Este protocolo describe un enfoque eficaz de hibridación in situ para detectar los niveles de expresión de ARNm y los patrones espaciales de los genes diana en el líquido celómico Sipunculus nudus.
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Artículo de método
Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid
En este artículo
Resumen
Resumen
La hibridación in situ (ISH) es una técnica muy informativa para presentar patrones de distribución celular de genes específicos (por ejemplo, ARNm y NCRNA) en los tejidos. El gusano sipunculid Sipunculus nudus es un recurso pesquero crucial, ya que tiene altos valores nutricionales y medicinales. Actualmente, la investigación sobre la biología molecular de Sipunculus nudus todavía está en su infancia. El propósito de este artículo es desarrollar un método sensible para localizar un ARNm específico en sipunculus nudus líquido celómico. El protocolo incluye pasos detallados de la ISH, incluyendo la preparación de ribosondas con nombre digoxigenina y de sentido, la recolección de fluidos celómicos y la preparación de secciones, la hibridación ribosondas específicas, la incubación de anticuerpos, la coloración y los tratamientos posteriores a la coloración. Se muestran los resultados representativos obtenidos de un experimento exitoso con este método. El protocolo también debe ser aplicable a otras especies de Sipuncula.
Introducción
Ish, utilizando una sonda de ácido nucleico etiquetada para detectar la secuencia específica de ADN o ARN de interés, es un método útil para describir el patrón de expresión espacial de genes diana en tejidos morfológicamente preservados1,2,3. Normalmente, la secuencia diana es generada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y luego se utiliza como plantilla para sintetizar la sonda de ARN antisentido/sentido etiquetada con digoxigenina uridina-5'-trifosfato. Las muestras se fijan y permeabilizan antes de la incubación con ribosondas. Después de lavar el exceso de son....
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Protocolo
El procedimiento animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Bienestar Animal de la Universidad de Huaqiao.
1. Preparación de ribosondas
- Diseño de imprimación
- Abra el programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copie la secuencia dmrt1 (GenBank: MK182259) en la ventana de secuencia.
- Ajuste la longitud de imprimación (23-25 bp), la temperatura de fusión (55-60 oC) y el contenido de G/C (40-60%). Haga clic en Seleccionar imprimaciones.
NOTA: El tamaño mínimo requerido para la sonda de ARN es de aproximadamente 500 bp. Las sondas más largas normalmente tienen may....
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Resultados
En la Figura 1se ilustra un resumen de los pasos implicados en la ISH. Las ribosondas de sentido antisentido y correspondientes para dmrt1 se sintetizaron a partir de productos PCR amplificados a partir de los cDNA de fluido celómico. La autenticidad de los productos de ITP se verificó mediante la secuenciación directa. Las ribosondas se sintetizaron utilizando polimerasas de ARN T7 de acuerdo con los protocolos del fabricante y un informe anterior4 con algun.......
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Discusión
Estudios anteriores mostraron que la ISH es adecuada para detectar múltiples ARN objetivo16,17,18. En este protocolo, describimos un método ISH de alta resolución para detectar el ARNm en fluido celómico y enfatizar las condiciones de hibridación optimizadas en Sipunculus nudus. Las señales obvias de dmrt1 que observamos demostraron la aplicación exitosa de este protocolo en la detección de la expresión génica<.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Beca No. 31801034), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (2016J01161), los Fondos de Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao (15BS306) y el Fondo Innovador de Posgrados en Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenina-AP Fragmentos Fab Roche | 11093274910 | ||
| BCIP/NBT Kit de desarrollo de color de fosfatasa alcalina | Beyotime | C3206 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | B2064 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5415R | |
| Ácido | cítricoSinopharm Reactivo Químico Co. | 5949-29-1 | |
| Ácido cítrico trisódico | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Cubreobjetos | Beyotime | FCGF60 | |
| Formamida desionizada | Amresco | 07/12/1975 | |
| Pirocarbonato de dietilo, DEPC | Sigma | D5758 | Sustancia nociva |
| Digoxigenina (DIG) Mezcla de etiquetado de ARN | Roche | 11277073910 | |
| DNasa I, Invitrogen libre de ARNasa | 18047019 | ||
| EDTA | Sigma 431788 | ||
| Imágenes de gel de electroforesis | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Kits de extracción de gel | Omega | D2500 | |
| Aparato de electroforesis | de gel Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glicina | Sigma | G5417 | |
| Heparina | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Reactivo Químico Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Reactivo Químico Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Ácido maleico | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Metanol | Sinopharm Reactivo Químico Co. | 67-56-1 | Sustancia nociva |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Reactivo Químico Co. | 1310-73-2 | Película de parafina corrosiva |
| Bemis Company, Inc. | PM-996 | ||
| Paraformaldehído, PFA | Sigma | 158127 | Sustancia nociva |
| PCR Instrument Life | Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipeta | Eppendorf | plus G | |
| Portaobjetos de microscopio tratados con poli-D-lisina | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinasa K | Sigma | ||
| Agua sin RNasa | HyClone | SH30538. 02 | |
| Inhibidor de RNasa | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Suero de oveja | Beyotime | C0265 | |
| Tarro de tinción de portaobjetos | Beyotime | FG010 | |
| Caja de almacenamiento de portaobjetos | Beyotime | FBX011 | |
| Tijeras pequeñas esterilizadas en autoclave | Espectrofotómetros Shuanglu | sku_8330 | |
| Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | ||
| T7 ARN polimerasas | Roche | 10881767001 | |
| Taq Mezcla de ADN polimerasa (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| ARNt | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Baño de agua | Zhengzhou Gran Muralla Científica Industrial | HH-S2 |
Referencias
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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Reimpresiones y permisos
