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Summary

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Abstract

Contaminación por aflatoxinas en los cultivos de alimentos y piensos es un grave problema en todo el mundo. Las aflatoxinas, producidas por el hongo Aspergillus flavus (a. flavus) son potentes carcinógenos que reducen sustancialmente el valor de la cosecha de maíz y otros cultivos ricos del aceite como maní además de amenaza grave para la salud humana y animal. Diferentes enfoques, incluyendo la cría tradicional, expresión transgénica de proteínas de resistencia asociada y ARN de interferencia (ARNi)-basado en el silenciamiento génico inducido por el anfitrión del crítico a. flavus objetivos gene, están siendo evaluados para aumentar resistencia a aflatoxinas en cultivos susceptibles. Últimos estudios han demostrado un papel importante de α-amilasa en la producción de patogenesia y aflatoxina a. flavus , sugiriendo a este gen enzimático es un blanco potencial para reducir el crecimiento de a. flavus y la producción de aflatoxina. En este sentido, el actual estudio fue emprendido para evaluar expresión heteróloga (bajo control del CaMV 35S promotor constitutivo) de una proteína Lablab purpureus L. como inhibidor de la α-amilasa (IABP) en maíz contra a. flavus. IABP es una proteína de 36 KD, que es un inhibidor competitivo de la enzima α-amilasa de a. flavus y pertenece a la familia de proteínas lectin-arcelin-α-amilasa inhibidor en común haba. Estudios in vitro antes de los trabajos actuales han demostrado el papel de la IABP en la inhibición de la actividad de la α-amilasa de a. flavus y crecimiento del hongo. Crecimiento fúngico y la producción de aflatoxina en granos maduros fueron monitoreados en tiempo real utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus . Este núcleo investigación ensayo (KSA) es muy fácil de configurar y proporciona datos fiables y reproducibles en la infección y el grado de extensión que podría cuantificarse para evaluación de germoplasma y de líneas transgénicas. La fluorescencia de la cepa de la GFP es crecimiento estrechamente correlacionada a hongos y, por extensión, está bien correlacionada con valores de aflatoxina.  El objetivo del presente trabajo fue implementar este conocimiento previo en un cultivo comercialmente importante como el maíz para aumentar la resistencia de la aflatoxina. Nuestros resultados muestran una reducción del 35% – 72% en a. flavus crecimiento expresando AILP transgénicos granos de maíz que, a su vez, traducido en una reducción de 62% a 88% en los niveles de aflatoxina.

Introduction

Contaminación por micotoxinas de los géneros de hongos, Alternaria , Aspergillus, Penicilliumy Fusariumes un problema importante de los alimentos y cultivos en todo el mundo^1,2,3. Entre estos hongos fitopatógenos, Aspergillus tiene el mayor impacto adverso en el valor de cultivos y salud humana y animal. Aspergillus flavus (A. flavus) es un patógeno oportunista de la planta que infecta cultivos ricos aceite tales como semilla de algodón, maíz y maní y produce el potente carcinógeno, aflatoxinas, así como numerosos metabolitos secundarios tóxicos (SMs). Maíz es un alimento importante y alimenta de cultivo en todo el mundo y es altamente susceptible a la contaminación por a. flavus. El impacto económico de la contaminación por aflatoxinas en pierde y valor reducido en el maíz puede ser tanto como $ 686,6 millones/año en los Estados Unidos² con los cambios previstos en el clima global, el impacto de las aflatoxinas podría resultar en mayores pérdidas económicas en maíz con estimaciones tan altas como $ 1,68 billones/año en el futuro cercano². Teniendo en cuenta los efectos adversos de la económicos y la salud de las aflatoxinas en los seres humanos y ganado, control de aflatoxinas antes de la cosecha de maíz podría ser la manera más eficiente para prevenir la contaminación por aflatoxinas en los alimentos y productos comestibles.

