Privación de sueño crónica en ratón cachorros por medio de suave manejo

Sueño juega un papel fundamental en la formación de sinapsis y la plasticidad neuronal y eliminación durante el cerebro desarrollo^1,2. En concreto, movimientos oculares rápidos (REM) es esencial para la formación de circuitos sinápticos estables por tanto fortalecimiento de la sinapsis específicas y poda sináptica². La privación del sueño farmacológico temprano en la vida lleva a muchos déficits fisiológicos y de comportamiento^3,4. Además de dormir farmacológica privación, otras formas de privación de sueño como agitación constante, forzado locomoción, o presentación de un estímulo aversivo se han asociado con síntomas como la depresión en la edad adulta, diferentes nervios patrones de activación y cambios en la continuidad de tiempo y sueño de sueño durante un período de recuperación después de privación^5,6,7. Cuando sueño es crónica en ratones durante más de cinco semanas durante el desarrollo, déficits conductuales fueron observados después de un mes de sueño de recuperación⁸. Tomados juntos, estos estudios sugieren que la interrupción del sueño en el roedor neonatal puede afectar más adelante patrones del sueño, función cerebral y comportamiento. La importancia del sueño para el desarrollo normal del cerebro en los seres humanos, muchos pacientes con trastornos del desarrollo neurológico, incluyendo trastornos del espectro autista, complejo de esclerosis tuberosa, síndrome de X frágil y déficit de atención con hiperactividad Desorden, las anormalidades en patrones de sueño, además de una gran variedad de déficits conductuales¹informe.

Dado el número de trastornos del neurodesarrollo que se asocian a patrones de sueño anormales, es importante entender cómo la falta de sueño afecta el comportamiento y la función cerebral. Sin embargo, a pesar de los datos que apoyan la importancia de dormir durante el desarrollo, más metodologías que restringen o privar a los animales del foco del sueño en adultos. Estas técnicas incluyen una variedad de pruebas que requieren obligados actividad locomotora (por ejemplo, constante caminadora), interrupción constante (por ejemplo, girando la barra de barrendero o presentación objeto novela continua) o molestar a los animales en el inicio de El sueño REM (por ejemplo, la plataforma sobre el agua)^9,10. Aunque estos métodos han demostrado eficacia los problemas relacionados con la privación del sueño en adultos, ninguno de estos métodos son apropiado para crías de roedores debido a su limitada movilidad, sueño alto en coche y los efectos adversos del estrés temprano en la vida. Debido a la importancia del sueño durante el desarrollo, es fundamental para entender el sueño como restringido en el comportamiento futuro de los cachorros neonatales afecta durante la edad adulta.

Una técnica para restringir el sueño que puede ser utilizado en crías de roedores es un manejo suave. Manipulación suave implica el investigador interactuar directamente con los roedores que se observa cualquier comportamiento en tiempo de sueño. Los investigadores pueden utilizar sus manos, un pincel o la presentación de objetos novedosos para alterar físicamente el sueño en roedores neonatales^{8,10,11,12,13,14} . Sueño puede determinarse su comportamiento por la falta de actividad motora, espasmos mioclónicos y encierro del ojo (en crías de roedores mayores). Validación de EEG confirma que perturban el sueño con la dirección apacible basado en estos comportamientos reduce el tiempo de sueño total en un 91% en P12 ratas¹⁴. Otras técnicas que se han utilizado para privar a ratones jóvenes incluyen descargas eléctricas y presentación de los estímulos desagradables, pero estas técnicas no pueden utilizarse para restricción de sueño crónica y son más estresantes que una manipulación suave^{7, 15}. restricción de sueño crónica también puede lograrse a través de un protocolo de agitación que puede utilizarse con o sin implantación de electrodos de EEG y los programas informáticos asociados, pero este Protocolo no impide dormir todos y por lo tanto es menos controlada en comparación con un manejo suave^4,16. La capacidad de restringir o privar a los ratones de sueño durante varios días en una fila sin equipos específicos, programas informáticos o implantación de electrodo es un beneficio de la técnica de manipulación suave. Restricción del sueño crónica mediante manipulación suave efectivamente limita el sueño en roedores neonatales y produce una variedad de cambios en el comportamiento tras el sueño privación período^{8,11,12, 17}.

Aquí, Describimos resultados que privación de sueño crónica durante tres horas por día del día postnatal 5 (P5) a P42 afecta significativamente la sociabilidad de los ratones después de un período de recuperación de 30 días en el que sueño no es perturbado. Estos resultados destacan los efectos a largo plazo de la restricción del sueño crónica durante el desarrollo de comportamiento futuro.

Nota: Todos los procedimientos fueron aprobados por el nacional Instituto of Mental Salud Animal Care y uso y conformidad con directrices para los institutos nacionales de salud en el cuidado y uso de animales.

1. configuración de la privación de sueño

1. Usar pinceles blandos para suavemente empujar ratones durante el sueño.
   1. Asegúrese de que el pincel puede caber a través de las barras del comedero de la jaula del ratón para asegurarse de que los ratones tienen acceso a alimentos y agua ad libitum durante la privación de sueño.
   2. No use pinceles para varias jaulas para evitar a la transferencia de aromas entre jaulas. Sugerimos que cada pincel con la jaula asignada la etiqueta y restringir su uso a esa jaula.
2. Designar una sala donde se producirá la privación del sueño todo.

2. animal configuración

1. Asignar al azar cada jaula o privación del sueño como grupo de control.
2. Acceso de ratones para alimento y agua ad libitum durante el experimento.
3. Asegúrese de que vista de ratones no está restringido por la ropa de cama, material de nido u objetos de enriquecimiento en la jaula.
   1. Quitar juegos de cama extra u objetos de enriquecimiento que podrían restringir la vista de los ratones.
4. Si agua ni comida restringe opinión de ratones, mover ratones a una zona de la jaula donde la vista no es restringida.
   1. Si el alimento bloquea una gran parte de la jaula, algunos alimentos y poner bolitas en la parte inferior de la jaula para que los animales mantienen acceso a los alimentos durante el período de privación de sueño.

3. animales condiciones

Nota: Elegimos empezar tres horas período de privación de sueño en 11:00, cuando los ratones están en su fase inactiva, pero la hora del día y la duración de la privación del sueño pueden ser elegidos según las condiciones experimentales deseadas.

1. Grupo de control.
   1. En P5, retire el padre de la jaula del criador y dejar la presa con los cachorros hasta el destete (P21).
   2. Mover ratones asignados al grupo control a la privación de sueño la habitación y suavemente producciën los ratones con una brocha continuamente durante 10 minutos al día durante la duración del experimento (P5 a P42).
   3. Después de estos 10 minutos, los ratones al sala de animales y no molestar
2. Grupo de la privación de sueño.
   1. En P5, retire el padre de la jaula del criador y dejar la presa con los cachorros hasta el destete (P21).
      Nota: La falta de sueño antes de P5 puede resultar en la canibalización de los cachorros. No observamos canibalización significativa en P5 y más adelante.
      Nota: En cachorros jóvenes, el deseo de dormir es muy alto que requieren caricias casi constante. Como los ratones desarrollan, especialmente después del destete, la presión del sueño es menor y no necesitan constante insistencia.
   2. Continuar con la privación del sueño todos los días hasta P42.
      Nota: Protocolos de la privación de sueño pueden varían en longitud y extenderse más allá de P42 si lo desea.
   3. Mover ratones asignados al grupo de privación de sueño a la sala de la privación de sueño diariamente durante el ciclo de luz donde se monitorearán. La duración exacta de la privación del sueño puede ser ajustada en base a la pregunta de investigación específica.
      Nota: En ratones neonatales la privación del sueño que dura más de 3 horas es difícil debido al aumento de la presión del sueño¹⁵.
      1. Durante este tiempo, suavemente prod los ratones con el pincel siempre que sueño es evidente. Específicos de la privación del sueño se explican en la siguiente sección.

4. la privación de sueño

1. Suavemente prod ratón con pincel si sospecha estar dormido hasta que se observe una respuesta. Por otra parte, invertir ratones y empujar encima a sus espaldas a interrumpir el sueño.
   1. Considerar un ratón dormido si se presenta cualquiera de los siguientes: inactividad, fasciculaciones (especialmente con crías), o si sus ojos están cerrados (en los ratones más viejos de P12).
   2. Cuenta ratones estar despierto si estén en movimiento, tratando de mover de un tirón después de estar en la espalda, o arreglarse a sí mismos.
2. Si la presa está cubriendo los cachorros durante la privación de sueño, le prod suavemente de cachorros por lo que la vista de los cachorros es sin restricciones.

5. después de la privación del sueño

1. Cuando termine el período de tres horas de privación del sueño, poner la ropa de cama y cualquier alimento que puede han eliminado nuevamente y ponga la tapa de nuevo en la jaula.
2. Regresa jaulas a animales explotación sala hasta el día siguiente de la falta de sueño.

6. posteriores experimentos

1. Dependiendo de la meta del estudio de la privación de sueño, continuar con posteriores experimentos.
   1. Recoger el suero de los animales para determinar los niveles de corticosterona¹⁸.
   2. Alguna de una serie de pruebas de comportamiento, incluyendo a campo abierto, RotaRod, laberinto más elevados, comportamiento Social prueba, mármol enterrando, etc.^8,19,20 estas pruebas de comportamiento también evitará que los animales de dormir por lo que debe tenerse determinar cuántos días de privación de sueño continuo a emplear.

Para investigar los efectos de la restricción del sueño crónica sobre el comportamiento, dormimos ratones restringidas durante tres horas todos los días entre las 11:00 y 14:00 de P5 a P428. A raíz de la restricción del sueño, ratones quedaban imperturbados durante cuatro semanas y permite recuperarse de restricción del sueño. Ratones fueron probados por su comportamiento tras el período de recuperación de cuatro semanas. La prueba de comportamiento social de tres cámaras se utilizó para evaluar la sociabilidad (preferencia por un ratón nuevo en comparación con un objeto nuevo) y la novedad social (preferencia por un ratón nuevo en comparación con un ratón familiar). En la prueba de sociabilidad, dormir restringido las hembras pasadas más tiempo olfateando el extraño ratón que las hembras control (p < 0.05) (figura 1A) y machos de restricción de sueño tuvieron una tendencia a pasar más tiempo olfateando el objeto comparado control de los varones (p = 0,077) (figura 1A). En la fase de novedad social de pruebas, restricción de sueño ratones femeninos pasaron un aumento la cantidad de tiempo oler el nuevo ratón que controles femeninos (p < 0,01) (figura 1B).

Figura 1: restricción del sueño crónica altera el comportamiento social después de un período de recuperación de sueño de 4 semanas. (A) prueba de sociabilidad: tiempo inhalación revela que ratones macho que fueron sueño restringido pasó más tiempo olfateando el objeto novedoso en comparación con los varones controles (p = 0,077). Ratones hembra restricción de sueño pasaron más tiempo olfateando el ratón extraño en comparación con las hembras control (*p < 0.05). Restricción de sueño ratones femeninos también tienden a pasar más tiempo olfateando el objeto comparado con las hembras control (p = 0,065). (B) prueba de novedad Social: tiempo olfateando la novela o ratón familiar reveló que sueño ratones femeninos restringidos pasaron estadísticamente significativo más tiempo olfateando el ratón novela en comparación con los ratones femeninos que no fueron sueño restringido (**p < 0,01). Las barras representan los medios ± SEM 11 hombre de control, 13 hombre de restricción de sueño, mujer 22 control y 17 ratones hembras restricción de sueño. Los datos se analizaron mediante post hoct-pruebas siguiendo un ANOVA. Esta figura se ha modificado con permiso de Sara et al. 20168. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.