Summary
Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.
Abstract
ניתוח של חלבון ביטוי glioma רלוונטי עבור מספר היבטים במחקר של הפתולוגיה שלו. חלבונים רבים תוארו גם סמנים ביולוגיים עם יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. ניתוחים אלה של סמנים שימושיים גם לאפיין הגידול neurospheres (NS) המופקים glioma חולים ומודלים glioma. הגידול NS מספקות מודל ערך במבחנה כדי להעריך את תכונות שונות של הגידול שממנו הם נגזרים, ניתן באופן מדויק יותר מראה glioma ביולוגיה. כאן נתאר שיטת מפורט לניתוח סמנים סרטניים NS באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) על גידול פרפין-מוטבע NS.
Introduction
Gliomas הם גידולים מוצקים העיקרי של מערכת העצבים המרכזית מסווגים לפי המאפיינים שלהם פנוטיפי ו genotypic על פי ארגון הבריאות העולמי ה-1. סיווג זה משלבת נוכחות או היעדרות של מוטציות הנהג, אשר מייצגים מקור אטרקטיבי של סמנים ביולוגיים2. סמנים ביולוגיים הן תכונות ביולוגיות ולהשוואה הערכה לציון תהליכים נורמליים ופתולוגיים, כמו גם תרופתי התגובות התערבות טיפולית3. סמנים ביולוגיים ניתן להבחין ב גידול רקמות ותאים שמקורם glioma, המאפשרת אפיון ביולוגי שלו בהיבטים שונים. כמה דוגמאות של סמנים ביולוגיים glioma כוללים מוטציה isocitrate דהידרוגנאז 1 (IDH1), אנזים מוטציה האופייניים gliomas נמוך בכיתה הקשורים עם פרוגנוזה טובה יותר4. מוטציה IDH1 מתבטא לעתים קרובות בשילוב עם TP53 אלפא-תלסמיה/מנטלי פיגור תסמונת X-linked (ATRX)-inactivating מוטציות, הגדרת glioma ספציפי של סוג הנכס4,5. מוטציות ATRX inactivating גם להתרחש ב- 44% של ילדים gliomas בדרגה גבוהה2,6 , קושרו עם גידולים אגרסיביים, אי יציבות גנומית6,7. בנוסף, ילדים ' מאטום לשקוף ' מהותי pontine gliomas (DIPG) מובחנים של תת קבוצות לפי נוכחות או היעדרות של מוטציה K27M בגן היסטון H3 H3F3A, או ב- HIST1H3B/C ג'ין1,6. לכן, כניסתה של אפיון מולקולרי מתיר את חלוקת משנה, מחקר, וטיפול של gliomas כישויות נפרדות, אשר יותר יאפשר הפיתוח של יותר ממוקד טיפולים עבור כל סוג של. בנוסף, הניתוח של סמנים ביולוגיים ניתן להשתמש כדי להעריך תהליכים ביולוגיים שונים כגון אפופטוזיס8, autophagy9, מחזור התא התקדמות10, התפשטות תא11תאית התמיינות12 .
בדגמי בעלי חיים מהונדסים גנטית הנמל נגעים גנטי נוכח סרטן אנושיים הם קריטיים עבור המחקר של איתות המסלולים המתווכות התקדמות המחלה. המעבדה שלנו יישמה את השימוש במערכת transposase היופי ישן (SB) לפתח מודלים מהונדס גנטית עכבר של glioma מחסה מוטציות ספציפיות אשר מסכם את הדברים glioma האנושי יחוברו13,14. מודלים מהונדס גנטית עכבר אלה משמשים ליצירת NS נגזר הגידול, אשר מאפשרים מחקרים במבחנה במערכת תלת-ממד, תכונות בולטות שיקוף להציג גידולים מקומיים בתוך15. כמו כן, השתלת orthotopical של NS לתוך עכברים ניתן להפיק גידולים משניים אשר שומרים על תכונות של הגידול העיקרי ומחקים את המאפיינים histopathological גנומית, פנוטיפי של הגידול העיקרי המקביל15.
בתרבות ללא סרום, תאים סרטניים במוח עם מאפייני תא גזע יכולים להיות מועשר, בנוכחות גורמי גדילה עוריות (EGF) ו פקטורי גדילה פיברובלסט (FGF), הם ניתן לגדל כמו מושבות נגזר תא יחיד כגון NS תרבויות. במערכת זו בררני תרבות ', רוב התאים המבדילים או הבדיל במהירות מתים, ואילו תאי גזע להתחלק ויוצרים האשכולות הסלולר. פעולה זו מאפשרת את הדור של תרבות NS המתחזק glioma הגידול תכונות16,17,18. Glioma NS ניתן להעריך כמה היבטים של הגידול ביולוגיה, כולל הניתוח של סמנים ביולוגיים בעלי יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירה glioma NS להטביע את התרבויות 3D פרפין לשימוש עבור IHC מכתים. אחד היתרונות של תיקון והטבעה glioma NS הוא כי המורפולוגיה של NS נשמר טוב יותר בהשוואה ל- cytospin המקובלת בשיטה19, אילו glioma NS מוכתבת עליהם מניפולציה מלחיץ עבור תא דיסוציאציה, להיות שיטוח. בנוסף, הטבעה המרווה כל ביטוי fluorophore אנדוגני מהגידול מהונדס גנטית NS, המאפשרים צביעת על פני ספקטרום פלורסנט. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשמר את המבנה התלת-ממד של תאים glioma דרך פרפין הטמעת תהליך אפיון של glioma neurospheres באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
1. דור של המוח גידול Neurospheres נגזר דגם העכבר
- לפני ההליך לנתיחה, להכין תאי גזע עצביים מדיה (Media המועצה לבטחון לאומי: DMEM/F12 עם תוספת x B27 1, 1 השלמה x N2, 1 x normocin 1 x אנטיביוטיקה/antimycotic בתוספת האנושי רקומביננטי EGF ו- basic-FGF בריכוזים של 20 ng/mL כל). למלא את צינור 1.5 מ ל 300 µL של המועצה לבטחון לאומי מדיה ושריין מאוחר יותר.
- בחר עכבר עם גידול גדול.
הערה: גודל הגידול ניתן יהיה פיקוח על ידי ביולומינסנציה אם פלסמיד או הוירוס מוזרק מקודד luciferin. בדרך כלל, גידול גדול יש ביולומינסנציה של > 106 פוטונים/s/ס מ2/sr. - המתת חסד את העכבר עם מנת יתר של איזופלוריין: להשרות נייר טישו עם איזופלוריין ולהציג את הרקמה euthanization כדורים, הימנעות ממגע ישיר עם העכברים כדי למנוע גירוי. המתן עד העכברים לא מראים רפלקס פדלים (בדרך כלל 5-10 דקות). לערוף את העכבר ומנתחים את המוח כפי שמתואר Calinescu. et al. 13.
- אם הגידולים פלורסנט, השתמש מיקרוסקופ ויבתר מצויד עם מנורת פלורסנט כדי לזהות את מסת הגידול בתוך המוח. עם מלקחיים בסדר, לנתח את הגידול (בדרך כלל 5-7 מ מ קוטר) של רקמת מוח נורמלי.
- מקום הגידול ביתור בצינור 1.5 mL עם המועצה לבטחון לאומי מדיה (שלב 1.1). Homogenize הגידול עם כבעלי פלסטיק חד פעמיות שמתאימים לתוך דפנות הצינור microcentrifuge על ידי הפעלת לחץ עדין.
- מביצועם כגיהנום תא, להוסיף 1 מיליליטר דיסוציאציה ללא אנזים מדיה ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
- לסנן את המתלים תא דרך מסננת תא מיקרומטר 70 ולשטוף את מסננת עם 20 מ של המועצה לבטחון לאומי מדיה.
- צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות, decant את תגובת שיקוע, וכן להשעות מחדש בגדר 6 מ ל או 15 מ"ל של המועצה לבטחון לאומי מדיה, בהתאם לגודל בגדר.
- צלחת התליה תא הגידול לתוך הבקבוק תרבות T-25 או T-75 התרבות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה עם אווירה של 95% אוויר ו-5% CO2.
- לאחר 3 ימים, להעביר את NS מושעה בריא ואת צלחת אותם מחדש לתוך בקבוקון תרביות רקמה T-25 או T-75. אם יש צורך, להוסיף מדיה לבטחון לאומי נוספת התרבות.
הערה: בדרך כלל יהיו אוכלוסייה מעורבת של תאים, כמה יהיה מת, כמה דבקה, ויוצרים כמה להיות NS זה צפים בתקשורת
2. שמירה, Passaging את NS
הערה: למנוע יתר ולשמור על תאים על צפיפות גבוהה יחסית. הנהרות נקבע לפי גודל הספירות (שחור מרכזי של יתר כלומר הספירות גדולים). קצב הגידול NS יהיה תלוי oncogenes המשמש ליצירת גידולים.
- ברגע התרבות NS הגיעה confluency, לאסוף את התרבות בשפופרת צנטרפוגה סטרילי, גלולה NS ב g 300 x במשך 5 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של הפתרון ניתוק התא, פיפטה להשעות מחדש בגדר.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מצליף את הצינור כל 2 דקות כדי לסייע תא דיסוציאציה.
הערה: כאשר NS מגיעים confluency, הם בדרך כלל רואים בעין בלתי מזוינת כמו כדורים לבנים קטנים. על מנת להבטיח תא דיסוציאציה, לפחות כל NS גלוי בטח נעלם - הוסף 5 מ של HBSS 1 x ופיפטה מספר פעמים. צניפה תאים על 300 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע. מחדש להשעות את צניפה ב 5 מ של המועצה לבטחון לאומי מדיה בתוספת רקומביננטי EGF ו- basic-FGF.
- להוסיף 1 מ"ל של תאים 15 מ"ל של המועצה לבטחון לאומי מדיה ותרבות בבקבוקון T-75 ב 37 ° C בחממה תרביות רקמה עם אווירה של 95% אוויר ו-5% CO2.
- הוספת גורמי גדילה (EGF ו- basic-FGF) כל 3 ימים. אם התקשורת הופך בהיר וכתום התאים עדיין אינם confluent, לשנות את המדיה. כדי לעשות זאת, centrifuge את NS-300 גרם x במשך 4 דקות ו להשעות מחדש בתקשורת לבטחון לאומי עם גורמי גדילה.
הערה: בהתאם לגודל בגדר נוצר, תאים ייתכן שיהיה צורך ניתן לחלק את המבחנות יותר.
3. מקפיא את NS לאחסון לטווח ארוך
- התרבות NS הופך confluent, לבטל את התאים כמתואר בצעדים 2.1 2.4. ברגע בגדר כבר מחדש תלויים HBSS, להסיר את aliquot של ולספור את התאים.
- צנטריפוגה תאים ב g x 300 במשך 4 דקות ו להסיר ככל האפשר של תגובת שיקוע.
- מחדש להשעות את צניפה קפואים מדיה (FBS חום-לא פעיל, דימתיל סולפוקסיד 10%). מומלץ להקפיא בין עונה 1 פרק 106 ו- 3 x 106 תאים לכל מבחנה לכל mL.
- לחלק בתאים cryovials רבים וגם צריך להתקרר לאט הבקבוקונים מחדש על תנאי על ידי הראשון העברת אותן לקרח, ואז ל-20 ° C, ואז ל-80 מעלות צלזיוס, ולבסוף למחרת במיכל אחסון בחנקן נוזלי.
4. קיבוע של הגידול NS
- תרבות גידול NS בבקבוקון T-25 2-3 ימים עד שהתאים confluent (~ 3 x 106 תאים). לאסוף את הגידול NS צינור חרוטי 15 מ"ל מבקבוק לפחות אחד T-25 confluent. גלולה ב g x 300 במשך 5 דקות.
- מחדש להשעות את צניפה ב 1 מ"ל של 10% פורמלין ו לשמור בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 דקות הוסף 5 מ של 1 x HBSS-גלולה התאים כפי שנעשה צעד 3.2. חזור על שלב זה עוד פעם אחת.
- במקום הצינור חרוט 15 מ"ל המכיל בגדר על קרח.
5. פרפין ההטמעה של הגידול NS
- מחדש להשעות בגדר NS שטף ב 500 µL של 2% agarose נוזל חם ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
- במקום מיד את NS agarose-מוטבע על הקרח, עד agarose polymerizes. הסר את היצירה agarose מסתירים את NS. מניחים את החלק polymerized agarose עם המחלקה בקלטת בשביל לרקמות עיבוד (איור 2).
- להמשיך עם עיבוד רקמות (באמצעות מעבד פרפין אוטומטית), שעוות פרפין הטבעה (באמצעות תחנה ההטבעה).
6. חלוקתה של פרפין-מוטבע NS
- להגדיר את המים הרותחים עד 42 ° C והכנס את הלהב על האזמל הקטן בזהירות באמצעות שתי מברשות כדי לוודא שזה הוא בר-החלקה. השתמש הלהב רק עבור זמירה.
- מניחים את גוש פרפין על האזמל הקטן. עם היד הלא דומיננטית, לחץ כלפי מטה ידית הממוקמת בצד שמאל השולט העובי של כל מקטע. הקש כדי העצירה השנייה זה מצביע על עובי 30 מיקרומטר.
- להתחיל זמירה את הבלוק (כלומר., הסרת פרפין עודף) על ידי סיבוב הגלגל יד גס עם יד ימין עד פני השטח של המדגם. בשלב זה, שחרר את הידית ששולטת את עובי החיתוך 10 μm או 5 μm. תפסיק זמירה כאשר השטח של המדגם.
- מילוי מקרר עם קרח ולהוסיף רק מספיק מים כך כאשר לבלוק פראפין מושם על קרח, המים פועל כמו סרט מסביב לבלוק פראפין, מגן מלגעת ישירות את הקרח. דגירה הרחוב פרפין על קרח למשך 20 דקות.
- למחוק את הלהב הישן ולהוסיף אחד חדש עבור חלוקתה. בלוק יבש בעזרת גזה, ואז למקם אותו על האזמל הקטן.
- עם היד הלא דומיננטית, להשיג זוג מלקחיים מעוקל שישמש כדי למשוך את הסרט פרפין. שמור מכחול לח ליד ימין, אשר ישמש כדי להעביר את הכלים פרפין לאמבט המים. להתחיל מקטע על-ידי סיבוב הגלגל יד גס עם יד ימין מהיר בקצב. השתמש המלקחיים ביד שמאל כדי להחזיק את הסרט פרפין.
- להשתמש את המכחול לח להעביר את הכלים פרפין לאמבטיה מים.
- השתמש העקומה של המלקחיים על כנו הסעיפים על ידי באופן שטחי הצבת המלקחיים בין שני מקטעים פרפין, ואז דוחפים בעדינות בין שני המקטעים משם.
הערה: תנועה זו צריכה להיות לגמרי על פני השטח של המקטע פרפין. אל תלחץ על הסעיף. - השתמש את המכחול לח לדחוף את המקטעים מופרדים פרפין על גבי שקופיות מיקרוסקופ אדהזיה הטעון חיובית.
- לאפשר שהשקופיות לילה יבש בתוך ברדס כימי לפני אחסונם בתיבות שקופיות. האחסון של שקופיות תלוי בסוג של כתם שבוצעה.
7. אימונוהיסטוכימיה (IHC) של פרפין-מוטבע NS
- ממיסים פראפין על ידי הצבת את השקופיות במעמד מתכת המקננת בהם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- Deparaffinize השקופיות על-ידי דגירה על הרכבת התייבשות ב RT: 3 x קסילן במשך 5 דקות, 100% אתנול 2 x עבור 2 דקות, 95% אתנול 2 x עבור 2 דקות, 70% אתנול 1 x 2 דקות, ו- 1 x מים יונים 2 דק Hereon, שמור את השקופיות במי ברז עד אחזור אנטיגן , כמו ייבוש יגרום נוגדן ספציפי שאינו מחייב.
- דגירה השקופיות במאגר ציטראט (חומצת לימון 10 מ מ, דטרגנט ללא יונית 0.05%, pH 6) ב 125 מעלות צלזיוס ל 30 s ו ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 s. לתת להם להתקרר, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות 5 פעמים עם מים מזוקקים.
- דגירה שקופיות ב RT ב- 0.3% H2O2 למשך 30 דקות.
- לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת מאגר (דטרגנט 0.025% ב- TBS) עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
- דגירה השקופיות ב RT עם חסימת פתרון (10% הסוס סרום, BSA 0.1% ב- TBS) למשך 30 דקות.
- דגירה השקופיות בן לילה ב 4 ° C בתוך תא humidified עם נוגדן ראשוני מוכן בפתרון דילול (BSA 0.1% ב- TBS). לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת המאגר עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
- דגירה השקופיות ב RT מאובטח עם נוגדן משני biotinylated מוכן בפתרון דילול. לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת המאגר עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
- דגירה השקופיות ב RT בחושך למשך 30 דקות עם peroxidase חזרת אבידין-biotinylated מורכבים. לשטוף את השקופיות 3 פעמים ב שטיפת המאגר עבור חמש דקות עם עצבנות עדין.
- דגירה השקופיות עם DAB-H2O2 המצע מותגים כאן למשך 2-5 דקות ב- RT.
- לשטוף 3 פעמים עם מים מהברז. לטבול (1-2 s) השקופיות hematoxylin לפתרון counterstain, יש לשטוף אותן היטב במי ברז עד קרחת.
- מייבשים את השקופיות כדלקמן: דגירה במים מזוקקים למשך 2 דקות, לטבול 3 פעמים ב- 80% אתנול, דגירה אתנול 95% 2 פעמים למשך 2 דקות כל אחד, דגירה אתנול 100% 2 פעמים למשך 2 דקות כל אחת, ולבסוף ב קסילן 3 פעמים במשך 3 דקות כל אחד.
- Coverslip השקופיות עם מדיום מבוסס קסילן הרכבה ולתת להן להתייבש על משטח שטוח ב RT עד שיהיו מוכנים עבור הדמיה. הערה: אם מבצע 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) מכתים, בשקופיות שניתן לאחסן ב- RT. עם זאת, אם immunofluorescence מכתים מבוצע, שקופיות יש לאחסנו בחושך ב-20 ° C כדי להפחית הלבנת-צילום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לעקוב אחר התפתחות גידולים ולהעריך אם הגידול הגיע הגודל הדרוש ליצירת NS, ניתחנו את לומינסנציה הנפלטת גידולים באמצעות ביולומינסנציה. פעולה זו מאפשרת לימוד יעילות התמרה חושית הגורים, התקדמות הגידול ע י האות הפריה חוץ גופית של לוציפראז (איור 1א' ו- 1B). כאשר גודל הגידול מגיע אות של עונה 1 פרק 107 פוטונים/s/cm2/sr (איור 1B), ניתן לעבד את המוח לדור NS. יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי ניתן להוסיף את רצף קידוד שונה פלורסנט חלבונים פלסמידים משמש לייצור והספקת הגידול ג'ין. נוכל אז לאשר את הביטוי של שינויים גנטיים, מוספים באמצעות מיקרוסקופ ויבתר מצויד עם מנורת פלורסנט (איור 1C). NS המופקים wt-IDH1 (איור 1D) וגידולים (איור 1E) mIDH1 מזוהים לפי האופייני המורפולוגיה כדורית, הביטוי של fluorophores המשויך הנגע גנטי מסוים ( כלומר-GFP הקשורים shATRX shp53, Katushka המשויך mIDH1; איור 1 D ו- 1E). כדי להמשיך IHC-NS, התאים הם קבוע, ואז נעוץ agarose של פרפין (איור 2). הטבעה של NS בבלוקים פרפין יש מספר יתרונות, ובהם שימורה של מבנים תלת-ממד של המחלקה ומאפשר לאחסון לטווח ארוך. יכול להיות מוכתם NS מוטבע סמנים ביולוגיים glioma ספציפיים. בעזרת טכניקה זו, ניתחנו את הביטוי של ATRX, Ki67 ו- OLIG2 (מרקר התמיינות אוליגודנדרוציטים) (איור 3A-3_C). אישרנו רמות ביטוי נמוכה של חלבון ATRX בתרבויות NS שלנו (איור 3א), אשר היא תכונה של glioma איג סוג הנכס כיום להיות למד4. כמו כן, Ki-67, סמן היטב תיאר של התפשטות תאים, היה חיובי שריכזה mIDH1 (איור 3B), הוכחת התפשטות פעיל, אשר תכונה מרכזית של תאים סרטניים. מעניין, תאים לשפות אחרות במרכז האשכולות NS glioma גדולים יצאו שליליות Ki-67 (איור 3B), המציין כי הם היו לא מתרבים, בניגוד התאים חיובי Ki-67 מקומי לפריפריה. תופעה זו עשוי להיות בשל העובדה כי היקפי תאים לא צריך גישה חומרים מזינים מהתקשורת צמיחה. כאשר הם מגיעים בגודל גדול יותר, glioma NS צריך להיות חלופה מועדפת, passaged. לבסוף, NS wt-IDH1 היו חיוביים עבור Olig2, פקטור שעתוק השתתפות אוליגודנדרוציטים בידול (איור 3ג').
איור 1 : Neurospheres glioma שנוצר מ- GFP - ו Katushka-חיוביות ישן גידול במוח יופי (SB). (א) זורח אות של עכבר neonate מוזרק עם פלסמיד SB-transposase בשילוב עם פלסמידים מחסה נגעים גנטי לזירוז glioma (NRAS/shP53/shATRX/IDH1-R132H). (ב) לומינסנציה המציינת את התפתחות גידולים-132 ימים שלאחר ההזרקה (DPI). (ג) בהיר-שדה ותמונה פלורסנט של מוח שנקטפו עכבר שהגיעו לשלב מובילים. אזור הגידול הוא התחום על ידי הקו המקווקו וחיובית עבור הכתבים פלורסנט, ה-GFP, Katushka. (E ו- D) Neurospheres הגידול המופקים גידולים במוח SB לבטא GFP הקשורים shP53, shATRX; Katushka קשור IDH1-R132H. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ייצוג של זרימת העבודה עבור glioma פרפין-מוטבע NS- NS שנאסף בקבוקון T-25 לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, קבוע בפורמלין 10%. לאחר מכן, NS לרחוץ עם HBSS, המוטבעות agarose 2%. Polymerized agarose המכיל glioma NS מוצבים קלטת עבור עיבוד רקמות והטבעה פרפין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : נציג תוצאות אימונוהיסטוכימיה עם HRP-DAB זיהוי של סמנים ביולוגיים. (א-ג) IHC מתבצע על mIDH1 פרפין-מוטבע glioma NS מוכתם ATRX (א) ו- Ki67 (B), wt-IDH1 glioma NS מוכתם OLIG2 (C). חצים אדומים מציינים תאים חיוביים עבור ההכתמה סמן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנחנו פירוט שיטה לשחזור רב-תכליתי לביצוע אימונוהיסטוכימיה על glioma פרפין-מוטבע NS, המקיימות המבנה 3D האופיינית של תאים סרטניים גדל המוח בתוך באתרו. טכניקה זו יש את היתרונות הבאים לעומת באמצעות תאי ציפוי זכוכית או משטחי פלסטיק: אני) שימור המבנה התלת-ממד של NS; ii) הימנעות של מתח התא הדיסוציאציה לפני ניתוח של ביטוי חלבון; iii) שכבתה של כל ביטוי fluorophore אנדוגני מהגידול מהונדס גנטית NS, המאפשרים צביעת על פני ספקטרום פלורסנט; ו- iv) לאחסון לטווח ארוך.
שלב קריטי של טכניקה זו היא להבטיח כי התאים נמצאים מושעה מחדש גם agarose על מנת להבטיח כי הם למשל מבוזרת, לא התאחדו. מגבלה אחת של טכניקה זו היא המדרגות גוזלת זמן הקשורים תא culturing, NS עיבוד לפני IHC צביעת בהליך. מגבלה נוספת היא המספר הגבוה של התאים הדרושים לביצוע בשיטה זו. אם מספר התאים הוא פחות מ 1 x 106 תאים, יהיו פחות מדי תאים לכל שדה ראייה NS אשכולות בכל מקטע. לכן, זה יכול להיות קשה להגיע מספר התאים אידיאלי אם התרבות התא glioma הוא איטי הגוברת. השתמשנו בקבוקון T-25 confluent המכיל לפחות 3.0 x 106 תאים. ניתן לשנות את מספר התאים בשימוש כמו הרצוי; עם זאת, צורך להשיג גלולה NS בגודל המתאים עבור ההליך ההטבעה. אחרי זה, ניתן לטפל NS מוטבע כבלוק פרפין-מוטבע רגיל, ותפעל זה יכול חלוקתה ולא IHC מכתים לנתח ביטוי חלבונים על ידי immunofluorescence או IHC באמצעות DAB מכתים.
לאחר חלוקתה של אבני ובעקבות הפרוטוקול עבור IHC, סעיפים צריך להיות counterstained עם hematoxylin (כחול). אם הרקמה מבטאת את חלבון המטרה, אות חום צריך להיות גלוי (איור 3). אם לאחר IHC המקטעים גם חומה (רקע גבוה), זה יכול להיות בגלל 1) שאינם ספציפיים מושך של הנוגדן המשני, 2) שכבתה לא שלם של peroxidase אנדוגני, או חסימת 3) מספיקים. נושאים אלה ניתן לפתור באמצעות 1) שקופית שליטה שלילי (הדגירה רק עם נוגדנים משניים) כדי לבדוק שאינם ספציפיים קשירה של הנוגדן המשני, 2) להגדיל את peroxidase שכבתה זמן או 3) הגדלת תקופת הדגירה חסימה. מצד שני, אם אין אות זוהה, זה אפשרי כי epitopes הם עדיין רעולי פנים, אשר עשויים להיות קשורים לסוג של המאגר המשמש לאחזור אנטיגן. מניסיוננו, היו לנו משביע רצון מכתים באמצעות מאגר ציטראט, אבל זה יכול להיות רקמת נוגדן ותלוי, והוא יכול לשמש ניסוחים שונים למאגרי אחזור אנטיגן כגון מאגר 0.1 M טריס-HCl (pH 8.0)21. אלה הם כמה מן הבעיות הנפוצות ביותר הקשורות IHC מכתים, אך אם מתעורר קושי אחר, פתרון בעיות צריך להתבצע כמו עם כל IHC אחרים (כלומר., מנסה דילולים שונים של נוגדנים ראשיים ומשניים, חסימת שונים ריאגנטים, פעמים חסימה שונות, וכו ').
שיטה חלופית כדי להעריך ביטוי חלבון באמצעות תאים פרפין-מוטבע תוארה בעבר על ידי האסלבאק. et al. 20. שיטה זו אינה כוללת את השלבים agarose, המאפשרים ב פרוטוקול זה הולם חלוקת האשכולות תא תלת-ממד מיוחד. גם אנו מתארים שיטה מדויקת עבור NS culturing, passaging ומקפיא לאחסון לטווח ארוך. שיטה זו גם ממחישה כיצד לאסוף, לתקן, להטביע NS מבלי לשנות מבנה תלת-ממדי (איור 2).
מאז ניתן להפיק את NS מרקמות glioma המתקבל לחולים ו glioma חייתיים, טכניקה זו מהווה כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לנתח את סמן ביטוי glioma שונים suptypes ולאמת את הדגמים המקוריים. כאן נתאר את הטכניקה עם NS שמקורם עכברים מהונדסים גנטית באמצעות מערכת transposase SB (איור 1). עם זאת, טכניקה זו גם ניתן לנתח החלבון בתאים פרפין-מוטבע glioma האנושי ינבכ תרבויות 3D ללא שינויים בפרוטוקול, מלבד התנאים התרבות תאים. אז, שיטה זו ויכול להיות מיושם גם לתרבויות 3D המתקבל שיפותחו מודלים בעלי חיים, אנושי PDX מודלים אחרים מודלים מהונדס גנטית. לבסוף, ניתן להשתמש בשיטה זו עם סוגים אחרים של סרטן, שני הדגמים העכבר ואת סרטן אנושיים, בנוסף gliomas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות/לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות & קו (NIH/NINDS) מענקים R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 כדי M.G.C.; NIH/NINDS מעניקה R01-NS076991 R01-NS082311, R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; במחלקה הנוירוכירורגית; לבבות שמח של לאה M.G.C., P.R.L.; והיא RNA וההתערבות גרנט F046166 כדי M.G.C. F.M.M. נתמכת על ידי F31 NIH/NINDS-F31NS103500. ג'יי. פי נתמכה על ידי משרד הספורט פולברייט-ארגנטינאי מלגת החינוך.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
