Manejo y evaluación de la cultura humana organoide de próstata primario

Organoides son una valiosa herramienta para el estudio de la organogénesis y la enfermedad. Ofrecen una alternativa menos costosa a modelos animales y organoides derivados del paciente están evolucionando como estrategia de medicina personalizada^1,2,3. Este sistema de cultivo (3D) tridimensional implica la siembra de células madre o progenitoras (extraídas del tejido o inducida de células madre pluripotentes) en un gel de matriz extracelular componentes (gel de la matriz)⁴. Las células proliferan y diferencian, dando lugar a estructuras organotypic que recapitulan la jerarquía celular y morfología de los órganos de la unidad funcional de interés. Organoides se han cultivado con células procedentes de una variedad de órganos, incluyendo glándulas salivales, estómago, intestino, hígado, próstata, pulmón y cerebro⁴. Aunque existen numerosos protocolos que describen los pasos para establecer organitas próstata^5,6, es difícil encontrar métodos suficientemente detallados sobre cómo lograr criterios de valoración cuantitativas de organoides. Este artículo resume los métodos desarrollados para las células humanas de próstata primarias y detalla una serie de puntos finales sugeridos para determinar los fenotipos de organoide. Estas técnicas fueron optimizadas para próstata organoides y pueden ser aplicables a otros cultivos celulares 3D.

Organoide próstata culturas han surgido recientemente como un modelo valioso en vitro que carece de las limitaciones de las culturas de monocapa utilizando estableció líneas celulares inmortalizadas. Epitelio benigno de próstata y cáncer de próstata es un desafío al modelo en vitro con líneas celulares inmortalizadas. El número de líneas celulares benignos es limitado, y todos han experimentado transformación con oncogenes⁷. Células epiteliales próstata primarias en monocapas no se diferencian en las células luminales y carecen de receptores de andrógeno⁸. La mayoría de líneas celulares de cáncer de próstata no tienen receptores androgénicos funcionales, un importante mediador de estado temprano de la enfermedad y falta clave los cambios genéticos que se han encontrado en tumores de pacientes⁹. Organoide próstata culturas pueden cultivarse fácilmente de epitelio benigno y son valiosas en el estudio de propiedades de células madre, células progenitoras, la diferenciación y efectos de los cambios experimentales en el microambiente^4,5. Cáncer de próstata organitas pueden cultivarse como parte de un enfoque de la medicina de precisión para modelado de enfermedad del paciente y la respuesta a terapias¹⁰.

Este protocolo ha sido recopilada de los protocolos que utilizan diversos tipos celulares, pero se ha optimizado aquí para su uso en células humanas de próstata primarias. Complementa los protocolos descritos por aserradores, Clevers y Shen^5,6 que describen el crecimiento, pases, proyección de imagen de campo claro, criopreservación y aislamiento de ARN y ADN de próstata mouse y organitas humano. Se modifica el protocolo conjunto de montaje de Mahé et al. ¹¹, organitas epitelial gastrointestinal que describe en vivo imagen y congelados e inclusión en parafina. Borten et al. ¹² se describe el análisis de mama, colon y cáncer colorrectal organoide morfología de proyección de imagen de campo claro. Además, Richards et al. ¹³ utiliza un método para la evaluación morfológica de próstata organitas. Finalmente, Hu et al. ¹⁴ describe un método de adhesión próstata organitas en una diapositiva de la cámara durante la noche antes de la tinción inmunofluorescente para observar las células y la dispersión de las esferas para el análisis de citometría de flujo.

El objetivo de este protocolo es demostrar detalladamente estos métodos técnicamente desafiantes como un protocolo, incluyendo la siembra de la célula; los medios de comunicación y de la matriz del gel mantenimiento; colección de células por citometría de flujo; ARN, ADN y extracción de proteínas; evaluación morfológica de análisis de campo brillante z-stack; inclusión, de transformación y seccionamiento para tinción histológica; y todo por inmunofluorescencia o análisis de la sonda fluorescente. La importancia biológica y la interpretación de estos diferentes criterios de valoración variarán entre anticuerpos utilizados para análisis y diseño experimental. A través de la utilización de este protocolo, los usuarios deben sentirse preparados para establecer un experimento con un conjunto de puntos finales.

Células epiteliales prostáticas primarias humanas (PrE) se establecieron en el laboratorio por el protocolo descrito por Peehl^15,16 y mantiene a un número limitado de pasajes (hasta cuatro) como se describió anteriormente¹⁷, pero también son disponibles de proveedores comerciales. Hepatocitos libre de suero basado en los medios de comunicación⁶, KSFM-base¹³y R-spondin acondicionado 1⁵ medios de comunicación se publican como haber elaborado con éxito organitas. KSFM-basado requiere la menor cantidad de aditivos, por lo que se describe aquí.

