Syftet med denna metod är att identifiera cancerceller (CSC) i cancer cellinjer och primära mänskliga tumör prover med sfärbildande protokollet, på ett robust sätt, med hjälp av funktionella analyser och fenotypiska karakterisering med flöde cytometri och västra Blot.
Cancerceller (CSC) är en liten population med självförnyelse och plasticitet som är ansvariga för tumorigenesis, resistens mot behandling och återkommande sjukdom. Denna population kan identifieras med ytmarkörer, enzymatisk aktivitet och en funktionell profil. Dessa metoder i sig är begränsade, på grund av fenotypisk heterogenitet och CSC plasticitet. Här uppdaterar vi sfärbildande protokollet för att få CSC sfärer från bröst- och gynekologiska cancerformer, bedömer funktionella egenskaper, CSC-markörer och proteinuttryck. Sfärerna erhålls med encellig sådd vid låg täthet i suspensionskulturen, med hjälp av ett halvfast metylcellulosamedium för att undvika migration och aggregat. Detta lönsamma protokoll kan användas i cancer cellinjer men också i primära tumörer. Den tredimensionella icke-anhängare suspension kultur trodde att efterlikna tumör mikromiljö, särskilt CSC-nisch, kompletteras med epidermal tillväxtfaktor och grundläggande fibroblast tillväxtfaktor för att säkerställa CSC signalering. Som syftar till en robust identifiering av CSC föreslår vi ett kompletterande tillvägagångssätt som kombinerar funktionell och fenotypisk utvärdering. Sfärformande kapacitet, självförnyelse och sfärprojektionsområde etablerar CSC funktionella egenskaper. Dessutom består karakterisering en flödescytometri utvärdering av markörer, representerad av CD44+/CD24– och CD133, och västra blot, med tanke på ALDH. Det presenterade protokollet var också optimerat för primära tumörprover, efter ett prov matsmältningsförfarande, användbart för translationell forskning.
Cancerceller är heterogena, med celler som presenterar olika morfosologier, spridning och invasion kapacitet, på grund av differentiella genuttryck. Bland dessa celler finns en minoritetspopulation som heter cancerceller (CSC)1, som har kapacitet för självförnyelse, rekapitulation heterogenitet en primär tumör nisch och producerar avvikande differentierande förfäder som inte svarar tillräckligt på homeostatiska kontroller2. CSC egenskaper kan översättas direkt i klinisk praxis, med tanke på sambandet med händelser, såsom tumorigenicity eller resistens mot kemoterapi3. Identifiering av CSC kan leda till utveckling av riktade terapier som kan omfatta blockering av ytmarkörer, främjande av CSC-differentiering, blockering av CSC-signaleringsvägkomponenter, nischförstörelse och epigenetiska mekanismer4.
Isoleringen av CSC har utförts i celler linjer och i prover av primära tumörer5,6,7,8. Den funktionella profil som beskrivs för CSC inkluderar clonogen kapacitet, sida befolkning och tumorosphere bildning9. CD44hög/ CD24låg fenotyp har konsekvent förknippats med bröst CSC, som har visat sig vara tumorigenic in vivo och har redan förknippats med epitel till mesenchymal övergång5,10. Hög ALDH aktivitet har också associerats med stemness och epitel till mesenchymal övergång (EMT) i flera typer av fasta tumörer11. ALDH uttryck har associerats med resistens mot kemoterapi och CSC fenotyp in vitro12,13,14,15,16. Flera andra markörer har kopplats till CSC egenskaper i olika typer av tumörer, såsom CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 och andra, som beskrivs i tabell 1.
Tumorspheresna består av en tredimensionell modellerar för studien och utvidgningen av CSC. I denna modell odlas cellsuspensionerna från cellinjer och från blod- eller tumörprover i ett medium kompletterat med tillväxtfaktorer, nämligen epidermala tillväxtfaktor (EGF) och grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), utan fetalt bovinserum och i icke-anhängarevillkor 17. Hämning av cellviddhesion resulterar i död av anoikis av differentierade celler18. Sfärer kommer från klonaltillväxt av en isolerad cell. För detta ändamål distribueras cellerna med låg densitet för att undvika cellfusion och aggregering19. En annan strategi omfattar användning av halvsolid metylcellulosa20.
Det sfärbildande protokollet blev populärt i CSC-isolering och expansion, på grund av tid och kostnad och tekniska, lönsamma och reproducerbara skäl21,22. Trots vissa reserver om vars omfattning sfärbildning återspeglar CSC, finns det en benägenhet stamceller att växa i icke-anhängare villkor med den karakteristiska fenotyp, som liknar den inhemska mikromiljön21. Ingen av de metoder som finns för isolering av CSC från fasta tumörer har fullständig effektivitet, belyser vikten av att utveckla mer specifika markörer eller kombinationer av metoder och markörer.
I detta protokoll beskriver vi isoleringen av CSC med sfärbildande protokollet, med principen om encellig tillväxt under icke-anhängare förhållanden och förmåga att producera en differentierad fenotyp. En schematisk representation av detta förfarande representeras i figur 1. Vi beskriver också karakterisering med ytmarkörer och ALDH uttryck för CSC, både för bröst och gynekologiska tumörceller linjer och prover av primära tumörer.
Detta protokoll detaljer en metod för att få tumorspheres från cancer cellinjer och primära mänskliga prover. Tumorspheres berikas i en sub-population med stamceller-liknande egenskaper36. Denna berikning i CSC är beroende av lönsamhet i en förankringsfri miljö medan differentierade celler är beroende av vidhäftning till ett substrat37. Som primär plätering av tumörceller i en låg följsamhet miljö som inför suspension säkerställer inte anrikning i CSC i …
The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansierades av det portugisiska gynekologisällskapet genom forskningspriset 2016 och cimago. Cnc. IBILI stöds genom Stiftelsen för vetenskap och teknik, Portugal (UID/NEU/04539/2013), och samfinansieras av FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). Coimbra Hospital och Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, godkänd av CHUC: s etikkommitté för hälsa och av den portugisiska nationella dataskyddskommissionen, var källan till livmodercancer prover av patienter som följdes vid institutionens gynekologi service. Figur 1 producerades med Servier Medical Art, tillgänglig från www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |