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Research Article
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Capaz de recuperarse funcionalmente después de una lesión de la médula espinal, el pez cebra adulto es un sistema modelo de primer nivel para dilucidar los mecanismos innatos de regeneración neuronal. Aquí, describimos la resistencia a la natación y los ensayos de comportamiento de natación como lecturas funcionales de la regeneración de la médula espinal.
Debido a su reconocida capacidad regenerativa, el pez cebra adulto es un modelo de vertebrado de primer nivel para interrogar los mecanismos de regeneración innata de la médula espinal. Después de la transección completa de su médula espinal, el pez cebra extiende los puentes gliales y axonales a través del tejido cortado, regenera las neuronas proximales a la lesión y recupera sus capacidades de natación dentro de las 8 semanas posteriores a la lesión. La recuperación de la función de natación es, por lo tanto, una lectura central para la reparación funcional de la médula espinal. Aquí, describimos un conjunto de ensayos de comportamiento para cuantificar la capacidad motora del pez cebra dentro de un túnel de natación cerrado. El objetivo de estos métodos es proporcionar mediciones cuantificables de la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Para la resistencia a la natación, el pez cebra está sujeto a una velocidad de corriente de agua en constante aumento hasta el agotamiento, y se informa el tiempo de agotamiento. Para la evaluación del comportamiento de natación, los peces cebra se someten a bajas velocidades de corriente y los videos de natación se capturan con una vista dorsal de los peces. El porcentaje de actividad, la frecuencia de ráfaga y el tiempo pasado contra la corriente de agua proporcionan lecturas cuantificables del comportamiento de la natación. Cuantificamos la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra de tipo salvaje antes de la lesión y después de la transección de la médula espinal. Encontramos que el pez cebra pierde la función de natación después de la transección de la médula espinal y recupera gradualmente esa capacidad entre 2 y 6 semanas después de la lesión. Los métodos descritos en este estudio podrían aplicarse a estudios neuroconductuales, musculoesqueléticos, de regeneración muscular esquelética y de regeneración neuronal en peces cebra adultos.
El pez cebra adulto se utiliza eminentemente para investigar mecanismos de desarrollo neuromuscular y musculoesquelético y modelado de enfermedades1,2,3. El pez cebra es capaz de reparar de manera eficiente y espontánea múltiples tejidos, incluidos el cerebro, la médula espinal y el músculo esquelético4,5,6,7. La notable capacidad para regenerar tejidos neuromusculares y enfermedades modelo está atrayendo a una creciente comunidad científica a la investigación del pez cebra adulto1,2,3. Sin embargo, si bien los ensayos de locomoción y comportamiento de natación están disponibles y estandarizados para el pez cebra larval, existe una creciente necesidad de desarrollar protocolos análogos en peces adultos8,9,10,11. El objetivo de este estudio es describir protocolos para cuantificar la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Presentamos estos protocolos en el contexto de la investigación de la regeneración de la médula espinal. Sin embargo, los protocolos conductuales descritos aquí son igualmente aplicables a los estudios de regeneración neuronal y muscular, desarrollo neuromuscular y musculoesquelético, así como al modelado de enfermedades neuromusculares y musculoesqueléticas.
El pez cebra revierte la parálisis dentro de las 8 semanas posteriores a la transección completa de la médula espinal. A diferencia de los mamíferos poco regenerativos, el pez cebra muestra respuestas pro-regenerativas de lesiones inmunes, neuronales y gliales que se requieren para la reparación funcional de la médula espinal12,13,14. Una lectura definitiva de la reparación funcional de la médula espinal es la capacidad del tejido lesionado para recuperar su función después de la lesión. Un conjunto de métodos estandarizados para evaluar la regeneración funcional en roedores incluye pruebas locomotoras, motoras, sensoriales y sensoriomotoras15,16,17. Las pruebas ampliamente utilizadas en la lesión de la médula espinal de ratón de ratón incluyen la escala locomotora Basso Mouse (BMS), las pruebas motoras de extremidades anteriores, las pruebas sensoriales táctiles y las pruebas sensoriomotoras de marcha en rejilla15,17. En contraste con los sistemas de peces cebra de mamíferos o larvas, las pruebas de comportamiento en peces cebra adultos están menos desarrolladas, pero son muy necesarias para adaptarse a las crecientes necesidades de las comunidades de regeneración de tejidos y modelado de enfermedades.
Las transecciones completas de la médula espinal resultan en parálisis caudal completa al sitio de la lesión. Poco después de la lesión, los animales paralizados son menos activos y evitan nadar tanto como sea posible. Para compensar la pérdida de capacidad de natación, los animales paralizados muestran ráfagas cortas y frecuentes al abusar de sus aletas pectorales, que se encuentran rostrales de la lesión. Esta estrategia de natación compensatoria da como resultado un agotamiento rápido y una menor capacidad de natación. A medida que la médula espinal del pez cebra se regenera, los animales recuperan una función de natación oscilatoria suave caudal a la lesión, lo que permite una mayor resistencia a la natación y mejores parámetros de comportamiento de natación. Aquí, describimos métodos para cuantificar la resistencia a nadar del pez cebra a velocidades de corriente de agua crecientes y el comportamiento de natación a bajas velocidades de corriente.
El pez cebra adulto de las cepas Ekkwill y AB se mantuvo en la instalación central de pez cebra de la Universidad de Washington. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con los protocolos institucionales de animales de la IACUC.
NOTA: Un ejemplo de la configuración experimental se muestra en la Figura 1A. La tapa de calibración (personalizada), la tapa de resistencia a la natación (personalizada) y la tapa de comportamiento de natación (tapa de túnel estándar y cerrada) se muestran en la Figura 1B. El flujo de trabajo experimental se presenta en la Figura 2.
1. Preparación y calibración del túnel de natación
2. Evaluación de la resistencia a la natación
NOTA: Los grupos experimentales se dividen en grupos de 10 o menos animales para la resistencia a la natación.
3. Captura de videos para el ensayo de comportamiento de natación
NOTA: Solo se puede rastrear hasta cinco animales a la vez. Si los grupos experimentales son más grandes que cinco animales, se pueden tomar varios videos para cada grupo, donde el primer video rastrea cinco o menos animales y el segundo video rastrea a los otros cinco o menos animales. Para los estudios longitudinales que tienen como objetivo rastrear animales individuales a lo largo del tiempo, los peces se pueden alojar y rastrear individualmente en múltiples puntos de tiempo. Todos los scripts para el seguimiento y el análisis están disponibles a través de GitHub (consulte la Tabla de materiales).
4. Análisis de películas para la evaluación del comportamiento de natación
NOTA: La grabación y el análisis de películas se pueden completar en días separados.
Configuramos el túnel de natación como se describe en la sección 1 de este protocolo (Figura 1). Se evaluó la resistencia a la natación (sección 2 de este protocolo), así como el comportamiento de natación (secciones 3 y 4 de este protocolo) del pez cebra adulto al inicio y después de la lesión de la médula espinal (Figura 2).
Para establecer la función motora de referencia, examinamos la resistencia a la natación del pez cebra de tipo salvaje bajo velocidades crecientes de corriente de agua (Figura 3A). En este ensayo, el pez cebra de tipo salvaje nadó durante 41 minutos antes de agotarse. Los peces fueron sometidos a transecciones completas de la médula espinal como se describió anteriormente y se realizaron ensayos de resistencia a la natación6. Después de anestesiar el pez cebra con MS-222, se realiza una pequeña incisión con tijeras finas para transectar la médula espinal 4 mm caudal a la región del tronco encefálico. Se confirmó visualmente una transección completa. Para confirmar la pérdida de la capacidad de natación después de la cirugía de la médula espinal, los animales lesionados se evaluaron a los 2 o 3 días después de la lesión (dpi). En este punto de tiempo, el pez cebra está completamente paralizado caudal al sitio de la lesión. La resistencia a la natación se evaluó a las 2, 4 y 6 semanas después de la lesión (wpi). A 2 wpi, los peces lesionados perdieron el 60% de su capacidad de resistencia a la natación (Figura 3A). Los peces regeneradores recuperaron gradualmente la resistencia a nadar a 4 y 6 wpi. Estos resultados indicaron que el pez cebra de tipo salvaje es capaz de recuperar la capacidad de resistencia a la natación después de una lesión de la médula espinal.
Para examinar el comportamiento de nado del pez cebra durante la regeneración de la médula espinal, rastreamos el comportamiento de natación de animales de tipo salvaje a una velocidad de corriente de agua de 0 cm / s o bajo velocidades de corriente constantes y bajas de 10 y 20 cm / s (Figura 3B). Se utilizaron pistas promedio de la posición de los peces en la cámara del túnel de natación para la evaluación visual del comportamiento de la natación a bajas velocidades de corriente (Figura 3B). En este ensayo, los controles ilesos nadaron constantemente en la parte delantera de la cámara del túnel de natación (más cerca de la fuente de corriente de agua), lo que corresponde a una posición Y elevada (Figura 3B). En contraste, a 2 wpi, los peces heridos no pudieron mantener una capacidad de natación constante contra la corriente. En consecuencia, sus pistas de natación son más irregulares con una disminución general en la posición Y (Figura 3B). La posición Y aumentó a 4 y 6 wpi, lo que indica que los animales regeneradores recuperaron gradualmente su capacidad de nadar en la parte delantera de la cámara del túnel de natación. Para cuantificar los parámetros de comportamiento de natación, calculamos el porcentaje de actividad, la posición en el túnel de natación (posición Y) y el tiempo nadado contra la corriente (Figura 3C-E). En relación con los controles no lesionados, los animales lesionados a 2 wpi fueron marcadamente menos activos (Figura 3C), se estancaron en el cuadrante posterior del túnel de natación (Figura 3D) y perdieron su capacidad de nadar contra bajas velocidades de corriente (Figura 3E). De acuerdo con su capacidad innata para lograr la recuperación funcional, los animales lesionados normalizaron gradualmente los parámetros de comportamiento de natación a 4 y 6 wpi (Figura 3C-E). Los parámetros de resistencia a la natación y comportamiento de natación juntos ofrecieron lecturas cuantificables de la función de natación y la reparación funcional de la médula espinal en el pez cebra.
Figura 1: Configuración del túnel de natación y tapas personalizadas. (A) Imágenes representativas de la configuración del túnel de natación, incluidas las vistas superiores y laterales ampliadas de la cámara del túnel de natación. (B) Imágenes de las tapas del túnel de natación utilizadas para las diversas aplicaciones descritas en este protocolo. Se utiliza una tapa de túnel de natación estándar y completamente cerrada para los ensayos de comportamiento de natación (sección 3 de este protocolo). Para la calibración se utiliza una tapa de túnel de natación modificada que acomoda un medidor de flujo digital de mano (sección 1 de este protocolo). Una tapa de resistencia a la natación modificada, que contiene una tapa extraíble en el extremo posterior de la cámara del túnel de natación, permite la eliminación de peces agotados durante las pruebas de resistencia a la natación (sección 2 de este protocolo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tubería experimental para evaluar la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos. Para la resistencia a la natación, los peces nadaron contra una corriente de agua creciente hasta el agotamiento. Para el comportamiento de natación, los parámetros de natación se evalúan en ausencia y a bajas velocidades de corriente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recuperación funcional en pez cebra de tipo salvaje después de una lesión de la médula espinal. (A) Función motora determinada por ensayos de resistencia a la natación para peces cebra de tipo salvaje en la línea de base y 2, 4 y 6 wpi. Los puntos denotan animales individuales de dos experimentos independientes. (B) Los ensayos de comportamiento de natación rastrearon peces cebra de tipo salvaje bajo bajas velocidades de corriente de agua. La posición Y promedio se muestra en cada punto de tiempo a lo largo del seguimiento (0 cm / s durante 5 min, 10 cm / s durante 5 min y 20 cm / s durante 5 min). (C-E) El porcentaje de actividad (C), la posición promedio Y en el túnel (D) y el tiempo nadado contra el flujo (E) se cuantificaron a 20 cm / s. Para todas las cuantificaciones, se muestran dos experimentos independientes. n = 30 en la condición previa a la lesión; n = 23 en 2 wpi, n = 20 en 4 wpi, n = 18 en 6 wpi. Se utilizó ANOVA unidireccional para los análisis estadísticos. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001; P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Haga clic aquí para descargar este archivo.
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Capaz de recuperarse funcionalmente después de una lesión de la médula espinal, el pez cebra adulto es un sistema modelo de primer nivel para dilucidar los mecanismos innatos de regeneración neuronal. Aquí, describimos la resistencia a la natación y los ensayos de comportamiento de natación como lecturas funcionales de la regeneración de la médula espinal.
Agradecemos al Recurso Compartido de Pez Cebra de la Universidad de Washington por el cuidado de los animales. Esta investigación fue apoyada por el NIH (R01 NS113915 a M.H.M.).
| Software AutoSwim | Loligo Systems MI10000 | Opcional - para el control automático de la velocidad de la corriente | |
| Tapa personalizada | Loligo Systems | MI10001 | Esta tapa personalizada se utiliza para la resistencia de natación |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Opcional - para el control automático de la velocidad de corriente |
| Bomba Eheim | Loligo Systems PU10160 | 20 L/min. Esta bomba se coloca en el tanque de flujo. | |
| Fiji | Fiji | Disponible gratuitamente a través de Image J (Fiji) | Script específico disponible en https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Caudalímetro digital de mano - para calibración |
| Cámara de alta velocidad | Loligo Systems | Cámara de | vídeo en color VE10380 USB 3.0 (4MP) |
| Panel de luz IR | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, colocado debajo del túnel de natación cámara |
| Lente monofocal | Loligo Systems | VE10388 | lente manual de 25 mm |
| Tubo de PVC | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Espesor de la pared: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Disponible gratuitamente. Versión 3.6 con paquetes extra. | Script específico disponible en https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Respirómetro de túnel de natación | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). El sistema incluye la cámara de natación, el motor, el control manual de la velocidad de la corriente de agua, 1 bomba colocada dentro de la cámara, la tapa del túnel de natación estándar para el comportamiento de natación y la tapa del túnel de natación modificada para la calibración |
| uEye Cockpit | IDS | Software de libre acceso para controlar los parámetros | de la cámaraSe pueden utilizar cámaras alternativas y softwares complementarios Sonda de |
| flujo de rueda de paletas | Loligo Systems | AC10002 | Sonda de caudal digital - para calibración |
