Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana

Las infecciones corneales son causas importantes de ceguera y se producen en proporciones epidémicas en los países de ingresos bajos y medianos. La etiología de la enfermedad varía de una región a otra, pero las bacterias representan la gran mayoría de estos casos. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno importante que causa una enfermedad rápidamente progresiva. En muchos casos, los pacientes se quedan con cicatrices estromales, astigmatismo irregular, requieren trasplante o en el peor de los casos, pierden un ojo^1,2.

La queratitis bacteriana causada por P. aeruginosa es una infección ocular difícil de tratar particularmente debido a la creciente aparición de cepas resistentes a los antimicrobianos de P. aeruginosa. En la última década, se ha hecho evidente que las pruebas y el desarrollo de nuevos tratamientos para las infecciones corneales, en general, y los causados por Pseudomonas sp., en particular, son esenciales para combatir la tendencia actual en la resistencia a los antibióticos^3.

Para la prueba de la eficacia de nuevos tratamientos para infecciones corneales, los métodos microbiológicos in vitro convencionales son un sustituto pobre debido a la diferencia en la fisiología bacteriana durante el cultivo de laboratorio y durante las infecciones in vivo, así como debido a la falta de la interfaz huésped^4,5. Los modelos animales in vivo, sin embargo, son caros, que consumen mucho tiempo, sólo pueden ofrecer un pequeño número de réplicas y plantear preocupaciones sobre el bienestar animal.

En este artículo, demostramos un modelo de queratitis orgánica ex vivo organotípica simple y reproducible que se puede utilizar para probar varios tratamientos para infecciones agudas y crónicas. Hemos utilizado P. aeruginosa para este experimento, pero el modelo también funciona bien con otras bacterias, y organismos como hongos y levaduras que causan queratitis.

Los conejos de laboratorio albino fueron sacrificados en el laboratorio para otros trabajos experimentales planificados bajo protocolos aprobados por el ministerio del interior. Los ojos no eran necesarios para su uso experimental en esos estudios, por lo que se utilizaron para este protocolo.

1. Esterilización

1. PASO CRÍTICO: Desinfectar todas las fórceps y tijeras remojando durante 1 h en 5% (v/v) solución de Distel en agua destilada, limpiar con un cepillo, enjuagar con agua del grifo y esterilizar en un horno a 185 °C durante un mínimo de 2 h.
2. Esterilizar todos los demás cristalerías y reactivos mediante autoclaving a 121 °C durante 15 minutos o preparar reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lleve a cabo los siguientes procedimientos en un gabinete de seguridad microbiológica de clase II.

2. Colección de muestras

1. Colección de ojos porcinos
   1. Grandes cerdas blancas de landrace, se utilizó una cruz con un jabalí de Hampshire. Los animales quedaron aturdidos con una corriente eléctrica y los ojos fueron enucleados 2 h más tarde en el matadero.
   2. PASO CRÍTICO: Una vez enucleado, transfiera los ojos al laboratorio en una solución estéril de solución salina tamponada de fosfato (PBS) para evitar que se sequen y los procese inmediatamente a su llegada.
2. Colección de ojos de conejo
   1. Excitar las córneas y enviar al laboratorio en PBS estéril.

3. Preparación del botón corneoscleral

1. Utilice fórceps estériles para sostener el tejido que rodea el globo ocular y transferirlo a una placa de Petri. Retire la conjuntiva y el tejido muscular alrededor del globo ocular en una placa de Petri usando la hoja del bisturí nº 15 y los fórceps.
2. Levante suavemente el globo ocular mientras sostiene el nervio óptico con fórceps y transfiéralo a un frasco de 0,5 L lleno de PBS estéril.
3. Una vez que todos los ojos estén despejados del tejido circundante, muévalo usando fórceps estériles a otro frasco de 0,5 L lleno de yodo povidone del 3% (v/v) en PBS y déjelo durante 1 minuto.
4. Transfiera globos oculares a otro frasco de 0,5 L con PBS estéril.
5. Utilice fórceps para mantener el ojo quieto en una placa de Petri y hacer un corte cerca de la córnea con una hoja de bisturí no 10A.
6. PASO CRÍTICO: Sostenga el borde del corte y use tijeras para excitar la córnea dejando unos 3 mm de esclerótica que rodea la córnea. Asegúrese de que el extremo afilado de las tijeras no perfore el iris o el tejido coroideo y esté en el espacio supra-coroidal.
7. Sujete el botón corneoscleral con fórceps y use otro par de fórceps extremos puntiagudos para separar suavemente el tejido uveal.
8. Levante el botón corneoscleral del globo restante y enjuáguelo brevemente en solución de yodo povidone del 1,5% (v/v) en PBS en una placa de 12 pozos.
9. Coloque el botón corneoscleral en otras 12 placas de pozo llenas de PBS estériles.
10. Después de procesar todos los ojos(máximo recomendado 40 ojos en un lote),coloque cada botón corneoscleral en una placa petri individual (34 mm de diámetro) lado epitelial hacia arriba y vierta en 3 ml de cultivo medio pre-calentado a 37 °C.
    NOTA: La composición del medio de cultivo es la siguiente: El medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco: Jamón [1:1] complementado con 5 μg∙mL^-1 insulina y 10 ng∙mL^-1 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 1 0% (v/v) suero de becerro fetal (FCS), 100 U∙mL^-1 penicilina, 100 U∙mL^-1 estreptomicina y 2,5 μg∙mL^-1 anfotericina B. Como paso opcional, el medio se puede complementar con 50 g∙L^-1 dextrano para evitar la hinchazón de la córnea excada durante los pasos de incubación adicionales.
11. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados.

4. Mantenimiento de los botones corneosclerales

1. Después de 24 horas, utilice la técnica aséptica para eliminar los medios y reemplazar con 3 ml de medios frescos de cultivo pre-calentado que contengan antibióticos. Mantenga los botones corneosclerales en los medios con antibióticos durante 48 h para desinfectar las córneas. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados.
2. PASO CRÍTICO: Después de 48 horas, retire los medios y enjuague las córneas con 2 ml de PBS. A continuación, mantenga los botones corneosclerales en medios libres de antibióticos durante un mínimo de dos o idealmente tres días antes de la infección experimental, para eliminar los antibióticos residuales del tejido.
3. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados. Cambie los medios al menos una vez más en estos tres días. Deseche las córneas si se desarrolla alguna turbidez en el medio libre de antibióticos.

5. Preparación de un inoculum

1. Vierta 10 ml de caldo LB en un matraz cónico de 50 ml con un tapón de espuma.
2. Transfiera una colonia de la cepa PAO1 de P. aeruginosa o cola PA14 desde una placa de agar fresca e incuba a 37 °C durante 3-4 h hasta que las bacterias estén en fase de registro medio.
3. Transfiera el cultivo de bacterias a un tubo y centrífuga de 50 ml a 3.000 x g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en PBS.
4. Repita el paso 5.3 dos veces más para lavar las células. Vuelva a suspender el pellet de celda en PBS y ajuste la densidad óptica a 600 nm a aproximadamente 0,6 usando PBS estéril como espacio en blanco.

6. Infectar el botón corneoscleral

1. Retire los medios de la placa De Petri y enjuague las córneas dos veces con 1 ml de PBS estéril.
2. Apriete suavemente los fórceps mientras sostiene la córnea en el medio. Utilice un bisturí de 10A para hacer cuatro cortes - dos verticales, dos horizontales - en la sección central del botón corneoscleral a través de la capa epitelial hasta el estroma subyacente.
3. Coloque un molde de vidrio estéril en una placa de 6 pozos con la parte ancha hacia arriba y coloque la córnea en el medio del molde de vidrio, lado del epitelio hacia abajo. Haga el corte justo en el centro de la parte inferior del molde de vidrio.
4. PASO CRÍTICO: Vierta 1 ml de agar de punto de fusión bajo del 1% (w/v) disuelto en DMEM para llenar el molde de vidrio con córnea por completo.
5. Deje que el agar se ajuste y luego invierta el molde de vidrio para que el epitelio corneal esté mirando hacia arriba.
6. Pipeta 15 μL del cultivo bacteriano con OD_600nm = 0,6 (para P. aeruginosa esto equivale a aproximadamente 1 x 10⁷ unidades formadoras de colonias (CFU) en 15 μL) directamente en un área cortada y luego añadir 85 μL de PBS a la parte superior para mantener el polilla de epitelio corneal. Diluir el cultivo bacteriano restante y la placa en el agar para contar las unidades de formación de colonias para el inoculum.
7. Agregue 1 ml de DMEM sin antibióticos en la parte inferior de cada pozo con el molde de vidrio. Incubar la placa de 6 pozos con los botones corneosclerales infectados en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂ para hasta 24 h.
8. Configure córnea de control no infectada junto con cada experimento. Para configurar el control no infectado, reemplace los 15 μL de cultivo bacteriano en el paso 6.6 por PBS estéril.

7. Homogeneización de la córnea para cosechar las bacterias

1. Deseche el medio DMEM de la parte inferior de la placa de 6 pozos y agregue 1 ml de PBS estéril para enjuagar la parte inferior del pozo.
2. Retire PBS suavemente pipeteando sin tocar la parte central del botón corneoscleral. Retire el anillo de vidrio usando fórceps estériles y colóquelo en el 5% Distel.
3. Enjuague suavemente la parte superior del botón corneoscleral con 1 ml de PBS dos veces [opcional].
4. Sujete el borde del botón corneoscleral con fórceps finos de la punta y desconéctelo del agar de abajo.
5. Transfiera la córnea a un tubo de 50 ml lleno de hielo frío de 1-2 ml de PBS.
6. Utilice un homogeneizador de punta fina para pura la parte superior de la córnea infectada. El tejido no tiene que ser completamente liquidado. El homogeneizador ayuda a separar las bacterias del epitelio corneal y el área cortada.
7. Vórtice la córnea en PBS durante unos segundos para mezclar el contenido.
8. Añadir 20 μL del homogeneato a 180 μL de PBS y realizar diluciones en serie en una placa de 96 pozos.
9. Diluir en serie la suspensión a 10^-4 y 10^-5 dilución y pipeta 10 μL del homogeneato diluido con bacterias en una placa de agar sanguíneo. Incubar la placa durante 8 horas y contar el número de CFU. Al probar el efecto de los antimicrobianos, el factor de dilución adecuado debe llegarse experimentalmente.

El diseño de los moldes de vidrio es una idea innovadora y original, cuyo uso nos permitió configurar el modelo de una manera consistente con problemas mínimos/nulos con la contaminación. Los moldes fueron preparados por un soplador de vidrio en la Universidad de Sheffield basado en un diseño(Figura 1A). La configuración experimental mantiene la forma convexa de la córnea y mantiene bacterias en la parte superior del epitelio donde se produce la infección (Figura 1B).

Las córneas porcinas generalmente se hinchan después de unos días en medio. Esto es normal y encontramos que no había ninguna diferencia significativa entre las córneas con y sin adición de dextrano, que generalmente se añade para evitar la hinchazón de la córnea (Figura 1H). Las córneas suelen ser heridas para ayudar a las bacterias a penetrar en el epitelio. Aunque no hubo ninguna diferencia significativa en el progreso de la infección entre las córneas heridas (cortadas) y sin cortar (sin cortar), observamos más variaciones entre las réplicas en córneas sin cortar(Figura 1C). Lavar las córneas dos veces con PBS elimina el exceso de bacterias que no se adjuntaron al epitelio. Hubo una diferencia significativa en CFU entre las córneas porcinas lavadas y no lavadas infectadas con P. aeruginosa PAO1 durante 24 horas(Figura 1D). No hubo ninguna diferencia significativa en el recuento de CFU entre las córneas de porcino y conejo infectadas con PA14 y PAO1 (Figura 1E,1F). Los resultados de ambos modelos fueron reproducibles. Después de 24 horas, la córnea infectada con cualquiera de las cepas pseudomonas siempre desarrolla opacidad y el área cortada se vuelve más visible y abierta en comparación con la córnea no infectada (Figura 1G).

Figura 1: Córnea ex vivo infectada con Pseudomonas aeruginosa. (A) Imagen esquemática de un molde de vidrio utilizado para mantener la forma de la córnea y facilitar la introducción de bacterias y tratamientos. El espesor de los moldes de vidrio es de 1,5 mm y es el mismo que el grosor de los tubos de ensayo hechos de vidrio borosilicato. (B) Imagen esquemática de la configuración experimental. (C) Probar el efecto de la herida en el recuento final de CFU después de la homogeneización. Las córneas sin cortar (n = 16) y cortadas (n = 28) fueron infectadas con P. aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa PA14 durante 24 horas. Las córneas fueron lavadas con 1 ml de PBS antes de la homogeneización. Las barras de error indican la desviación estándar. (D) Probar el efecto de lavar córneas con 2 x 1 ml de PBS (n = 6) y no lavar (n = 6) en el recuento final de CFU después de la infección con P. aeruginosa PAO1 durante 24 horas. Las barras de error indican la desviación estándar. (E) Recuento final de CFU en córneas porcinas infectadas con P. aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa PA14 durante 24 horas (n = 10). Las córneas fueron lavadas y cortadas. Las barras de error indican la desviación estándar. (F) Recuento final de CFU en córneas de conejo infectadas con P. aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa PA14 durante 24 horas (n = 6). Las córneas fueron lavadas y cortadas. Las barras de error indican la desviación estándar. (G) Imágenes de córneas porcinas ex vivo infectadas con P. aeruginosa PAO1 durante 24 horas. El control fue herido, pero no se añadieron bacterias. Las córneas infectadas resultaron heridas y 107 CFU fueron añadidas al lado cortado. No se recuperó ninguna CFU de la córnea de control. (H) CFU final recuperado después de 24 horas de infección con P. aeruginosa PAO1 de córneas tratadas con dextrano (n = 2) y aquellos sin dextrano (n = 9). Las córneas fueron lavadas y cortadas. Las barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.