El siguiente protocolo se optimizó utilizando células epiteliales próstata primarias humanas de tejido de pacientes de la Universidad de Illinois en Chicago Hospital. Todos los tejidos humanos utilizados para estos experimentos eran adquiridos a través de una Junta de revisión institucional aprobó protocolo o exención de la Universidad de Illinois en Chicago. Mientras que las condiciones de cultivo variará dependiendo del tipo de células de interés, los extremos se pueden aplicar a organoides de otros tejidos.

1. siembra de células epiteliales en Gel de la matriz y cambiando los medios de comunicación

1. Recoger los materiales necesarios: humanas primarias próstata las células epiteliales (PrE), gel de la matriz en el hielo, microplacas de 96 pocillos, queratinocitos libre de suero los medios de comunicación (KSFM) en hielo, carbón de leña suero fetal bovino (FBS) y dihidrotestosterona (DHT).
2. Preparar medios basados en KSFM organoide combinando 47,5 mL de KSFM con 2,5 mL de SBF carbón de leña y dihidrotestosterona (DHT) a una concentración final de 10 nM DHT, luego reserva en el hielo.
3. Células de la placa en una matriz 3D en una campana de cultivo celular utilizando una técnica estéril.
   1. Suavemente mezcla fría organoide KSFM-base media con el gel de matriz helada para obtener una matriz 50% gel mezcla por lentamente pipeteo arriba y abajo, evitando burbujas.
      Nota: Gel de la matriz debe ser descongelada durante la noche a 4 ° C y mantenerse en hielo siempre que sea posible. Solidifica rápidamente a temperatura ambiente (RT).
   2. Humedezca previamente la punta de una pipeta en medios fríos y la transferencia de 40-50 μL de matriz 50% gel en la parte inferior de cada pocillo para ser utilizado en una placa de 96 pocillos. Cubrir el fondo del pozo para formar una capa de base.
      Nota: No entrar completamente a la segunda parada en la pipeta, ya que esto puede crear burbujas.
   3. Coloque la placa de 96 pocillos en incubadora de 37 ° C durante 30-45 min solidificar la capa base.
      Nota: No placa de células epiteliales sobre la capa base hasta que haya solidificado, o las células pueden caer a través de la matriz en la parte inferior de la placa y crecen como una monocapa.
   4. Mezcla de células epiteliales suspendidas en medios basados en KSFM organoide con 33% matriz gel y gel de la matriz para alcanzar una concentración final de 100 – 1.000 células/100 μL. Células epiteliales de la placa en la parte superior capas base con 100 μL de mezcla de célula de gel de matriz 33% por pozo.
      Nota: Experimentos previos han demostrado que siembra células epiteliales muy densamente en 3D será restringir el tamaño de crecimiento organoide, mientras siembra demasiado escasa puede resultar en muy bajo rendimiento¹³. Es importante optimizar las condiciones de siembra para el tipo de la célula de interés, con base en la eficiencia de formación específico para cada paciente organoide.
4. Colocar la placa de 96 pocillos en una incubadora de 37 ° C por 30-45 min permitir que el gel de la matriz que se solidifique, luego suavemente añadir 100 μL de medio de organoide KSFM basado sobre células transfiriendo lentamente contra el borde del pozo.
5. Cambiar el medio cada 2-3 días. Pipeteo contra el lado del pozo con el espacio entre el gel de los medios de comunicación y de la matriz, retire con cuidado 50 μL de los medios de comunicación y reemplazar con 50 μL de medio fresco.
   Nota: Para un cultivo a largo plazo, el gel de la matriz debe ser cambiado cada 2 – 3 semanas. Si la cultura de gel de la matriz aparece inestable y muestra arrugas translúcidas bajo el microscopio, el gel de la matriz ha roto y necesita ser reemplazada.

2. colección de organoides del Gel de la matriz de

Nota: Organoides es necesario para cambios de matriz gel, pases o puntos finales de extracción de RNA, la extracción de ADN, extracción de proteínas y citometría de flujo.

1. Proteasa neutral cálido y Hanks habían equilibrada solución de sal (HBSS) en un baño de agua de 37 ° C.
2. Retire con cuidado los medios de comunicación de pozos sin interrumpir el gel de la matriz.
3. Añadir ~ 200 μL de proteasa neutral a cada bien en un ~ 1:2 relación de proteasas de matriz gel: neutral e incubar por 20 min a 37 ° C.
4. Disocian mecánicamente la mezcla de proteasas de matriz gel: neutral mediante pipeteo arriba y abajo.
5. Incubar por 20 min a 37 ° C.
6. Transferir la mezcla de gel-cell matriz de proteasa neutral a un tubo cónico, según el volumen o tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 300 x g durante 3 – 5 minutos para que sedimenten las células.
   Nota: Si no hay precipitado de células aparece, el gel de matriz no puede ser totalmente disociado y puede visualizarse como una fase translúcida en la parte inferior del tubo distinto el sobrenadante de color de rosa. Quite el sobrenadante y agregar proteasa más neutral en una proporción de 1:2 matriz de la pelotilla de gel, incubar otro 20-40 min a 37 ° C y repetir la centrifugación a 300 x g.
7. Cuando se adquiere una pelotilla de organoide, eliminar el sobrenadante. Proceder con pases (ver paso 2.7.1), lisis de organoides para la extracción de RNA, DNA o proteína (ver paso 2.7.2), solo de procesamiento de células por citometría de flujo y secuenciación unicelular (ver paso 2.7.3).
   1. Para la cultura a largo plazo, resuspender suavemente organitas intacto en 33% matriz fresco gel y placa siguiendo los pasos descritos en los pasos 1.1 – 1.5. Para disociar organoides y replate como células individuales, Resuspender el precipitado en 1 mL de enzimas disociación celular caliente e incubar a 37 ° C por 10 – 15 min., lave una vez con 5 mL de HBSS y nuevamente la placa en el gel de matriz fresco siguiendo pasos 1.1 – 1.5.
   2. Resuspender el precipitado de organoide en un tampón de lisis apropiado para extracción de RNA, la extracción de ADN o la extracción de proteína como se indica en la Tabla de materiales y seguir el protocolo del fabricante.
   3. Suspender organitas en 1 mL de enzimas disociación celular caliente e incubar a 37 ° C durante 10-15 min a disociar las organitas en celdas individuales. Una vez lavado con 5 mL de HBSS y proceder con el protocolo de flujo cytometry⁵ o unicelular secuencia¹⁸.
      Nota: Para disociar a las células a concentraciones bajas de gel de la matriz, la proteasa neutral puede no ser necesaria, y las enzimas de la célula-disociación pueden ser aplicadas directamente al pozo tras el paso 2.2.

3. todo bien imagen adquisición y análisis de la morfología de organoide

1. Adquirir imágenes de conjunto bien z-pila usando un microscopio invertido de luz transmitido con un motorizado X / Y análisis etapa (flujo de trabajo ilustrado en la figura 1A).
   1. Con la posición focal ajustada a la parte inferior del pozo, comienzan enfocando hacia arriba hasta la primera organoide, que será en el centro del pozo debido al menisco de la capa base. Establecer el plano inferior de la z en esta posición.
   2. Continuar enfocando hacia arriba hasta que el último organoide en foco, en la periferia del pozo. Establecido por el plano z superior en esta posición.
      Nota: Después de colocar la parte superior e inferior de la pila de z, asegúrese que estas posiciones capturan las organitas dentro de todos los pozos restantes y ajustan superior o inferior según sea necesario. Esto permite que el rango de z para una exploración individual que incluye cada organoide dentro de cada pozo.
   3. 15-35 z-planos por pozo, con un número más grande para una mayor resolución de captura. Capturar toda la imagen bien, combinar y recoger cuadrantes o subsecciones si es necesario.
      Nota: Se recomienda tomar varios planos de z en lugar de un solo plano z, como se ilustra en la figura 1B que organoides son fuera de foco cuando se capturan solo z-plane.
   4. Guardar imágenes z-stack para análisis posteriores.
2. Analizar imágenes utilizando el software de imagen con capacidades de dibujos de forma libres.
   1. Abrir una sola imagen z-avión de paso 3.1.4.
   2. Si es necesario, azulejo de las imágenes tomadas en cada plano de z individual en una sola imagen de todo bien. Guardar la nueva imagen como un archivo independiente. Repita este proceso para cada plano z adquirido.
   3. Usando el software de imagen, abra la imagen todo bien para cada plano z de un solo pozo y crear una extendida profundidad de imagen de campo (FED) de la pila de planos de z.
      Nota: Este tipo de imagen que seleccione la mejor región de enfoque de cada plano z para crear una sola imagen en foco del pozo.
   4. Establecer la escala de píxel del software en la barra de escala de la imagen que se está midiendo.
   5. Utilizando la herramienta de dibujo libre del software de imagen, traza el perímetro de cada organoide en el pozo.
   6. Obtener los parámetros de la medición de perímetros de organoide trazado desde el software de la imagen.
      Nota: Los parámetros recomendados son área, circularidad y relación máximo/mínimo. Resultados representativos que ilustran la aplicación de estas métricas se muestran en la figura 1. Área se calcula a partir del polígono definido por el perímetro de los organoides. Circularidad es la relación de la zona de organoides para el área de un círculo con ferret máximo de diametro igual el organoide, donde 0 es menos circular y 1 es más circular. Radio máxima y mínima proporción es la relación entre el radio máximo y el mínimo radio de organoide trazado.
      Circularidad =
      Relación de radio =

4. parafina y la fijación de formalina incrustación de organoides para extremos histológicas

1. Preparar suministros empotrar: HBSS, solución agar al 2%, colorante histológico marca, gel de histología, pipeta tip molde, cinta, émbolo de una jeringa de insulina 1 cc, paquete de hielo, cintas, 10% formalina tamponada neutra (NBF), lápiz y etanol (EtOH) del grado histológico de 75%.
   1. Preparar dos tubos de microcentrífuga de solución al 2% agar. Incubar en baño de agua o en un bloque de calor a 100 – 110 ° C para mantener el agar en forma líquida. Añadir 1-2 gotas de histologic marcado tinte a una de las soluciones de agar al 2%, que se denotan en la parte superior del agar enchufe y ayudar a mantener la orientación durante la incrustación. Mezclar bien.
   2. Calentar el gel de histología en un bloque de calor o baño de agua a 55-65 ° C.
   3. Usando una punta de pipeta de 1000 μL, para crear moldes de cortar una pequeña sección de la punta para hacer un cilindro que contiene ~ 50 μL. Crear un molde en segundo lugar, más amplio que se ajusta alrededor del primer molde.
   4. Crear un bloque frío envolviendo una bolsa de hielo con cinta (adhesiva hacia arriba) y moldes en la cinta de adhesión.
   5. Crear un émbolo al quitar el émbolo de una jeringa de insulina 1 cc.
2. Incrustar las organitas en un tapón de gel de histología para el proceso, siguiendo el flujo de trabajo representado en la figura 2A.
   1. Disocian el gel de matriz y organoides de pellets siguiendo pasos 2.1-2.7.
   2. Lavar el pellet de organoide una vez con 1 mL de HBSS y volver a la pelotilla por spinning por 3 – 5 min a 300 x g y eliminar el sobrenadante.
   3. Vuelva a suspender el sedimento organoide en 30-50 μL de gel líquido de histología. Mezclar suavemente transfiriendo hacia arriba y hacia abajo lentamente. Transferir la mezcla de gel/organoide de histología en un molde en el bloque frío y permita que la muestra se enfríe y solidifique en un enchufe.
   4. Utilice un émbolo para empujar el tapón fuera el molde pequeño y en el molde más grande. Pipeta clara 2% de agar en el tapón para llenar el molde más grande.
   5. Pipeta histológico teñido por el tinte 2% de agar en la parte superior del enchufe para denotar la parte superior de la muestra.
   6. Una vez fríos, use un émbolo para transferir el enchufe en un cassette de histología. Etiqueta del cassette con un lápiz y lugar del cassette en 10% NBF de fijación durante la noche.
   7. El cassette de la transferencia del 10% NBF al grado histológico de 70% EtOH.
3. Proceso el gel histología enchufe utilizando un protocolo de biopsia preestablecidos en un procesador, si está disponible. Si la programación no está disponible, de entrada la siguiente secuencia y longitud: 70% EtOH durante 6 min, 70% EtOH por 10 min, 80% EtOH durante 10 min, 95% EtOH 2 veces por 10 min, 100% EtOH 3 veces durante 10 min, xileno durante 15 min 3 veces , y parafina durante 15 minutos 3 veces la desviación de la recomendada procesamiento de secuencia puede resultar en ruptura organoides (Figura 3A).
4. Insertar el tapón del gel de la histología con la porción coloreada hacia arriba, como esto permitirá que la parte decolorada que contiene el organitas a ser seccionados en primera.
5. Sección la histología FFPE gel de bloques:
   1. Recoger insumos necesarios: histología FFPE gel bloques, pluma de histología, tejido flotador agua baño, cubo de hielo con hielo, microtomo, cuchillas para microtomo, incrustación de estación de trabajo, cargado positivamente portaobjetos de microscopio y el horno de laboratorio.
   2. Baño de agua de relleno hasta que es muy completo y conjunto a 40 ° C, a continuación, horno de laboratorio previamente caliente a 45-50 ° C.
   3. Preparar un cubo de hielo, llene con hielo y agregue agua para crear una mezcla de agua helada. Enfriar los bloques de hielo hasta que estén muy fríos.
      Nota: Bloques pueden ajustarse en hielo hasta por 1 día, pero si se deja durante la noche, los bloques se ser hidratados y tendrán que ser reprocesado.
   4. Inserte un bloque en micrótomo cinta sujeción, añadir la hoja de soporte de la cuchilla y liberar cualquier bloqueo medidas de protección en la máquina.
   5. Comenzar por recortar la cara del bloque de parafina (frente a frente) en un espesor de 10 μm. Una vez que surge una sección que contiene la zona de enchufe deje de recortar, bloquear el rotor para Microtomo y transferir el bloque en el hielo para enfriar. Si varios bloques han de ser seccionados, cara a cara cada bloque antes de trasladarse a paso 4.5.6.
   6. Mover la cuchilla a una parte nueva, sin usar y transferir el bloque a la abrazadera. Desbloquear la máquina y empezar a recortar en 5 μm por sección.
      Nota: 5 μm se recomienda para obtener los mejores resultados, pero también es aceptable 3-10 μm.
   7. Con unas pinzas, la sección de transferencia a la bañera de agua de 40 ° C y permitir que la sección difundir hacia fuera. Transferencia de la sección en una diapositiva por sumergir verticalmente en el agua.
      Nota: Inmersión en un ángulo puede transferir burbujas desde el fondo de la bañera a la sección y causar distorsión de la muestra.
   8. Visualizar la sección al microscopio (figura 2BC).
      Nota: Si un organoide presente, aparecerá similar a la flecha roja en la figura 2B. Burbujas (figura 2B, flecha azul) pueden aparecer similares a organoides y son más fáciles de discernir en una diapositiva de fresco como seco organitas translúcida (figura 2). Si no organitas están presentes, además la sección en el bloque.
6. Cuando diapositivas que contengan organitas han sido adquiridos, del círculo el área alrededor de la sección en la parte posterior de la corredera con una pluma de histología y hornéelas durante la noche a 45 – 50 ° C.
7. Reunir diapositivas y proceder a H & E (ver paso 4.9.1), inmunohistoquímica (ver paso 4.9.2), o inmunofluorescente de tinción (ver paso 5).
   Nota: Resultados representativos se muestran en la figura 3B.
   1. Para realizar la tinción de h-e, obtenga un kit de la lista de materiales y seguir las especificaciones del fabricante.
   2. Para realizar la coloración de immunohistochemical, obtener un kit y un anticuerpo primario de la lista de materiales y seguir las especificaciones del fabricante.