El enfoque de control previo a la cosecha principal de resistencia de aflatoxina en el maíz que se ha utilizado ampliamente en las últimas décadas es principalmente a través de la crianza, que requiere una cantidad significativa de tiempo⁴. Recientemente, el control biológico ha tenido cierto éxito en la reducción de aflatoxina en gran escala campo aplicaciones^5,6. Además de biocontrol, aplicación de vanguardia herramientas moleculares como ‘Host inducida por el silenciamiento del gen”(HIGS) a través de RNAi y expresión transgénica de proteínas asociadas a resistencia ha tenido cierto éxito en la reducción del crecimiento de a. flavus y aflatoxina producción en estudios de laboratorio y de campo a pequeña escala. Estos enfoques están siendo optimizados actualmente además de identificar nuevos blancos potenciales del gene de a. flavus para la futura manipulación.

Además de genes que están directamente involucrados en la producción de micotoxinas como potenciales blancos de estrategias para el control transgénicos, amilasas fúngicas han demostrado jugar un papel crítico en mantener la producción exitosa de la patogenesia y micotoxinas durante las primeras etapas de la infección de la planta del anfitrión. Algunos ejemplos incluyen Pythium pleroticum (agente causal de la pudrición del rizoma de jengibre), Fusarium solani (agente causal de la marchitez de la coliflor), donde una correlación positiva entre la actividad y expresión de la patogenicidad y la α-amilasa se observaron ^7,8. Inhibición de la actividad de la α-amilasa por golpe de gracia del gene o enfoques precipitación afecta negativamente el crecimiento fungicida, producción de toxina. Un mutante de octavos de final de la α-amilasa de a. flavus fue incapaz de producir aflatoxinas cuando se cultiva en almidón sustrato o degermed granos de maíz⁹. Del mismo modo, en Fusarium verticillioides una cepa de octavos de final de la α-amilasa no fumonisina B₁ (micotoxinas) durante la infección de granos de maíz¹⁰. En un estudio más reciente, Gilbert et al., (2018) demostró que una basada en RNAi derribar de la expresión de α-amilasa de a. flavus a través de HIGS redujo significativamente el crecimiento y aflatoxina producción de a. flavus durante la infección del maíz núcleo¹¹ .

Inhibidores específicos de la actividad de la α-amilasa también han producido resultados similares, obtenidos de la abajo-regulación de la expresión de α-amilasa. El primer informe sobre el papel de un inhibidor de la α-amilasa en resistencia fungicida vino desde el aislamiento y la caracterización de un inhibidor de la tripsina-α-amilasa de 14 kDa de líneas de maíz resistentes a . flavus¹². Mayor proyección de varios centenares de especies de plantas por Fakhoury y Woloshuk conducido a la identificación de una proteína de tipo inhibidor de la α-amilasa 36 kDa (IABP) de las semillas de frijol Jacinto, Lablab purpureus L.¹³. La secuencia del péptido de lectinas de IABP se asemejó a perteneciente a la familia de lectinas – arcelin-α-amilasa inhibidor en común registrados haba^14,15. IABP purificada no exhibe ninguna actividad inhibidora de tripsina mamífero y mayor caracterización in vitro demostrada una inhibición significativa del crecimiento de a. flavus y la germinación de conidios¹³. Los informes presentados aquí claramente muestra la α-amilasa puede servir como un destino en los enfoques de control para restringir patógenos o plagas que dependen de la movilización de la almidón (a través de la actividad de la α-amilasa) y adquisición de azúcares solubles como fuente de energía durante su interacción patógena con plantas hospederas.

Alpha-amilasa es conocida por ser crítico en a. flavus patogenicidad^9,10,11y dada la importancia de la AILP como un potente anti-a. flavus agente (inhibición de la α-amilasa/antigrowth)¹³, hemos generado plantas de maíz transgénicas expresando Lablab AILP gene bajo el promotor CaMV 35S constitutivo. El objetivo era investigar si la expresión heteróloga de este inhibidor de la α-amilasa en maíz es eficaz contra a. flavus producción patogenia y aflatoxinas durante la infección del núcleo de maíz. Nuestros resultados demuestran que granos de maíz transgénicos expresando AILP significativamente reducción a. flavus crecimiento y aflatoxina la producción durante la infección del núcleo.

Protocol

1. construcciones plásmidos y transformación de maíz PCR amplificación Lablab AILP insertar usando los cebadores 5′-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 ‘y 5′-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3’. Las condiciones PCR incluyen un paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s (paso 1), seguido de la desnaturalización a 98 ° C durante 10 s (paso 2), recocido a 55 ° C para 30 s (paso 3), elongación a 72 ° C por 20 s (paso 4), 31 ciclos del paso 2 al paso 4 , y una elongación final a 72 ° C por 5 min clon el producto PCR en un modificado pCAMBIA 1.300 vector con XbaI y PstI sitios de restricción. Secuencia el vector del destino final de la planta para confirmar la orientación y la secuencia del gen clonado de IABP en el vector. Como anteriormente descrito 16transformar la Agrobacterium cepa EHA101 con la construcción final del vector (figura 1). Uso transformado Agrobacterium que contiene el vector de destino final de la planta a transformar embriones inmaduros de maíz (Zea mays L. Hi-II) (realizados en la instalación de planta de transformación de la Iowa State University) 16. T0 plantas en el invernadero (26 – 29 ° C, fotoperíodo de 16/8 h con Na-lámparas de alta presión) y autofecundarse repetidamente para obtener T6 generación para lograr la calidad de homozigoto para el rasgo transgénico. 2. ensayo de germinación de esporas de Las muestras de hojas de la cosecha y almacenar a-80 ° C. Moler las muestras de hojas con un mortero y una maja con nitrógeno líquido. Pesar 0.5 g en tubos de microcentrífuga de 2 mL, Añadir 17 μl de inhibidor de la proteasa y coloque los tubos en hielo. Centrifugar los tubos durante 10 min a 16.000 x g. Transferencia de 225 μL de extracto de la planta a tubos de microcentrífuga de 0, 5 mL y coloque en hielo. En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una suspensión 5 mL de esporas de Aspergillus flavus 70-GFP en caldo de dextrosa de papa de 1% (p/v). Vórtice y ajustar la concentración de esporas a 10 esporas/mL,5 con un hemocitómetro.PRECAUCIÓN: A. flavus produce aflatoxinas, todo el trabajo con este hongo debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad biológica. Incubar en PDB a 28 ° C hasta que la cultura logra 50% inicio de la germinación de las esporas según lo indicado por abultamiento de las esporas. Vórtice y alícuota 25 μl solución, espora a la planta 225 μL del extracto. Incubar las muestras durante 20 horas a 28 ° C con agitación intermitente. Alícuota de 25 μl de solución de esporas en un portaobjetos de microscopio y mida la longitud del germen tubos esporas mediante el software de la cámara digital. Utilizar un mínimo de 20 mediciones replicadas de cada línea.Nota: En esta etapa, coloque todas las culturas a 4 ° C para detener el crecimiento de la colonia hasta que esté listo para contar. 3. núcleo investigación ensayo (KSA) Construir tapas de KSA pegando 4 snap caps (22 mm) en caja Petri 60 x 15 mm. Permitir el pegamento se seque durante 48 H antes de usar gorras. Cada tapa KSA constituye un representante (figura 2). En un estéril gabinete de seguridad biológica, rocíe una bandeja cuadrada bioensayo (24 cm x 24 cm) con 70% etanol: H2O (v/v) y deje secar al aire. Añadir papel de cromatografía estéril a la bandeja. Aerosol 9 casquillos KSA con etanol al 70%, deje que el aire seque y coloque en la bandeja del bioensayo. Para cada línea de maíz transgénico está probando, seleccione 20 núcleos indemnes y colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL. Añadir etanol al 70% y dejar reposar durante 4 minutos. Agitar suavemente los tubos durante la esterilización. Retirar los granos etanol y enjuague tres veces en estéril desionizada H2O. Preparar una suspensión de esporas de Aspergillus flavus 70-GFP17 de una cultura de 6 días de edad cultivadas en medio V8 (5% jugo V8 agar al 2%, pH 5.2). Añadir 20 mL estéril 0.02% Triton X-100/desionizada H2O (v/v) y desechos de las esporas con un asa estéril. Pipeta el inóculo y el lugar en un vaso de precipitados estéril 300 mL. Preparar una dilución de 5-fold con 0,02% Tritón X-100, luego realizar un conteo de esporas con un hemocitómetro. Diluir más si es necesario para obtener 100 mL con una concentración de 4 x 106 esporas/mL. Colocar los granos en un vaso de precipitados estéril 300 mL con una barra de agitación. Añadir el inóculo en el vaso.Atención: Agregar granos a inóculo se causa solución a splash. Coloque el vaso en un plato mezclar durante 3 minutos. Después de 3 minutos, vierta de inóculo en un vaso de precipitación vacío. Usando un fórceps, coloque los granos en el plato de prueba (1/tapadera). Añadir 30 mL agua a la parte inferior de cada bandeja de prueba e incubar a 31 ° C en la oscuridad durante 7 días. Preparar los granos para la fotografía. Dejar reposar 4 núcleos de cada línea para análisis microscópico y la fotografía.Nota: Los granos pueden almacenarse a 4 ° C durante no más de 5 días antes de completar la fotografía. Tomar fotografías de granos después de siete días de la inoculación con a. flavus (figura 3). Limpieza exterior de granos con un tejido blando y agua desionizada. Realizar secciones longitudinales de núcleos y fotografiar inmediatamente bajo el microscopio de fluorescencia. Preparación de núcleos para análisis. Limpieza exterior de núcleos restantes con un tejido blando y agua desionizada. Colocar 4 núcleos, constituyendo 1 rep, en un policarbonato de tapón de rosca 15 mL vial que contiene 2 bolas de acero inoxidable. Congelar inmediatamente los frascos en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C hasta el posterior procesamiento y análisis. Saque los frascos del congelador de-80 ° C y moler los granos en un homogeneizador a 1.500 rpm durante 3 minutos.Nota: Mantenga los núcleos congelados con nitrógeno líquido. 4. proyección PCR de granos de maíz transgénicos Utilice el kit de aislamiento de DNA para aislar ADN genómico (gDNA) de granos de maíz pulverizados infectados por a. flavus según las instrucciones del fabricante. Añadir brevemente, 280 μl de tampón de F 20 proteasa μl y 3 μl dithiothreitol (DTT) a 10-15 mg de granos de maíz pulverizados. Incubar y agitar en un Termomezcladores (56 ° C, 1.200 rpm, 30 min). Centrifugar a 10.000 x g durante 1 min y transferir el sobrenadante a la columna equilibrado. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos y centrifugar a 700 x g durante 1 min eluir gDNA. Tomar 0,8 μl de gDNA extraído para configurar un 20 μl PCR la reacción para cada muestra usando un kit PCR. Siga las condiciones de termociclaje rápido como se recomienda en el protocolo del fabricante. Las condiciones PCR incluyen un paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 5 min (paso 1) seguido de la desnaturalización a 98 ° C durante 5 s (paso 2), recocido a 55 ° C durante 5 s (paso 3), elongación a 72 ° C por 20 s (paso 4), 40 ciclos de paso 2 al paso 4 y a un paso de elongación final a 72 ° C durante 1 minuto (paso 5). Use primer forward 5′-TATACCACCCCCATCCGTGT-3′ y primer 5′-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3′ para confirmar la presencia de Lablab AILP gene en los granos de maíz transgénicos. 5. aislamiento RNA, síntesis de cDNA y RT-PCR semicuantitativa Tomar homogeneizada a. flavus infectados los granos de maíz previamente almacenados a-80 ° C para la extracción de RNA. Extracto de RNA utilizando un kit de aislamiento de RNA total según protocolo del fabricante pero con ligera modificación18. Después de agregar 50 mg de polvo del núcleo de maíz homogeneizada en el buffer de extracción, mezcla bien (sin Vortex) usando una punta de la pipeta de 1 mL y dejarla en hielo durante 5-6 minutos antes de proceder a realizar los siguientes pasos como se describe en el protocolo del fabricante. Preparar el cDNA usando un cDNA síntesis kit según protocolo 18 el fabricante. Utilizar 0,5 μl de cDNA sin diluir por reacción de polimerización en cadena para RT-PCR semicuantitativa como anteriormente descrito18. Usar primers de avance y retroceso qAILP-F 5′-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3′ y qAILP-R 5′ – CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA – 3′ respectivamente para detectar genes de IABP Lablab y adelante y atrás iniciadores qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ y qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ respectivamente para la expresión del gen de estructural ribosomal maíz (costilla), GRMZM2G02483819 como un gen de mantenimiento de la casa. 6. cuantificación de GFP Preparar 50 mL de cada una de 0.2 M de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) y 0.2 M fosfato sódico dibásico (Na2HPO4·7H2O) desionizada H2O. Hacer 100 mL de tampón de fosfato de pH 7.0 Sorenson. Para pH 7.0, agregue 19,5 mL NaH2PO4 acción, 30,5 mL NaHPO4·7H2O existencia y 50 mL desionizada H2O. Pesar 25 mg de núcleo triturado (peso fresco, FW) y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,0 mL. Añadir 500 μl de tampón de fosfato al tubo de centrífuga y vortex durante 30 s. Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 16.000 x g. Sobrenadante en una placa bien negro 96 en Pipetee 100 μl. Leer las muestras con un fluorómetro (excitación 485 nm, emisión 528 nm). 7 análisis de aflatoxina total Extracción procesamiento y aflatoxina muestra Muestras de núcleo seco en un horno de aire forzado durante 2 días a 60 ° C. Pesar las muestras y colocar en un matraz de Erlenmeyer con un tapón de vidrio de 50 mL. En una campana de humos, añadir cloruro de metileno 25 mL en cada matraz.PRECAUCIÓN: Cloruro de metileno es muy volátil y se considera peligroso (irritante, cancerígeno). Guantes de látex ni de nitrilo son seguras para trabajar con cloruro de metileno. Utilice guantes de alcohol polivinílico resistentes solventes orgánicos mejorado. Agitar las muestras durante 30 minutos en un agitador de acción de la muñeca. Después de 30 min, verter lentamente el extracto a través de un círculo de papel de filtro estriado en un vaso de precipitado de 80 mL. Dejó la vasos seque durante la noche en una campana de humos. Al día siguiente, squirt cloruro de metileno (aproximadamente 5 mL) en el interior del borde de los vasos secos, Remolino alrededor y verter en frascos de vidrio de 2 dram. Dejar los frascos abrirán para que se seque durante la noche en una campana de humos. Análisis de aflatoxinas Añadir 4,0 mL 80% metanol: desionizada H2O (v/v) viales. Uso un kit de extracción de aflatoxinas para purificar solución de metanol con la columna proporcionada. Analizar los niveles de aflatoxina total con un fluorómetro, según las instrucciones del fabricante.

Representative Results

Transformación de maíz y detección molecular de las plantas transgénicas Embriones inmaduros de maíz líneas Hi-II fueron transformados usando la cepa EHA101 de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de destino final planta expresando el Lablab purpureus AILP gen bajo el control del CaMV 35S promotor. Cinco líneas de maíz transformadas independientemente fuero…

Discussion

Pérdidas de rendimiento en cultivos agrícolas debido a patógenos y plagas es un problema global de²⁰. Actualmente, la aplicación de plaguicidas y fungicidas sintéticos es el medio predominante para controlar patógenos y plagas, pero toxicidad residual de estos productos bioquímicos en los alimentos y los piensos puede representar grave amenaza para la salud humana y animal²¹. Teniendo en cuenta la importancia económica del maíz como alimento y cultivo de alimento, …

Materials

Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge	Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Force Air Oven	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Innova 44 Incubator Shaker	Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants	Nexttec	47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera	Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera	Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes	ThermoFisher Scientific	240835
Phire Plant Direct PCR Kit	ThermoFisher Scientific	F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer	Biotek
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 juice	Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3	Fisher Scientific	09-820P
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific