Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур

Published: January 9, 2019 doi: 10.3791/58931
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Cell & Developmental Biology, University of Michigan, 3INIBIOLP, Histology B-Pathology B, School of Medicine, UNLP

Summary

Neurospheres выращивают как 3D культур являются мощным инструментом для изучения биологии глиомы. Здесь мы представляем протокол для выполнения иммуногистохимия при сохранении 3D структура глиомы neurospheres через встраивание парафина. Этот метод позволяет характеристика глиомы нейросферы свойств, таких как stemness и нейронных дифференциации.

Abstract

Анализ выражения протеина в глиомы актуальна для ряда аспектов в изучении его патологии. Многочисленные белки были описаны как биомаркеров с приложениями в диагноз, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Эти анализы биомаркеров полезны также для характеристики опухоли neurospheres (NS) генерируется глиомы пациентов и глиомы модели. Опухоль NS обеспечивают ценный в vitro модель для оценки различных характеристик опухоли, из которого они являются производными и может более точно зеркало глиомы биологии. Здесь мы описываем метод подробный анализ биомаркеров в опухоли NS с помощью иммуногистохимия (IHC) на опухоли парафин врезанных NS.

Introduction

Глиомы являются первичных твердых опухолей центральной нервной системы, классифицируются по их Фенотипические и генотипические характеристики согласно Всемирной организации здравоохранения1. Эта классификация включает в себя наличие или отсутствие драйверов мутаций, которые представляют собой привлекательный источник биомаркеров2. Биомаркеры являются биологические характеристики, которые могут быть измерены и оценены для обозначения нормальных и патологических процессов, а также фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство3. Биомаркеры могут быть обнаружены в опухолевой ткани и клетки, полученные от глиомы, позволяя ее биологических характеристик в различных аспектах. Некоторые примеры глиомы крысы биомаркеров мутировавших isocitrate дегидрогеназа 1 (IDH1), мутант фермента, характерные для младших классов глиомы, связанные с лучше прогноза4. Мутировавшие IDH1 часто выражается в сочетании с TP53 и альфа талассемия/умственной отсталости синдром Х-хромосомой (ATRX)-инактивации мутации, определение конкретных глиомы подтип4,5. ATRX-инактивации мутации также происходят в 44% педиатрических полноценного глиомы2,6 и были связаны с агрессивными опухолями и геномная нестабильность6,7. Кроме того педиатрических диффузных встроенные Понтийские глиомы (DIPG) продифференцируйте в подгруппах по наличие или отсутствие K27M мутации гена гистонов H3 H3F3A, или HIST1H3B/C ген1,6. Таким образом, введение молекулярная характеристика разрешает подразделение, исследования и лечения глиомы как отдельные объекты, которые позволят более разработку более целенаправленных терапии для каждого подтипа. Кроме того анализ биомаркеров может использоваться для оценки различных биологических процессов, например апоптоз8, autophagy9, клеточный цикл прогрессии10, распространения клеток11и дифференцировки клеток12 .

Генетически модифицированные Животные модели, которые гавани генетических в человеческих раковых поражений являются критическими для изучения сигнальные пути, которые посредником прогрессирования заболевания. Наша лаборатория осуществляет использования системы Транспозаза Спящая красоты (SB) в разработке генетически модифицированные мыши модели глиомы, укрывательство специфических мутаций, которые пилки человека глиомы подтипы13,14. Эти генетически модифицированные мыши модели используются для генерации опухоль производные NS, которые позволяют в vitro исследования в системе 3D, зеркального отображения характерных особенностей присутствует в опухоли в situ15. Кроме того orthotopical трансплантация NS в мышей может генерировать вторичные опухоли, которые сохраняют особенности первичной опухоли и имитировать гистопатологические, геномных и фенотипических свойств соответствующей первичной опухоли15.

Сыворотка свободной культуры мозге опухолевых клеток со свойствами стволовых клеток может быть расширен, в присутствии эпидермальный фактор роста (EGF) и факторы роста фибробластов (ФБП), их можно выращивать как единый колоний клеток, полученных как NS культур. В этой системе выборочной культуры большинство дифференциации или дифференцированных клеток быстро умирают, тогда как стволовые клетки разделяют и формируют сотовой кластеров. Это позволяет генерации NS культуры, которая поддерживает глиомы опухоли особенности16,17,18. Глиомы NS может использоваться для оценки некоторых аспектов опухоли биологии, включая анализ биомаркеров, которые находят применение в диагностике, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Здесь, мы подробно протокол для создания глиомы NS и вставлять 3D культур в парафин используемый для окрашивания IHC. Одним из преимуществ установления и внедрения глиомы NS является, что морфология NS поддерживается лучше по сравнению с обычными cytospin метод19, в котором глиомы NS подвергаются стрессовым манипуляции для диссоциации клеток и стали плоскими. Кроме того внедрение утоляет любое выражение эндогенного Флюорофор от генетически опухоли NS, позволяя окрашивание через флуоресцентные спектров. Общая цель этого метода является сохранение 3D структура клеток глиомы через парафин, встраивание процесс и дать характеристику neurospheres глиомы, используя иммуногистохимия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.

1. поколение Neurospheres опухоли мозга, производных от модели мыши

  1. Перед процедурой рассечение, подготовить нервных стволовых клеток СМИ (средства массовой информации НСК: DMEM/F12 с 1 x B27 дополнение, дополнение 1 x N2, 1 x normocin и 1 x антибиотик/противогрибковое дополнена человеческого рекомбинантного EGF и basic ФБП в концентрации 20 нг/мл каждый). Залейте 1,5 мл 300 мкл НСК СМИ и зарезервировать для позже.
  2. Выберите мышь с большой опухоли.
    Примечание: Размер опухоли может контролироваться биолюминесценции если плазмида или вирус вводится кодирует люциферин. Как правило большой опухоли имеет биолюминесценции > 106 фотоны/s/см2/sr.
  3. Усыпить мышь с передозировкой изофлюрановая: наполнить папиросной бумаги с изофлюрановая и ввести ткани в euthanization камере, избегая прямого контакта с мышей для предотвращения раздражения. Подождите, пока мышь не показывать педали рефлекс (обычно 5-10 мин). Обезглавить мыши и вскрыть мозга, как описано в Кэлинеску и др. 13.
  4. Если опухоли флуоресцентные, используйте рассечения микроскопа, оснащенного лампой дневного для определения массы опухоли в головном мозге. С тонкой щипцами вскрыть опухоли (обычно 5-7 мм в диаметре) от нормальной ткани мозга.
  5. Место расчлененных опухоли в 1,5 мл тюбик с НСК СМИ (шаг 1.1). Однородный опухоль с одноразовые пластиковые пестик, который вписывается в стенах пробки microcentrifuge, применяя мягкое давление.
  6. Чтобы разбить ячейки сгустки, добавляют 1 мл фермента бесплатно диссоциации СМИ и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
  7. Фильтрации суспензии клеток через стрейнер ячейки 70 мкм и промойте ситечко с 20 мл НСК средств массовой информации.
  8. Центрифуга на 300 g x 5 мин, сцеживаться супернатанта и вновь приостановить гранулы в 6 мл или 15 мл НСК СМИ, в зависимости от размера гранул.
  9. Пластина суспензию опухолевых клеток в T-25 или T-75 колбу культуры и культуры при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой 95% воздуха и 5% CO2.
  10. После 3 дней передача здорового приостановлено NS и повторно пластины их в T-25 или T-75 колбу культуры ткани. Если необходимо, добавьте больше НСК СМИ к культуре.
    Примечание: Обычно будет смешанная популяция клеток, некоторые будет мертв, некоторые будут соблюдаться, и некоторые будут формировать NS, которая будет плавающей в средствах массовой информации

2. поддержание и пассированый NS

Примечание: Предотвратить разрастание и сохранить клетки в относительно высокой плотности. Слияние определяется размер сферы (черный центры среднего разрастание крупных сфер). Темп роста NS будет зависеть от онкогенов, используемый для создания опухоли.

  1. После того, как NS культура достигла confluency, собирать культуру в стерильных пластиковых пробирок и Пелле NS на 300 x g за 5 мин.
  2. Отменить супернатанта, добавить 1 мл раствора отряд клеток и Пипетка вновь приостановить гранулы.
  3. Инкубируйте при 37 ° C за 5 мин, стряхивая трубку каждые 2 мин, чтобы помочь диссоциации клеток.
    Примечание: Когда NS достигают confluency, они обычно видно макроскопически как маленькие белые шары. Заверить диссоциации клеток, по крайней мере все видимые NS должна исчезли.
  4. Добавьте 5 мл HBSS 1 x и пипетки несколько раз. Пелле клетки на 300 g x 5 мин отбросить супернатант. Вновь приостановите гранулы в 5 мл НСК СМИ с рекомбинантной EGF и основные ФБП.
  5. Добавьте 1 mL клеток до 15 мл НСК средств массовой информации и культуры в T-75 колбу при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой 95% воздуха и 5% CO2.
  6. Добавите факторы роста (EGF и основные ФБП) каждые 3 дня. Если средства массовой информации превращает свет оранжевый и клетки еще не вырожденная, изменить средствами массовой информации. Чтобы сделать это, центрифуга NS на 300 g x 4 мин и вновь приостановить в НСК СМИ с факторами роста.
    Примечание: В зависимости от размера гранул сформирован, клетки может потребоваться разбить на более колбы.

3. Замораживание NS для длительного хранения

  1. Когда NS культура становится вырожденная, разъединять клетки, как описано в шагах 2.1-2.4. Когда гранулы было вновь приостановлено в HBSS, удалите Алиготе и подсчитать количество ячеек.
  2. Центрифуга клетки на 300 g x 4 мин и удалить как можно больше из супернатант.
  3. Вновь приостановите Пелле в замораживания средств массовой информации (тепло инактивированная FBS, 10% ДМСО). Рекомендуется заблокировать между 1 x 10-6 и 3 х 106 клеток на флакон мл.
  4. Разделите снова приостановлено клетки столько криопробирки как необходимые и медленно остыть флаконы первой передачи их в лед, а затем до-20 ° C, затем до-80 ° C и, наконец, на следующий день в контейнер для хранения жидкого азота.

4. Фиксация опухоли NS

  1. Культура опухоли NS в T-25 колбу для 2-3 дня до тех пор, пока клетки вырожденная (~ 3 х 106 клеток). Соберите опухоли NS в 15 мл Конические трубки от наименее один T-25 вырожденная колбу. Окатышей на 300 g x 5 мин.
  2. Вновь приостановить гранулы в 1 мл 10% формалина и держать при комнатной температуре (RT) на 10 минут добавить 5 мл 1 x HBSS и Пелле клетки, как это сделано в шаге 3.2. Повторите этот шаг еще раз.
  3. Место 15 мл Конические трубки, содержащие гранул на льду.

5. Парафинотерапия встраивание опухоли NS

  1. Вновь приостановить промывают Пелле NS в 500 мкл 2% теплую жидкость агарозы и осторожно перемешать, закупорить.
  2. Сразу же место агарозы встроенный NS на льду до тех пор, пока polymerizes агарозы. Удалите часть агарозы укрывательство NS. Поместите полимеризованной агарозы кусок с NS в кассету для ткани, обработки (рис. 2).
  3. Продолжить обработку ткани (с использованием процессора автоматический парафин) и парафина, встраивание (с помощью внедрения станции).

6. Вырезание от парафин врезанных NS

  1. Установить ванну водой до 42 ° C и вставить лезвие на микротом, тщательно с использованием две кисти, чтобы убедиться, что он выровнен. Используйте этот блейд только для обрезки.
  2. Поместите блок парафина на микротома. Недоминирующих рукой нажмите вниз на рычаг, расположенный на левой стороне, определяющее толщину каждого раздела. Нажмите для второй остановки, указывающее толщиной 30 мкм.
  3. Начать, обрезка блока (т.е., удаление избыточного парафина), повернув колесо грубая рука с правой рукой, пока не достигнут поверхности образца. На данный момент отпустите рычаг, который управляет отделку толщиной до 10 мкм или 5 мкм. Остановите обрезки при достижении поверхности образца.
  4. Заполните поле льда со льдом и добавить достаточно воды, так что когда парафин блок устанавливается на льду, вода действует как фильм вокруг блока парафин, защищая его от непосредственно прикосновение льда. Инкубируйте блоком парафина на льду за 20 мин.
  5. Отказаться от старых лезвие и вставить новый для разрезания. Сухой блок с помощью Марли, затем поместить его на микротома.
  6. Недоминирующих рукой получите пару Изогнутый пинцет, который будет использоваться для тянуть ленте парафина. Держите влажной кистью возле правой рукой, которая будет использоваться для передачи ленты парафина на водяной бане. Начать раздел, повернув колесо грубая рука с правой рукой в быстром темпе. Используйте щипцы в левой руке провести ленте парафина.
  7. Использование влажной кистью для передачи ленты парафина на водяной бане.
  8. Используйте кривой щипцы для развалится разделы поверхностно размещение щипцы между двумя парафиновых срезах, а затем осторожно нажав две секции прочь.
    Примечание: Это движение должно быть полностью на поверхности раздела парафина. Не нажимайте на секции.
  9. Использование влажной кистью подтолкнуть разлученных парафиновых срезах на скольжениях микроскопа положительно заряженных адгезии.
  10. Разрешить слайды для сухой ночлег перед их сохранением в слайд коробки внутри химические вытяжки. Хранения слайдов зависит от типа выполняется пятно.

7. иммуногистохимия (IHC) парафин врезанных NS

  1. Расплава парафина, поместив слайды в металлический стеллаж и инкубации их на 60 ° C в течение 20 мин.
  2. Deparaffinize слайды по инкубации в поезде регидратации в RT: 3 x ксилоле на 5 мин, 100% этанола 2 x 2 мин., 95% этиловом спирте 2 x 2 мин, этанол 70% 1 x 2 мин и 1 x деионизированной воды на 2 мин Ирэон, держите слайды в водопроводной воде до получения антигена , как высыхание вызовет неспецифической антитела связывая.
  3. Инкубируйте слайды в буфере цитрат (10 мм лимонной кислоты, 0,05% неионные моющего средства, pH 6) при 125 ° C для 30 s и на 90 ° C для 10 s. Дайте им остыть, затем ополосните слайды 5 раз с дистиллированной водой.
  4. Инкубируйте слайды в РТ в 0,3% H2O2 за 30 минут.
  5. Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера (0,025% моющего средства в TBS) на 5 мин с нежным агитации.
  6. Инкубируйте слайды на RT с блокировкой раствора (10% лошадь сыворотки, 0.1% BSA в TBS) за 30 мин.
  7. Инкубируйте слайды на ночь при 4 ° C в камере увлажненный с основного антитела, подготовленный в разведении раствора (0,1% BSA в TBS). Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера на 5 мин с нежным агитации.
  8. Инкубируйте слайды в РТ за 1 ч с биотинилированным вторичное антитело, подготовленный в разведении раствора. Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера на 5 мин с нежным агитации.
  9. Инкубируйте слайды на RT в темноте за 30 минут с авидин биотинилированным пероксидаза комплекса. Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера на 5 мин с нежным агитации.
  10. Инкубируйте слайды с DAB-H2O2 субстрата брендов здесь для 2-5 мин на RT.
  11. 3 раза Промыть водопроводной воды. DIP (1-2 сек) слайды, в решение гематоксилином изображение и тщательно промойте их в водопроводной воде до очистки.
  12. Обезвоживает слайды следующим: инкубировать в дистиллированной воде в течение 2 мин, окуните 3 раза в 80% этанола, инкубировать в 95% спирте 2 раза по 2 мин, инкубировать в 100% этиловом спирте 2 раза по 2 мин каждая и наконец в ксилоле 3 раза за 3 мин.
  13. Coverslip слайды с средство на основе ксилол монтажа и дайте им высохнуть на плоской поверхности на RT, пока они не готовы для обработки изображений.       Примечание: Если выполнение 3, 3'-диаминобензидин (DAB) окрашивание, слайды могут храниться на RT. Однако если выполняется окрашивание иммунофлюоресценции, слайды должны храниться в темноте на 20 ° C до уменьшения обесцвечивания фото.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для мониторинга развития опухоли и оценить, если опухоль достигла размера, необходимого для создания NS, мы проанализировали люминесценции, испускаемых опухоли с помощью биолюминесценции. Это позволяет исследование эффективности трансдукции детенышей и прогрессии опухоли, сигнал люминесценции Люцифераза (рис. 1A и 1B). Когда размер опухоли достигает сигнал 1 x 107 фотоны/s/см2/sr (рис. 1Б), мозг может быть обработан для генерации NS. Еще одним преимуществом этой системы является, что кодирующая последовательность различных флуоресцентных белков могут добавляться к плазмид, используемые для доставки и опухоли поколения гена. Затем мы можем подтвердить выражение вставленной генетические изменения, используя рассечения микроскоп оснащен люминесцентная лампа (рис. 1C). NS, сформированных из wt-IDH1 (рис. 1D) и mIDH1 (рис. 1E) опухоли идентифицируются по характерным сферических морфологии и выражение флуорофоров, связанные с конкретными генетическими поражения ( т.е.., GFP связанные с shATRX и shp53 и Катюшка, связанные с mIDH1; Рисунок 1 D и 1E). Чтобы продолжить IHC на NS, клетки фиксированной, то встроенный в агарозы и парафина (рис. 2). Встраивание NS в парафиновых блоков имеет ряд преимуществ, включая сохранение трехмерных структур NS и позволяя для длительного хранения. Встроенный NS может быть запятнано для конкретных глиомы крысы биомаркеров. Используя эту технику, мы проанализировали выражение ATRX, Ki67 и OLIG2 (Олигодендроциты дифференциации маркер) (рис. 3A-3_C). Мы подтвердили, что уровни низких выражения ATRX белка в наших NS культур (рисA), которая является особенностью LGG глиомы подтипа в настоящее время будучи учился4. Кроме того Ki-67, хорошо описано биомаркеров пролиферации клеток, был положительным в mIDH1 NS (Рисунок 3B), продемонстрировав активного распространения, которая является ключевой особенностью опухолевых клеток. Интересно, что клетки, локализованные в центре больших кластеров NS глиомы были отрицательными для Ki-67 (Рисунок 3B), указав, что они не распространяются, в отличие от позитивных клеток Ki-67, локализован на периферии. Это явление может быть связано с тем, что периферийные клетки не имеют доступа к питательные вещества от роста средств массовой информации. Когда они достигают этого большего размера, следует отделить и пассированной глиомы NS. Наконец NS wt-IDH1 были положительными для Olig2, транскрипционный фактор, участвующих в Олигодендроциты дифференциации (рис. 3C).

Figure 1
Рисунок 1 : Neurospheres глиомы, созданные из GFP - и Катюшка позитивных Спящая красоты (SB) опухоли мозга. (A) светящийся сигнал мыши новорожденным вводят с SB-Транспозаза плазмид в сочетании с плазмид, укрывательство генетических повреждений побудить глиомы (НКО/shP53/shATRX/IDH1-R132H). (B) свечения, указывающее развитие опухоли в 132 дней впрыск (DPI). (C) A ярко поле и люминесцентные изображения мозга, добываемых из мыши, которые находятся на стадии конечной точки. Опухоли области сформулированного пунктирной линией и позитивным для флуоресцентных репортеров, GFP и Катюшка. (D и E) Neurospheres опухоли образующиеся SB опухоли мозга выразив GFP, связанные с shP53 и shATRX; и Катюшка, связанные с IDH1-R132H. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представление рабочего процесса для парафин врезанных глиомы NS. NS собраны из T-25 колбу в 15 мл Конические трубки и исправлена в формалина 10%. Затем NS промывают HBSS и встроенные в 2% агарозы. Полимеризованная агарозы содержащие глиомы NS помещаются в кассету для обработки тканей и встраивание парафина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Представитель Результаты иммуногистохимии с ПХ-DAB обнаружения биомаркеров. (A-C) IHC на парафин врезанных mIDH1 глиомы NS витражи для ATRX (A) и Ki67 (B), и wt-IDH1 глиомы NS витражи для OLIG2 (C). Красные стрелки показывают положительные клетки для окрашивания биомаркеров. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы подробно универсальным и воспроизводимый метод, чтобы выполнить иммуногистохимия на парафин врезанных глиомы NS, которые поддерживают характерным 3D структура клеток опухоли, растущие в мозг в situ. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с использованием клеток покрытием на стеклянных или пластиковых поверхностей: i) сохранение 3D структуры НС; II) избегая стресса диссоциации клеток перед анализ экспрессии белков; III) закалки любых эндогенных Флюорофор выражения из генетически опухоли NS, позволяя окрашивание через флуоресцентного спектра; и iv) длительного хранения.

Важнейшим шагом этой техники заключается в обеспечении, что клетки вновь приостановлено в агарозы для обеспечения что они содержанием однородно распределяются и не сгруппировать вместе. Единственным ограничением этой методики является длительным шаги, связанные с культивирования клеток и NS, обработки перед IHC пятная процедуру. Вторым ограничением является большое количество клеток, необходимых для выполнения этого метода. Если количество клеток меньше чем 1 x 106 клеток, будет слишком мало клеток на поле зрения NS кластеров в каждом разделе. Таким образом это может быть трудно достичь идеальное количество клеток, если культура клеток глиомы, медленно растущих. Мы использовали вырожденная T-25 флакон, содержащий по крайней мере 3.0 х 106 клеток. Количество ячеек, которые используются может быть изменен как желаемого; Однако это необходимо для получения гранул NS соответствующего размера для внедрения процедуры. После этого Встроенный NS можно манипулировать как регулярные парафин врезанных блок, и он может затем перейти к секционирование и IHC окрашивания для анализа выражения протеина, иммунофлюоресценции или IHC, с помощью окрашивания DAB.

После разрезания блоков и после протокол для IHC, разделы должны быть counterstained с гематоксилином (синий). Если ткани выражает целевого белка, коричневый сигнал должен быть видимым (рис. 3). Если после IHC секции слишком коричневый (высокий фон), это может быть вызвано 1) неспецифической biding вторичные антитела, 2) неполной закалки эндогенной пероксидазы, или блокирование 3) недостаточно. Эти вопросы могут решаться с помощью 1) отрицательный контроль слайд (инкубировали только с вторичное антитело) для проверки привязки неспецифических вторичных антител, 2) увеличение глутатионпероксидазы, закалки время или 3) увеличение блокировки инкубационный период. С другой стороны если сигнал не обнаружен, возможно, по-прежнему масках epitopes, которая может быть связана с тип буфера, используемого для извлечения антигена. В нашем опыте мы имели удовлетворительный окрашивание с помощью буфера цитрата, но это может быть ткани - и антитела зависимой, и различных формулировок для антигена извлечения буферов может использоваться как 0.1 М трис-HCl (рН 8,0) буфера21. Вот некоторые из наиболее распространенных проблем, связанных с IHC окрашивания, но если другие сложность возникает, устранение должно осуществляться как с любой другой IHC (т.е., пытаясь различных разведениях первичных и вторичных антител, различные блокировки Реагенты, различные времени блокировки, и т.д.).

Альтернативный метод для оценки выражения протеина используя парафин врезанных клетки ранее был описан Hasselbach и др. 20. Этот метод не включают в себя агарозы шаги, позволяющие в этом протоколе адекватное распределение специальных 3D ячейки кластеров. Мы также обсудим точный метод для NS культивирования, пассированый и замораживания для длительного хранения. Этот метод также показывает, как для сбора, исправить и внедрить NS без изменения структуры 3D (рис. 2).

Так как NS может быть создан из ткани глиомы, полученных от пациентов и глиомы Животные модели, этот метод представляет собой мощный инструмент, который может использоваться для анализа биомаркер выражение в различных глиомы suptypes и проверки оригинальных моделей. Здесь мы опишем технику с NS, возникла из генетически мышей с использованием SB Транспозаза системы (рис. 1). Однако этот метод может также использоваться для анализа белка в клетках парафин врезанных человека глиомы, которые растут как 3D культур без изменений к протоколу, за исключением условий культуры клеток. Таким образом этот метод может также применяться к 3D культур, полученные из которые спасаютжизньпритрансплантации животных моделей, человека PDX моделей и других генетически модифицированных моделей. Наконец этот метод может использоваться с другими типами рака, как мыши модели, так и человеческих раков, помимо глиомы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) гранты R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 до M.G.C.; NIH/NINDS предоставляет R01-NS076991, R01-NS082311 и R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Кафедра нейрохирургии; Счастливые сердца Лии M.G.C. и P.R.L.; и РНК биомедицины Грант F046166 в M.G.C. F.M.M. поддерживается путем F31 NIH/NINDS-F31NS103500. Ю.П. была поддержана Фулбрайта-аргентинский Министерства спорта и образования стипендий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated microtome blade HP35 Thermo Scientific 3150734
Microtome RM 2135 Leica MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-aldrich HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX, Santa Cruz Biotechnology sc-15408 IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67 Abcam Ab15580 IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT Biocare medical BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
N-27 Supplement ThermoFisher A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution Biolegend 423201
AGAROSE LE GoldBio A-201-1000
Genesee Sc. Corporation Olympus 15 ml 21-103
Genesee Sc. Corporation TC-75 treated Flask 25-209
Genesee Sc. Corporation TC-25 treated Flask 25-207
DMEM/F12 Gibco 11330-057 NS media
HBSS GibcoTM 14175-103 balanced salt solution
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
  2. Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
  3. Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
  4. Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
  5. Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  6. Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
  7. Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
  8. Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
  9. Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
  10. Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
  11. Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
  12. Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
  13. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  14. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).
  15. Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
  16. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
  17. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
  18. Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
  19. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
  20. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
  21. Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).

Tags

Исследования рака выпуск 143 генной инженерии глиомы neurospheres 3D-культур иммуноокрашивания биомаркеры парафин встраивание
Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Núñez, F. J., Mendez, F.… More

Núñez, F. J., Mendez, F. M., Garcia-Fabiani, M. B., Pardo, J., Edwards, M., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (143), e58931, doi:10.3791/58931 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter