las flechas.
   Nota: Se requieren varias horas para lograr temperaturas estables.
3. Abra el contenedor del cartucho (Tabla de materiales) y extraiga el cartucho de la placa de utilidad sin tocar las puntas de prueba.
   Nota: La placa de utilidad se utiliza durante el calibrado del cartucho y no se utiliza mientras se ejecuta el ensayo metabólico.
4. Añadir 200 μL de una solución de calibrant (Tabla de materiales) a la placa de utilidad y coloque el cartucho nuevo encima de la placa de utilidad para rehidratar el sensor de las sondas en el cartucho. No toque las puntas de prueba y protegerlos de la luz.
5. Sello del cartucho con la película de parafina.
6. Incubar el cartucho durante la noche a 25 ° C.

2. ensayo preparación de medios de comunicación (día 2)

1. Añadir 10 mM de glucosa y piruvato de sodio 10 mM al medio de ensayo.
2. Incubar el medio a 25 ° C hasta que el líquido ha equilibrado a esta temperatura.
3. Ajustar el pH a 7.4 con un medidor de pH.

3. instalación del Software para el análisis metabólico de los cerebros de Drosophila melanogaster (día 2)

1. Configurar el software metabólico en el analizador metabólico utilizado en el paso 1.2.
2. Seleccione "Plantilla" en la pantalla principal del software.
3. Haga doble clic en "Espacio en blanco" para empezar un nuevo diseño de ensayo.
4. Haga clic en el botón "Mapa de la placa" en la barra de herramientas superior para ver el diseño de la placa de ensayo de la célula.
   Nota: La placa de ensayo de célula contendrá las muestras de cerebro y será emparejada con el cartucho antes de comenzar la serie metabólica.
5. Haga clic en el añadir botón de grupos x 3.
   1. Haga doble clic en la etiqueta de "Grupo 1" y cámbiele el nombre a "Experimental".
      Nota: Este grupo contiene un cerebro de mosca y una restricción de micro tejidos tratados con fármacos.
   2. Haga doble clic en la etiqueta de "Grupo 2" y cámbiele el nombre a "Control".
      Nota: Este grupo contiene un cerebro de mosca y un micro-tejido de sujeción con ningún tratamiento farmacológico.
   3. Haga doble clic en el "Grupo 3" la etiqueta y cámbiele el nombre a "moderación sólo".
      Nota: Este grupo contiene una restricción de micro-tejido sin cerebros o tratamiento farmacológico.
6. Asignar los pozos a cada grupo en donde las muestras en la placa del celular vayan a colocarse.
   1. Haga clic en la etiqueta de "Experimental" y luego destacar pozos B2 - B8 en el mapa de la placa.
   2. Haga clic en la etiqueta de "Control" y luego destacar pozos C2-C8 en el mapa de la placa.
   3. Haga clic en la "etiqueta de seguridad única'' y pozos de resalte D2-D8 en el mapa de la placa.
   4. Compruebe que las cuatro esquinas (A1, A12, H1 y H12) se señalan como antecedentes.
      Nota: Los pozos a lo largo del perímetro de la placa no se utilizan para reducir los efectos de borde. Se trata de un defecto en el software.
7. Haga clic en el botón de "Protocolo" en la barra de herramientas superior para configurar el protocolo.
   1. Haga clic en el "datos de medición de edición" en la caja de medición de línea de base.
   2. Ajustar el tiempo que el analizador metabólico medirá el cerebro cambiando la basal medida tiempo de ciclo "3:00" el arriba y abajo flechas.
   3. Ajustar el tiempo que esperará el analizador metabólico entre las mediciones del cerebro cambiando la basal espera tiempo de ciclo a "0:00" el arriba y abajo flechas.
   4. Ajustar el tiempo que el analizador metabólico mezcla los medios de comunicación antes de la medición del cerebro cambiando la basal mezcla tiempo de ciclo a "1:00" el arriba y abajo flechas.
   5. Ajustar el número total de ciclos de básicos, que incluye la medida, espera y ciclos de mezcla, "7" el arriba y abajo flechas.
      Nota: Las mediciones de la tasa estable de consumo de oxígeno se obtienen después de ~ 25 min desde el inicio del ensayo.
   6. Haga clic en el botón "Añadir inyección", situado en la barra de herramientas izquierda superior.
   7. Haga clic en la etiqueta de"inyección" y cambiar a "Oligomycin".
   8. Ajustar la medida de la inyección, esperar y tiempos de mezclado para que coincida con los de la basal.
   9. Ajustar el número total de ciclos de inyección a "6" el arriba y abajo flechas.
   10. Repita los pasos 3.7.6 - 3.7.8 pero cambie la etiqueta a "Putrefacción/AA" y ajustar el número total de ciclos de inyección a 7 el arriba y abajo flechas.
   11. Haga clic en el botón "Ejecutar análisis" en la barra de herramientas superior.
   12. "Salvar" el ensayo y empezar a configurar el cartucho de análisis (Tabla de materiales).

4. preparación del cartucho para la calibración (día 2)

1. Extraiga el cartucho de la incubadora de 25 ° C y sacar la cubierta.
   1. 20 μL de 100 μM oligomycin al puerto de inyección circular izquierda superior pequeña, A puerto, en el cartucho para pozos experimentales todos correspondientes en la placa celular y añadir 20 μL del medio de ensayo al puerto A en todos los otros pozos, incluyendo el control y fondo de los pozos.
      Nota: El cartucho contiene 4 puertos (A, D) para cada uno de los 96 pozos correspondientes a la placa de la célula que contiene las muestras. Este paso se realiza antes de las muestras. Agregar 20 μL de 100 resultados de oligomycin μM en una concentración final oligomycin de 10 μM en la placa del celular bien una vez que el fármaco se inyecta por el analizador metabólico. Oligomycin es un inhibidor de la sintasa de ATP. El valor de consumo de oxígeno resultante reflejará la cantidad de ATP-ligado la respiración en el cerebro. Para inyectarse adecuadamente en los pocillos especificados, todos los puertos de la misma carta deben llenarse con el mismo volumen de líquido, incluso si no en uso.
   2. 22 μL de 50 μM rotenona/antimycin al pequeño puerto circular derecha superior, Puerto B, en el cartucho para pozos experimentales todos correspondientes en la placa de la célula y añadir 22 μL del medio de ensayo al puerto B de todos los otros pozos, incluyendo el control y fondo de los pozos.
      Nota: Esto resulta en un rotenona final: Antimycin una concentración de 5 μM en la placa del celular bien una vez que el fármaco se inyecta por el analizador metabólico. Rotenona y la antimicina A son inhibidores del transporte de electrones de la cadena de complejos I y III, respectivamente. El valor de consumo de oxígeno resultante reflejará la respiración no mitocondrial en el cerebro.
   3. Haga clic en "Inicio ejecutar" para colocar el cartucho cargado con la placa de utilidad en el analizador metabólico con A1 bien colocado en la esquina superior izquierda, al frente del instrumento, con el cargador de la placa que se extiende desde el lado derecho de la máquina.
2. Seleccione "Estoy listo" en el software para comenzar el equilibrado y la calibración del cartucho antes de iniciar el análisis metabólico con la placa de la célula que contiene las muestras.
   Nota: El programa le preguntará guardar el archivo y luego comenzar equilibrar y calibrar. Estos pasos pueden tomar hasta 1 h. pasos 5 – 8 se llevan a cabo durante el tiempo de equilibrado y calibración.

5. preparación de las Micro-tejidos limitantes (día 2)

1. Seleccione 1 retención de micro-tejido por el cerebro que se está midiendo, además de al menos 3 para su uso como controles sólo moderación, desde el contenedor de almacenamiento de información (contiene etanol al 70%).
2. Enjuague las restricciones con etanol al 70% fresco y lavado con agua desionizada 3 x por 2 min cada una, utilizando una cesta de malla y placa de 6 pozos (Tabla de materiales). Agregar agua adicional lava si las restricciones todavía despiden un olor de alcohol.
3. Lavar las restricciones micro-tejido en medio de ensayo y les dejan en esta solución hasta que están listos para su uso.

6. disección de la Drosophila melanogaster cerebros Larval (día 2)

1. Seleccione finales (errante) tercer instar las larvas de un frasco de cultivadas moscas de Oregon-R con alta precisión, estilo 5 pinzas (0,10 x 0,06 mm²).
2. Coloque la larva en el pozo de una placa punto disección limpia (Tabla de materiales) conteniendo 500 μL de PBS 1 x.
   Nota: Una punto placa es una placa de vidrio con depresiones, utilizado para disecar organismos y tejidos pequeños.
3. Lave la larva agitando suavemente en el pozo, con pinzas.
4. Hacia el pozo limpio de una placa de punto conteniendo 500 μL de PBS 1 x a la larva.
5. Coloque la placa punto bajo el microscopio de disección.
6. Agarre la larva en su abdomen con un par de pinzas, mientras agarra los ganchos de ojo con un segundo par de pinzas.
7. Con cuidado y suavemente tire la larva en direcciones opuestas usando los dos juegos de pinzas.
8. Visualizar el cerebro, que normalmente permanece conectada a los ganchos de ojo y comúnmente habrá discos ojo antenal unido a él.
9. Retire con cuidado los tejidos adicionales del cerebro, utilizando los ganchos de ojo para mantener el cerebro en su lugar. Por último, separar los ganchos de ojo en el cerebro.
10. Utilice pinzas para mover el cerebro disecado a un nuevo pozo en una placa lugar que contiene 1 x PBS.
11. Repita los pasos 6.1 – 6.10 hasta 14 cerebros se disecan.
    Nota: El tiempo total desde el inicio de la disección a la ejecución del ensayo no debe exceder los 30 minutos.

7. Además de los cerebros disecados a la placa de la célula de análisis metabólico de 96 pocillos (día 2)

1. Añada 50 μL del medio de ensayo a los pocillos de la placa de ensayo metabólico de 96 pozos (Tabla de materiales) se utiliza en el experimento, incluyendo los experimentales, control, sólo alojamiento y pozos de fondo.
2. Coloque cuidadosamente un cerebro en cada pozo de A2-A8 y B8 de B2 de la placa de la célula, utilizando unas pinzas, una espátula o una pipeta.
   Nota: Esto se puede hacer del microscopio de disección.
3. Bajo el microscopio de disección, utilizar una sonda de micro agujas despuntadas para el cerebro en la parte inferior del pozo.
4. Suavemente Coloque el cerebro en el medio de las tres esferas elevados uso de la sonda.

8. Además de las limitantes de Micro-tejido a la placa de la célula de análisis metabólico de 96 pocillos (día 2)

1. Utilizando pinzas, coloque bien la retención de micro-tejido en el borde de la placa de ensayo y utilizar el microscopio para la inspección que se orienta con el anillo de plástico hacia abajo y la malla en la parte superior.
2. Retire la placa debajo del microscopio y utilice unas pinzas para sujetar el asiento de seguridad en ambos lados y caer suavemente en el pozo.
3. Utilice una aguja doblada micro-sonda para empujar la restricción en el pozo.
4. Bajo el microscopio, verificar que el cerebro puede verse a través de la retención de tejido y que se centra en el pozo.
5. Repita los pasos 8.1-8.4 para todos los pozos que en el ensayo: A2-A8, B8 B2 y C2-C8.
6. Cuidadosamente añadir 130 μL de medios de ensayo para cada uno de lo experimental, control y pozos de retención.
7. Verificar que los cerebros y las restricciones del tejido micro no han movido mientras que la adición de los medios de comunicación por visualización al microscopio.
8. Añadir 180 μL del medio de ensayo a los pozos de cuatro esquinas para uso como control de fondo.

9. Además de la placa de la célula para el analizador metabólico y el inicio del ensayo (día 2)

1. Para comprobar que el equilibrado y la calibración completadas esperando el software solicitar la placa de la célula que contiene la muestra.
2. Seleccione "Abrir bandeja" y esperar a que el instrumento extraer la placa de utilidad.
3. Retire la placa de utilidad y agregan la placa de la célula, sin la tapa, en la misma orientación.
4. Seleccione "célula plato de carga" para el instrumento en la placa celular y cerrar la bandeja y luego comenzar el ensayo.
5. Ver las mediciones en tiempo real con barras de error en la pantalla del ordenador que ejecuta el software.
6. Retire el cartucho y expulsado de la célula la placa cuando el ensayo se completa.
   Nota: Emparejados cartuchos y placas de células puede ser usado de nuevo 5 x.

10. medición posterior análisis (día 2)

1. Utilice un microscopio de disección para verificar los cerebros y las restricciones del tejido micro son todavía en la posición correcta en el pozo después de que el ensayo ha terminado. Excluir cualquier pozos con anormalidades de los análisis.
2. Exportación de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y los datos de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) para su posterior análisis.

El protocolo presentado aquí requiere el uso de restricciones de micro tejidos que cumplen con las especificaciones que se describen a continuación. Otros métodos para mantener el cerebro en su lugar en la parte inferior de la placa de 96 pocillos celular era fracasado (figura 2A y 2B). En primer lugar, probaron a varios agentes para aumentar la adherencia del tejido a la placa. Un adhesivo de tejido disponible en el mercado (Tabla de materiales) se recomienda para el uso de las células y organoides con placas celulares y placas de esferoide, respectivamente. Inicialmente, cerebros parecen adherirse a la superficie bien; sin embargo, las lecturas de consumo (OCR) de oxígeno son bajas, y observando los pozos después del ensayo reveló que los cerebros no fueron Unidos a la superficie bien (figura 2A). Los mismos resultados se produjeron con pegamento (figura 2A). A continuación, fabricación de pantallas pequeñas para mantener el cerebro dentro de una pequeña cámara en la parte inferior del pozo se ha intentado (figura 2B).

Pantallas metálicas producen lecturas altas de OCR solas, como pantallas de metal con un anillo de polímero que mantiene la pantalla en su lugar (figura 2B). Red de malla de plástico fue utilizado con el mismo anillo de polímero. Este dispositivo causa una lectura negativa de OCR obtener. Finalmente, las restricciones del tejido micro fueron diseñadas utilizando un polímero inerte para el anillo de un diámetro exterior de 0,146 en un diámetro interno de 0.1335 en un grueso de 0.0125 en y una altura de 0,016 en (deTabla de materiales). Pegamento (Tabla de materiales) fue utilizado para colocar el anillo a una malla de nylon con un tamaño de poro específico de 0.0039 en diámetro (Tabla de materiales). El tamaño del poro es crítico, ya que permite el intercambio de los medios de comunicación y metabolito sin la formación de burbujas de aire, sin embargo, todavía actúa como una barrera para el cerebro. Estas restricciones sólo resultan en poco o ningún OCR lectura y cuando se utiliza con cerebros, permiten lecturas reproducibles (figura 2A y 2B). La verificación después de que el análisis demostró que los cerebros estaban todavía en la posición correcta en los pozos. Estas restricciones de tejido no están comercialmente disponibles pero pueden fabricarse siguiendo la especificación antedicha. Mientras que esto requiere fabricación precisa, la mayoría tiendas de máquina será capaces de reproducir este asiento de seguridad utilizando los materiales anteriormente.

El protocolo se ha optimizado aún más para tener en cuenta los medios de prueba, el tiempo permitido antes de ejecutar el ensayo y la temperatura (figura 3). Inicialmente, los ensayos se establecieron en el medio de Schneider para modelar el ambiente larval en vivo . Sin embargo, los medios utilizados no contienen agentes tampón ya que el pH se utiliza para medir la ECAR. Este medios, por lo tanto, tienen que ser personalizado hecho, que es costoso. Para optimizar esto, se utilizan un medios de análisis disponibles en el mercado diseñado para el análisis metabólico (Tabla de materiales) en lugar de los medios de comunicación de Schneider. Los niveles de OCR eran sin cambios, incluso cuando el aumento de los niveles de glucosa un poco a las condiciones modelo ensayo medios de comunicación (Figura 3A). Desde este punto en todos los ensayos se llevaron a cabo en el medio de ensayo. Los suplementos a los medios de comunicación fueron optimizados mediante la observación de si el consumo de oxígeno y las tarifas de acidificación extracelular demostraron una respuesta al tratamiento con los inhibidores mitocondriales conocidos. A continuación, se analizó el tiempo de espera entre las disecciones y los funcionamientos de ensayo. Una incubación de 3 h disminuyó significativamente los niveles de OCR (figura 3B). Figura 3D muestra la diferencia en el sexto punto de tiempo, que es cuando los niveles de OCR y ECAR estabilizan para cerebros adultos y larvas. Así, el protocolo indica que para empezar el ensayo inmediatamente después de las disecciones, a menos que el experimento requiere un equilibrio de temperatura, en que caso una incubación de menos de 30 minutos se sugiere. El analizador metabólico se almacena en una incubadora que se establece en 11 ° C para permitir una temperatura de 25 ° C durante todo el ensayo. Si las temperaturas son elevadas debido a la temperatura ambiente y a la operación del equipo, los niveles reducidos de OCR se observan (figura 3). Esto se presume para ser debido a la muerte del tejido.

Cuando se siguen las condiciones optimizadas, los ensayos con larvas y adultos cerebros resultado lecturas de OCR ligeramente superior a 150 pmol/min en la estabilizado tiempo sexto punto, ~ 25 min en el ensayo (Figura 4B). Esta tasa se mantiene por al menos 30 min (Figura 4A) y hasta 2 h (datos no mostrados). La ECAR es ligeramente inferior en el cerebro adulto que en el cerebro de larvas en el punto sexto del tiempo (figura 4) y se mantiene durante al menos 30 minutos (figura 4). Este hallazgo corresponde a un aumento de la glicolisis durante las etapas larvales para apoyar el crecimiento. Una inyección con un inhibidor mitocondrial, como oligomycin, reduce las lecturas de OCR para revelar la respiración dependiente de ATP y más tratamiento con rotenona y antimycin A baja el OCR para revelar el consumo de oxígeno no mitocondrial (figura 5A ). Este dato demuestra que estos inhibidores son capaces de penetrar en el tejido cerebral y pueden ser usados para comparar la respiración mitocondrial en los cerebros de diferentes genotipos. Para este ensayo, la mezcla, esperar, y momentos de medida fueron optimizados por observación de los niveles de oxígeno, no la tasa de consumo y que después de la mezcla, el nivel de oxígeno volvió al nivel de antes de la medición.

Figura 1: esquema de las mediciones de OCR y ECAR de cerebro larvas en el analizador metabólico. El cartucho se prepara un día antes de ejecutar el ensayo. Al día siguiente, las drogas se agregan a los puertos de inyección del cartucho. Cerebros de larvas de D. melanogaster se disecan, y se micro-tejido restricciones para garantizar el cerebro a la parte inferior del pozo. La placa de la célula con los cerebros se ensayaron en el analizador metabólico y los datos son analizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Micro-tejido restricciones no son metabólicamente activas y mantienen el cerebro en una cámara en la parte inferior de una placa bien. (A) el OCR de cerebros larvas melanogaster Oregon-R D. se mide en pocillos recubiertos con adhesivo tisular (Tabla de materiales) o cuando los cerebros son super pegados en el fondo del pozo. Los resultados se comparan con los de cerebro colocado en la parte inferior del pozo utilizando micro-tejido restricciones. (B) el OCR se mide en pocillos que contengan medios de ensayo y metal, metal con un anillo de polímero, red de malla de plástico y un anillo de polímero o micro-tejido restricciones. p-valor < 0.05, ** p-valor < 0,01, *** p-valor < 0.001, *** p-valor < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: optimización de los medios de comunicación, tiempo de incubación y temperatura. (A) el OCR es medido en Oregon-R D. melanogaster larvas cerebros medios Schneider (S2) con piruvato de sodio añadido, S2 con glucosa y piruvato de sodio añadido, ensayo medios con glucosa y sodio piruvato añadido. (B) el OCR se mide en el cerebro de larvas después de 3 h de incubación antes de la prueba, o después de 30 min de incubación antes de la prueba. (C) el OCR se mide en el cerebro de larvas en serie temperaturas de 33 ° C y 25 ° C. El sexto punto del tiempo se graficaron. (D) el OCR se mide en el cerebro de larvas después de 3 h de incubación antes de la prueba, o después de 30 min de incubación antes de la prueba. Los datos se divulga para el sexto punto del tiempo. p-valor < 0.05, ** p-valor < 0,01, *** p-valor < 0.001, *** p-valor < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El OCR y ECAR reproducible se miden en adulto y larval de D. melanogaster cerebros. (A) el OCR se mide en cerebros de adultos y larvas de Oregon-R D. melanogaster por 30 min (B) datos de la OCR del sexto punto de tiempo del panel A se graficaron. Este es el momento en que se estabilice la lectura OCR. ECAR el (C) se mide en cerebros de adultos y larvas de D. melanogaster por 30 min (D) datos de la ECAR del sexto punto de tiempo del panel A se graficaron. Este es el momento en que las lecturas de ECAR estabilizan. p-valor < 0.05, ** p-valor < 0,01, *** p-valor < 0.001, *** p-valor < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Oligomycin disminuye los niveles de cerebro larvas OCR de D. melanogaster a revelar respiración dependiente de ATP, y rotenona/antimycin A otros baja el OCR para revelar el consumo de oxígeno mitocondrial-no. (A) el OCR se mide en cerebros larvas melanogaster Oregon Rd después de un tratamiento con un 20 oligomycin μm y 5 μm rotenona/antimycin A mezcla. El control y la moderación sólo pozos fueron inyectados con los medios de ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vuelco de M. tiene una patente provisional para las restricciones del tejido micro que se describe en este protocolo¹⁷.