5. inmunofluorescente tinción de FFPE y organitas seccionado

1. Recoger suministros: diapositiva al horno desde el paso 4, xileno, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, agua desionizada (DI H₂O), coplin jarras, 1 x solución salina de antígeno recuperación solución tampón de citrato de sodio o EDTA-Tris buffer, tampón fosfato (PBS), 5% (de suero de caballo normal NHS) con detergente no iónico 0.1% en PBS, seroalbúmina bovina al 1% (BSA) con detergente no iónico de 0.3% en PBS, parrilla de tinción, tinción de plato, descubrirse cámara, pen barrera hidrofóbica, cámara de humedad, 1 ° y 2 ° anticuerpos de interés y counterstains de interés.
2. Desparafinizar y rehidratar las diapositivas por inmersión en coplins con las siguientes soluciones: xileno (3 inmersiones, 5 minutos cada uno), 100% EtOH (2 inmersiones, 3 minutos cada uno), 95% EtOH (2 inmersiones, 3 minutos cada uno), 70% EtOH (2 inmersiones, 3 minutos cada uno) y DI H₂O (2 inmersiones 3 minutos cada uno).
3. Llenar la cubeta de tinción con solución de recuperación antigénica y la cámara de sondo de precalentamiento a 100 ° C.
4. Realizar recuperación de antígeno por sumergir el portaobjetos en la cubeta de tinción precalentado e incube durante 5 – 10 min a 100 ° C. Una vez finalizado el ciclo, deje que la cámara sondo a reposar 20 minutos antes de abrir la tapa.
5. Una vez se haya enfriado el plato deslizante a RT, coloque la cubeta de tinción bajo corriente DI H₂O para enjuagar el portaobjetos durante 5 minutos.
6. Quite las diapositivas de la cubeta de tinción, dibujar un círculo alrededor de la muestra con una pluma de la barrera hidrofóbica y coloque la corredera en la cámara de humedad.
7. Bloquear cualquier anticuerpo no específicos de tinción aplicando 5% NHS con detergente no iónico 0.1% en PBS al círculo hidrofóbico alrededor de la muestra (aprox. 30 μL es necesario para cubrir la muestra).
8. Lavar los portaobjetos en coplins llenan con PBS 3 veces durante 5 minutos.
9. Agregar los anticuerpos de 1° (Tabla de materiales) diluidos en 1% de BSA con detergente no iónico de 0.3% en PBS al círculo hidrofóbico alrededor de la muestra (aprox. 30 μL debe cubrir la sección), luego incubar durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C en cámara.
10. Lave los portaobjetos en coplins con PBS 3 veces durante 5 minutos.
11. Añadir el anticuerpo 2° diluido en 1% de BSA con detergente no iónico de 0.3% en PBS al círculo hidrofóbico alrededor de la muestra (aprox. 30 μL cubrirá el área), luego incubar durante 1 h a temperatura ambiente en cámara de humedad.
12. Lave los portaobjetos en coplin con PBS 3 veces durante 5 minutos.
13. Añadir DAPI, diluido a las especificaciones del fabricante, en el 1% de BSA con detergente no iónico de 0.3% en PBS al círculo hidrofóbico alrededor de la muestra, luego incubar 2 – 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (30 μL).
14. Lave los portaobjetos en coplins con PBS 3 veces durante 5 minutos.
15. Montar el portaobjetos con cubreobjetos y medios de montaje antifade, y luego visualizar los resultados con un microscopio.

6. montaje de conjunto de organoides para la tinción inmunofluorescente

1. Recoger suministros: diapositiva de cámara o plato confocal, tampón fosfato salino (PBS), fijador, 50 mM NH₄Cl en PBS, detergente no iónico 0.1% en PBS, 5% NHS con detergente no iónico 0.1% en PBS, 1% de BSA con detergente no iónico de 0.3% en PBS, 1 ° y 2 ° anticuerpos de interés y counterstains de interés.
2. Retire con cuidado tanto los medios como sea posible sin afectar la cultura de organoide mediante pipeteo contra el lado del bien, dejando espacio entre los medios de comunicación y de la matriz del gel.
3. Con una recortada, mojado previamente con los medios de comunicación o PBS, punta de la pipeta de 1.000 μL, elaborar una gota (25-50 μL) del gel de la matriz que contiene la organoid(s) de interés y dispensar en el centro de un plato cámara diapositiva bien o confocal.
   Nota: el gel de la matriz de 33% no es un sólido. Es un líquido gelatinoso que maneja similar a una gelatina que no ha establecido plenamente. Una punta de pipeta recortado con una abertura grande evitará organitas romperse durante las transferencias.
4. Organoides permanecen en la cultura de los padres, reemplazar los medios de comunicación con cálido KSFM-medios de comunicación.
5. Con el ojo desnudo o disección alcance, Aspire el gel exceso de los medios de comunicación y de la matriz de la diapositiva de la cámara con una pipeta de punta fina (10-200 μL).
   Nota: Es opcional para pretratar el portaobjetos de la cámara con un reactivo de adherencia.
6. La placa de un volumen igual del gel de la matriz en un pozo vacío de la diapositiva de cámara como control opcional para observar autofluorescence de matriz sobrante.
7. Coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora de 37 ° C durante 30 – 45 min promover el organoide se adhieren al vidrio y prevenir la pérdida de las muestras durante los pasos de lavado.
8. Pipeteo lentamente para evitar desprendimiento de diapositiva, lavar organoides con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos a temperatura ambiente agitando suavemente.
9. Quitar 1 x PBS y fix con 200 μL de paraformaldehído al 4% por 30 min a temperatura ambiente agitando suavemente. Asegúrese de que el gel de matriz aparece claro después de este paso.
   Nota: El metanol o formol fijación son también posibles. Método de fijación debe ser optimizado para anticuerpos específicos como ciertos métodos de fijación pueden reticulación los antígenos de interés o apagan los fluorescentes-etiquetado-proteínas de interés.
10. Retirar el fijador y lavar dos veces con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos, agitando suavemente.
    Nota: La longitud de pasos de lavado debe ser optimizada dependiendo del tamaño del organoide. Cinco minutos es suficiente punto de partida, pero el paso de lavado se puede alargar según sea necesario.
11. Quench autofluorescencia con 200 μL de 50 mM NH₄Cl en PBS 1 x durante 30 min a temperatura ambiente agitando suavemente.
    Nota: Este paso apaga autofluorescence de escombros en el lumen de los organoides y de expresión de la proteína fluorescente (como GFP) que puede presentar desde el diseño experimental. Debe ser incluido si se desea usar un fluoróforo en el canal 488 pero puede omitirse si se desea preservar la señal GFP.
12. Quitar NH₄Cl y lavar dos veces con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos agitando suavemente.
13. Permeabilizar organitas en 200 μL de 0,1% de detergente no iónico-100 en PBS 1 x durante 30 min a temperatura ambiente agitando suavemente.
14. Eliminar el detergente no iónico de 0.1%-100 de 1 x PBS y lavado dos veces con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos agitando suavemente.
15. Bloque con 5% NHS con 200 μL de 0,1% de detergente no iónico X-100 en PBS e incubar durante 60 min a temperatura ambiente agitando suavemente.
16. Retire el amortiguador de bloqueo y lavar dos veces con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos, agitando suavemente.
17. Diluir el anticuerpo de 1° en 1% de BSA con 0.3% Tritón X-100 en PBS 1 x y añadir a 200 μL de la diapositiva de la cámara, luego incubar durante 1 – 3 días a 4 ° C.
18. Quitar el anticuerpo 1° y lavar dos veces con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos agitando suavemente.
19. Diluir el anticuerpo de la 2° en 1% de BSA con 0.3% Tritón X-100 en PBS 1 x y añadir a 200 μL de la diapositiva de la cámara, luego incubar durante 1 – 3 días a 4 ° C en la oscuridad.
    Nota: La duración de los tiempos de incubación debe ser optimizada para tamaño de organoides y el anticuerpo. Algunos requerirán más tiempo para penetrar a través de los organoides. Concentración de anticuerpos también tendrá que ser optimizado. En general, 2 x la concentración utilizada para secciones FFPE es apropiada para los anticuerpos del 1° y la misma concentración para secciones FFPE es apropiada para los anticuerpos del 2°.
20. Quitar el anticuerpo 2° y lavar dos veces con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos agitando suavemente.
21. Contratinción la actina con phalloidin y el núcleo con DAPI o Hoescht, diluido según las recomendaciones del fabricante en 1% de BSA con 0.3% Triton-X en PBS 1 x. Añadir 200 μL a diapositiva de la cámara, luego incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos en la oscuridad.
22. Montar en 200 μL de fresco 1 x PBS o medios de montaje y de la imagen inmediatamente (fluorescencia debe conservarse hasta 5 días, si no más). En la figura 3se muestran resultados representativos.
    Nota: Azida de sodio se puede añadir a las muestras para evitar la contaminación si la proyección de imagen confocal no está fácilmente disponible. Adición de un agente de claro puede mejorar la proyección de imagen.

7. montaje de conjunto de organoides para ensayos y sondas fluorescentes

Nota: Hay disponibles en el mercado ensayos y sondas/tintes fluorescentes (los ejemplos se incluyen en la lista de materiales) modificable para su uso en organoides todo montado para observar una variedad de extremos útiles¹⁹. El protocolo siguiente es para el kit de proliferación de EdU marcado con fluorescencia, sin embargo cualquier kit puede modificarse para su uso con una muestra montada en conjunto.

1. Cuidadosamente Quite 50 μL de los medios de comunicación y reemplácelo con 50 μL de 20 μM 2 x trabajo EdU solución mediante pipeteo contra el lado del bien, dejando espacio entre los medios de comunicación y de la matriz del gel.
2. Incubar a 4 ° C durante 1 – 3 días (la longitud deseada de tiempo para la incorporación de EdU debe ser optimizada para tipo celular de elección).
3. Siga los pasos 6.2-6.8 para transferir los organoides de interés en una diapositiva de cámara o plato confocal.
4. Quite la PBS y con 200 μL de 3,7% paraformaldehído por 30 min a temperatura ambiente agitando suavemente. Asegúrese de que la matriz de gel aparecen claros después de este paso.
5. Retirar el fijador y lavar dos veces con 200 μL de PBS 1 x durante 5 minutos, agitando suavemente. PBS de quitar y añadir 200 μL de 0.5% detergente no iónico-100 en PBS 1 x durante 30 min a temperatura ambiente agitando suavemente.
6. Preparar un 1 x fluorescente reacción cóctel según las especificaciones del fabricante.
7. 0.5% detergente no iónico-100 de quitar y lavar dos veces con 200 μL de BSA 3% en PBS 1 x durante 5 minutos agitando suavemente.
8. Agregar coctel de reacción e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
9. Eliminar la reacción fluorescente cóctel y lavar una vez con 200 μL de BSA 3% en PBS 1 x durante 5 minutos, agitando suavemente. Contratinción y montaje siguiendo los pasos 6.21, 6.22 (figura 3D).

Sobre cultura exitosa de organoides de próstata primario humano, morfología y diferenciación pueden evaluarse mediante análisis de imágenes de campo claro y FFPE y técnicas de tinción montaje en conjunto.

El proceso de captura de imágenes de campo claro se ilustra en la figura 1A. Organoides son cultivados en una matriz 3D y dispersos a través de diferentes planos focales. Para observar organitas en foco a través de muchos aviones, se sugiere utilizar una imagen de la Fed (figura 1B, derecha) en lugar de un solo plano de z (figura 1B, izquierda). En el laboratorio, organitas cultivadas bajo diferentes condiciones experimentales pueden resultar en cambios en la morfología. Usando el área, circularidad (definido por lo parecido del organoide es un círculo) y radio max/min (medida de longitud) indicar a los usuarios de forma y tamaño de organoides y proporcionan una lectura cuantificable de morfología. Para enfatizar la utilidad de estas medidas, imágenes representativas de organoides con área similar pero diferentes morfología se muestran en la figura 1, en el cual un organoide largo será menos circular y tienen una mayor relación de máximos y mínimos que un esférico organoide.

Incrustación de organoides para la histología es un extremo útil para observar el interior de las muestras y asegurar que la necrosis no está presente dentro de la base de un organoide. Disponen de un flujo de trabajo para este proceso y los resultados representativos de las muestras bajo un microscopio de campo brillante sin manchas, seccionadas en la figura 2AB, C. Figura 3A muestra un organoide maltratado (izquierda) comparado con el bien entregado organitas en Figura 3A (derecha) y la figura 3B. Para determinar el estado de diferenciación de la muestra, se recomienda mirar basocelular marcadores (citoqueratina 5 y p63)8 junto con luminal de la célula marcadores (citoqueratina 8)8. Si se desea teñir organitas en situ, tinción de montaje en conjunto es una alternativa conveniente, y estos resultados representativos se proporcionan en la figura 3D.

Figura 1: evaluación de la morfología de organoides en cultura 3D. (A) imagen colección y compresión de flujo de trabajo para humanos organitas próstata primaria adquirida por una luz transmitida invertido microscopio con un motorizado X / Y etapa y compañero software de escaneo. (B) imágenes representativas de una sola z-pila (izquierda) vs. una imagen de la Fed (derecha) de una muestra de bien conjunto de organoides próstata primario humano, mostrando que más organitas están enfocadas al z-pilas múltiples se combinan en una sola imagen proyectada (barra de escala = 1000 μm). (C) imágenes representativas para el área, circularidad y max/min relación de organoides de próstata primario humano morfológicamente disímiles que tienen la misma área (barra de escala = 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: organoide incrustar representante secciones de resultados y flujo de trabajo. (A) organoide de próstata primario humano incrustar el flujo de trabajo. (B) imagen representativa de una diapositiva sin mancha, fresca que contiene organitas próstata primario humano bajo el microscopio de campo brillante con agar (flecha verde), gel de histología (flecha negra), burbuja (flecha azul), organoides (flechas rojas) (barra de escala = 1000 μ m). (C) mancha diapositiva recién cortada (izquierda) vs. diapositiva seca sin manchas (derecha), organoides (flechas rojas) aparecen transparente cuando se seca (barra de escala = 500 μm) y son más difíciles de distinguir bajo el microscopio de campo brillante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: tinción histológica en organoides seccionado y todo montado. (A) H & E tinción de un organoide de próstata primario humano roto por mal uso (uso agresivo, protocolo de procesamiento incorrecto, izquierda) junto a un organoide bien manejado (derecha) (barra de escala = 100 μm). (B) humano organoide de próstata primario que ha sido formalina-fijos, parafina-encajado, seccionadas y teñidas con citoqueratina basal 5 o luminal cytokeratin 8 (arriba) o basal p63 y citoqueratina luminal 8 (abajo) y fotografiada con microscopio confocal ( barra de escala = 100 μm). (C) un organoide próstata primario a largo humano montado en conjunto a teñidos con citoqueratina basal 5 o luminal citoqueratina 8 y contratinción con phalloidin y DAPI, fotografiada con microscopio confocal (barra de escala = 100 μm). (D) un organoide celular próstata primario humano montado todo manchado con fluorescencia etiquetada EdU y contador teñidas con Hoescht, fotografiada con microscopio confocal (barra de escala = 500 μm) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.