Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

La comunicación entre el epitelio intestinal y el sistema inmunitario residente en el intestino es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis intestinal¹. Las interrupciones de estas interacciones se asocian con enfermedades locales y sistémicas, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y los cánceres gastrointestinales². Un ejemplo notable de un regulador crítico de la homeostasis descrito más recientemente proviene del estudio de las células linfoides innatas (ILC), que han surgido como actores clave en el panorama inmunológico intestinal³. Las ILC son un grupo de células inmunes innatas heterogéneas que regulan la homeostasis intestinal y orquestan la inflamación en gran medida a través de la señalización mediada por citoquinas⁴.

Las ILC murinas se dividen ampliamente en subtipos basados en los perfiles de expresión de factores de transcripción, receptores y citoquinas⁵. Las ILC de tipo 1, que incluyen células asesinas naturales (NK) citotóxicas y ILC tipo 1 similares a las auxiliares (ILC1), se definen por la expresión del factor de transcripción (eomesodermina) Eomes y la proteína T-box expresadas en células T (T-bet)⁶, respectivamente, y secretan citoquinas asociadas con la inmunidad T helper tipo 1 (T_H1): interferón-γ (IFNγ) y factor de necrosis tumoral (TNF), en respuesta a la interleucina (IL)-12, IL-15 e IL-18⁷. Durante la homeostasis, los ILC1 residentes en el tejido secretan factor de crecimiento transformador β (TGF-β) para impulsar la proliferación epitelial y la remodelación de la matriz⁸. Las ILC tipo 2 (ILC2) responden principalmente a la infección por helmintos a través de la secreción de citoquinas asociadas al T ayudante tipo 2 (T_H2): IL-4, IL-5 e IL-13, y se caracterizan por la expresión del receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico (ROR) α (ROR-α)⁹ y la proteína de unión a GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . En ratones, las ILC2 "inflamatorias" intestinales se caracterizan además por la expresión del receptor similar a la lectina de células asesinas (miembro G de la subfamilia G 1, KLRG)¹³ donde responden a il-25 derivada de células epiteliales del mechón^14,15. Finalmente, las ILC tipo 3, que incluyen células inductoras de tejido linfoide y ILC tipo 3 similares a ayudantes (ILC3), dependen del factor de transcripción ROR-γt¹⁶ y se agrupan en grupos que secretan factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF), IL-17 o IL-22 en respuesta a las señales locales de IL-1β e IL-23¹⁷. Las células inductoras de tejido linfoide se agrupan en los parches de Peyer y son cruciales para el desarrollo de estos órganos linfoides secundarios durante el desarrollo¹⁸, mientras que las ILC3 son el subtipo de ILC más abundante en la lámina propia del intestino delgado murino adulto. Uno de los primeros sistemas de cocultivo de organoides intestinales murinos con ILC3 se aprovechó para separar el impacto de la citoquina IL-22 en el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT-3) mediado por la repetición rica en leucina que contiene el receptor acoplado a proteína G 5 (Lgr5) ⁺ proliferación de células madre intestinales¹⁹, un poderoso ejemplo de una interacción regenerativa ILC-epitelial. Las ILC exhiben impronta-heterogeneidad entre órganos^20,21 y exhiben plasticidad entre subconjuntos en respuesta a citoquinas polarizantes²². Lo que impulsa estas huellas específicas de los tejidos y las diferencias de plasticidad, y qué papel desempeñan en enfermedades crónicas como la EII²³, siguen siendo temas emocionantes que podrían abordarse utilizando cocultivos organoides.

Los organoides intestinales han surgido como un modelo exitoso y fiable para estudiar el epitelio intestinal^24,25. Estos se generan mediante el cultivo de células madre epiteliales intestinales Lgr5 ⁺, o criptas aisladas completas, que incluyen células de Paneth como una fuente endógena de Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Estas estructuras 3D se mantienen en hidrogeles sintéticos²⁶ o en biomateriales que imitan la lámina basal propia, por ejemplo, la matriz extracelular basal de reticulación térmica (TBEM), y se complementan con factores de crecimiento que imitan el nicho circundante, especialmente el factor de crecimiento epitelial (EGF), el inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP) Noggin, y un ligando Lgr5 y un agonista Wnt R-Spondin1²⁷ . Bajo estas condiciones, los organoides mantienen la polaridad epitelial apico-basal y recapitulan la estructura cripta-vellosidad del epitelio intestinal con criptas de células madre en ciernes que se diferencian terminalmente en células absorbentes y secretoras en el centro del organoide, que luego se desprenden en el pseudoplume interno por anoikis²⁸. Aunque los organoides intestinales por sí solos han sido enormemente ventajosos como modelos reduccionistas del desarrollo epitelial y la dinámica en aislamiento^29,30, tienen un tremendo potencial futuro para comprender cómo estos comportamientos son regulados, influenciados o incluso interrumpidos por el compartimiento inmune.

En el siguiente protocolo se describe un método de cocultivo entre organoides del intestino delgado murino y lámina propia derivada de ILC1s, que se utilizó recientemente para identificar cómo esta población disminuye inesperadamente las firmas intestinales de inflamación y en su lugar contribuye a aumentar la proliferación epitelial a través de TGF-β en este sistema⁸.

Todos los experimentos deben completarse de acuerdo y de conformidad con todas las directrices reglamentarias e institucionales pertinentes para el uso de animales. La aprobación ética para el estudio descrito en el siguiente artículo y video se adquirió de acuerdo y cumplimiento con todas las pautas regulatorias e institucionales relevantes para el uso de animales.

Todos los ratones fueron sacrificados por luxación cervical de acuerdo con el procedimiento ético estándar, realizado por individuos entrenados. Antes de la extracción de órganos y tejidos, se realizó el corte de la arteria femoral o la decapitación (según corresponda al protocolo en cuestión) como evaluaciones confirmatorias de la muerte. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos (a menos que se indique lo contrario) en una unidad comercial acreditada y en una unidad animal del King's College london de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 (Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido (PPL: 70 / 7869 hasta septiembre de 2018; P9720273E a partir de septiembre de 2018).

1. Establecimiento de organoides del intestino delgado murino

NOTA: Esta sección del protocolo describe la generación de organoides intestinales a partir del intestino delgado murino. Las criptas se aíslan primero del tejido, se resuspenden en TBEM y luego se incuban con medios que contienen EGF, Noggin y R-Spondin (ENR). El establecimiento de organoides del intestino delgado murino también ha sido bien descrito en otros lugares 24,25,27.

1. Coloque TBEM en hielo para descongelar (40 μL / pozo) y coloque una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos estándar (se refiere a placas con una superficie hidrófila y cargada negativamente) en una incubadora de 37 ° C para precalentarla.
   NOTA: 500 μL de TBEM se descongelarán en aproximadamente 2-4 h; no lo deje a temperatura ambiente.
2. Prepare ~ 4 ml o 550 ml por pocillo de medio ENR agregando EGF, Noggin y R-Spondin al medio basal (Tabla 1) y colóquelo en una incubadora de 37 ° C.
3. Sacrificar a un animal de 6 a 12 semanas de edad y diseccionar el intestino delgado con fórceps y tijeras de microdisección. Colóquelo en 15 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en hielo.
4. Usando el estómago y el ciego como puntos de orientación, aísle la región deseada del intestino delgado (duodeno, yeyuno o íleon). En este protocolo, el íleon se aísla.
5. Sumergir el intestino en PBS sobre una placa de Petri de 10 cm² sobre hielo. Usando fórceps, retire la grasa suavemente, pero por completo, del intestino.
6. Cortar el tejido longitudinalmente usando tijeras de microdisección (preferiblemente con puntas redondeadas para evitar perforaciones). Mantener el intestino sumergido en PBS, agitar para eliminar la materia fecal y mantener el lado mucoso hacia arriba para rastrear la orientación del tejido.
7. Transfiera el tejido a la tapa seca de una placa de Petri sobre hielo, colocando el lado mucoso / velloso del intestino hacia arriba. Sosteniendo un extremo del intestino con fórceps, raspe suavemente el moco usando el borde en ángulo de un portaobjetos de vidrio limpio.
8. Llene el plato con PBS helado y enjuague el pañuelo.
9. Pre-recubrir un tubo de 50 mL con PBS2 (PBS + 2% FCS; ver Tabla 1) para evitar la adhesión del tejido al plástico y añadir 10 mL de PBS helado a este tubo. Corte el intestino en segmentos pequeños (~ 2 mm) y transfiéralos al tubo de 50 ml pre-recubierto con PBS2.
10. Usando una pipeta de 25 ml pre-recubierta con PBS2, pipetee los segmentos hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces para limpiar los fragmentos de tejido.
11. Permita que los segmentos se asienten durante 15-30 s, retire y deseche el sobrenadante PBS, y repita los pasos 1.10 y 1.11 hasta que la solución esté clara (aproximadamente 3-4 veces).
12. Permita que los segmentos se asienten y descarte el sobrenadante PBS. Agregue 30 ml de búfer de aislamiento de criptas heladas (Tabla 1).
13. Coloque los tubos en un rodillo o balancín horizontal a 30-60 rpm (o suave) durante 30 min a 4 °C. No incube a velocidades más rápidas, temperaturas más altas o de mayor duración, ya que las criptas se desalojarán prematuramente y se convertirán en células individuales con menor viabilidad y rendimiento.
    NOTA: A partir de esta etapa, todos los procedimientos deben llevarse a cabo en un ambiente aséptico utilizando materiales y reactivos estériles.
14. Permita que los segmentos intestinales se asienten en la base del tubo de 50 ml. Retire el búfer de aislamiento de cripta sin interrumpir los segmentos asentados y transfiéralo a un tubo de 50 ml en hielo.
    NOTA: Si el proceso de aislamiento de criptas fue demasiado riguroso, se pueden ver criptas en esta fracción. Por lo tanto, se puede mantener como reserva, pero se descartará de manera óptima al final del protocolo.
15. Agregue 20 ml de PBS helado a los segmentos intestinales. Usando una pipeta de 25 ml pre-recubierta con PBS2, pipetea los segmentos intestinales hacia arriba y hacia abajo 5-8 veces.
16. Deje que los segmentos se conformen con 30 s. Pre-recubrimiento de un tubo de 50 ml y una pipeta de 25 ml con PBS2. Con esta pipeta, recoja el sobrenadante (fracción 1) en el tubo de 50 ml precubierto y colóquelo sobre hielo.
    NOTA: Esta fracción sirve para enjuagar el búfer de aislamiento de cripta restante. Sin embargo, también sirve como un paso adicional de control de calidad; si el pipeteo fue demasiado vigoroso, las criptas serán abundantes en esta fracción de enjuague, y si fue demasiado suave, habrá muy pocos escombros en esta fracción. De manera óptima, la fracción 1 se descarta al final del protocolo, pero se puede usar para hacer organoides si surgen problemas con las fracciones 2-4 obtenidas a continuación.
17. Repita los pasos 1.15 y 1.16, pero agregue 10 ml de PBS helado en lugar de 20 ml y coloque el sobrenadante en un tubo fresco de 50 ml precubierto con PBS2 (fracción 2).
18. Repita el paso 1.17 dos veces más, pero agrupe el sobrenadante resultante con la fracción 2 (en el mismo tubo de 50 ml del paso 1.17) para obtener las fracciones 2-4. Este único tubo de 50 ml debe contener las criptas desalojadas en 30 ml de PBS helado.
19. Retire una alícuota de 50 μL de las 2-4 fracciones agrupadas y colóquela en una cubierta. Evaluar la presencia de criptas epiteliales utilizando un microscopio de luz invertida.
    NOTA: Si las criptas no están presentes, repita los pasos 1.17 y 1.18 usando más fuerza durante el pipeteo hasta que se liberen las criptas. Asegúrese de que las criptas no se desalojaron prematuramente en el búfer de aislamiento de criptas del paso 1.14 o en la fracción 1 del paso 1.16.
20. Pre-recubrimiento de un colador de 100 μm y un tubo de 50 ml con PBS2. Pase las fracciones de cripta agrupadas a través de este colador y en el tubo de 50 ml pre-recubierto.
21. Girar hacia abajo fracciones de cripta tensadas a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
22. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las criptas en 10 ml de DMEM/F12 avanzado helado. Mueva las criptas a un tubo de 15 ml.
23. Girar criptas a 210 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar células individuales y linfocitos.
24. Criptas resuspend en 1 mL de DMEM/F12 Avanzado helado.
25. Retire una alícuota de 10 μL y colóquela sobre una funda. Usando un microscopio de luz invertida, cuente el número de criptas para determinar la concentración de criptas.
26. Calcule el volumen requerido para ~ 400 y ~ 1,500 criptas. Cubra previamente una punta p1000 con PBS2 y use esta punta para pipetear los volúmenes requeridos (que contienen ~ 400 y ~ 1,500 criptas) en tubos separados de 1.5 ml.
27. Gire hacia abajo las criptas a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C.
28. Retire la mayor cantidad de sobrenadante posible y luego vuelva a suspender las criptas en 80 μL de TBEM colocadas en hielo (puntas de pipeta preenfriadas a 4 ° C para evitar la gelificación de la matriz, que ocurre a 12 ° C).
29. Retire la placa de 24 pocillos, colocada en el paso 1.1, de la incubadora. Pipetee suavemente 40 μL de criptas en el centro de un pozo en un movimiento lento y circular para formar una estructura de cúpula plana pero 3D, o en tres pequeñas cúpulas separadas.
    NOTA: La viabilidad de los organoides es la más baja en el centro de la cúpula donde los nutrientes y gases penetran con menos eficacia³¹; por lo tanto, maximizar el área de superficie expuesta a los medios mientras se mantienen estructuras 3D claras es fundamental.
30. Repita el paso 1.29 para crear un total de dos pozos con una densidad de ~200 criptas por pozo y dos pozos más con una densidad de ~750 criptas por pozo. Coloque directamente la placa en una incubadora (37 ° C y 5% de CO₂) durante 15-20 min, teniendo cuidado de no interrumpir las cúpulas de matriz viscosa pero aún líquida.
31. Añadir 550 μL de medio ENR precalentado por pocillo (a partir del paso 1.2) e incubar durante 24 h a 37 °C y al 5% de CO_2. En esta etapa, se sugiere complementar el medio ENR con 5 μM de agonista Wnt (CHIR 99021) e inhibidor de la quinasa Rho 5 μM (Y-27632) durante las primeras 24 h de cultivo después del aislamiento para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la generación de organoides de criptas recién aisladas del tejido.
    NOTA: Las criptas deben cerrarse para formar estructuras redondeadas dentro de las 24 h, y los brotes de cripta deben aparecer dentro de los 2-4 días (Figura 1A).
32. Reemplace con medio ENR fresco al final de la incubación en el paso 1.31, y luego cada ~ 2 días o cuando el indicador de pH de fenol en el medio de cultivo se vuelva de color naranja pálido pero antes de que se vuelva amarillo.

2. Mantenimiento de organoides del intestino delgado murino

NOTA: Esta sección del protocolo describe el mantenimiento y la transmisión de organoides del intestino delgado murino. Los organoides se extraen primero y luego se interrumpen mecánicamente utilizando una punta p1000 doblada. Este proceso rompe grandes organoides que consisten en numerosas criptas en múltiples fragmentos más pequeños para la expansión y libera células muertas que se han acumulado en el pseudolumen. El mantenimiento de organoides del intestino delgado murino también ha sido bien descrito en otros lugares 24,25,27. Todos los procedimientos deben realizarse en un ambiente aséptico utilizando materiales y reactivos estériles. El paso o la expansión de los organoides una vez cada 4-5 días, antes de que se produzca el estallido de los organoides por la acumulación sustancial de desechos en la luz organoide. Los organoides se pueden pasar en una proporción de 1: 2-1: 3 dependiendo de la densidad de organoides, que de manera óptima estará entre 100-200 organoides por pozo.

1. Al igual que en los pasos 1.1 y 1.2, descongelar TBEM en hielo (40 μL/pozo) y preparar en medio ENR (550 μL por pozo). Coloque la placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejido medio y estándar en una incubadora de 37 °C.
2. Retire la placa que contiene organoides de la incubadora. Deseche los medios del pozo para ser pasados.
3. Añadir 500 μL de DMEM/F12 avanzado helado al pozo. Usando una punta p1000 (pre-recubierta con medios para evitar que los organoides se peguen al interior de la punta), extraiga los organoides en un tubo de 15 ml.
4. Enjuague el fondo del pozo con 250-300 μL de DMEM/F12 avanzado helado asegurando que no queden organoides en el pozo, y agrupe en el tubo de 15 ml que contiene organoides extraídos del paso 2.3. Repita los pasos 2.3 y 2.4 al pasar varios pozos y agrupe los organoides de varios pozos en el mismo tubo de 15 ml.
5. Girar hacia abajo organoides a 300 x g durante 3 min a 4 °C.
6. Tras la centrifugación, asegúrese de que haya cuatro fracciones visibles: una fracción base con organoides sanos, una fracción de matriz central y clara, una fracción de matriz que contiene células simples y muertas, y una capa sobrenadante superior que contiene células simples y muertas. Retire el sobrenadante, la fracción de escombros y la mayor cantidad posible del fragmento de matriz transparente sin interrumpir la bolita de organoides.
7. Doble suavemente la punta de una punta de pipeta p1000 (curva de aproximadamente 2-5 mm). Cubra previamente esta punta en PBS2 o Advanced DMEM/F12. Usando esta punta, pipetee los organoides hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces para interrumpir mecánicamente los organoides y la matriz restante.
8. Girar hacia abajo a 210 x g durante 3 min a 4 °C.
9. Como en el paso 2.6, retire el sobrenadante, la fracción de escombros y la mayor cantidad posible del fragmento de matriz transparente sin interrumpir la bolita de criptas disociadas. Si las criptas sanas o los organoides pequeños no han formado un gránulo transparente, centrífuga de nuevo a 300 x g durante 3 min a 4 °C.
10. Calcule el volumen requerido de TBEM (80-120 μL por pocillo de organoides extraídos dependiendo de si se utiliza una relación de paso de 1: 2 o 1: 3).
11. Resuspenda el pellet en el volumen calculado de TBEM y aplique 40 μL por pocillo a la placa de 24 pocillos precalentada para formar una cúpula. Coloque directamente la placa en la incubadora (37 °C; 5% CO₂) durante 15-20 min.
12. Añadir 550 μL de medio ENR por pocillo e incubar a 37 °C y 5% de CO₂. Compruebe los cultivos para la formación de organoides después de 24 h_. Reemplace con medio ENR fresco cada 2-3 días después del pasaje.

3. Aislamiento de las células linfoides innatas de la lámina propia del intestino delgado

NOTA: Esta sección del protocolo describe el aislamiento de ILC1 de la lámina propia del intestino delgado murino de los ratones reporteros RORγt^GFP. Esto implica la eliminación de células epiteliales, la digestión de tejidos, la separación del gradiente de densidad de linfocitos y el aislamiento de ILC1 a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El aislamiento de FACS siguiendo la estrategia de cierre en la Figura 2 requiere la mezcla maestra de tinción extracelular (Tabla 4), con los controles de tinción adicionales descritos en la Tabla 2 y la Tabla 3 para la máquina (Tabla 2) y la configuración de la compuerta (Tabla 3). Los ratones reporteros RORγt^GFP se utilizan para aislar ILC1 vivo y puro y cerrar RORγt^{GFP +} ILC3. El procesamiento tisular para el aislamiento de linfocitos de lámina propia también ha sido bien descrito en otra parte³².

1. Procesamiento de tejidos
   NOTA: El tejido de réplicas biológicas individuales de animales se mantiene separado en este protocolo. Estas muestras deben etiquetarse adecuadamente y mantenerse en hielo siempre que sea posible. Se debe permitir que todos los reactivos, excepto las enzimas de digestión, alcancen la temperatura ambiente para garantizar una digestión rápida de los tejidos.
   1. Coloque TBEM en hielo para descongelar (40 μL/pozo). Mantenga una placa estándar de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos en una incubadora de 37 °C para precalentarla.
   2. Preparar un tampón de eliminación epitelial fresco y un tampón de digestión (ver Tabla 1). Preparar el medio isotónico de gradiente de densidad de baja viscosidad (LVDGM) (90% LVDGM y 10% 10x PBS), 40% isotónico LVDGM y 80% isotónico LVDGM en tampón neutralizante (Tabla 1).
   3. Sacrificar a un animal de 6 a 12 semanas de edad, diseccionar el intestino delgado usando fórceps y tijeras de microdisección, y colocar el intestino en 15 ml de PBS en hielo.
   4. Sumerja el intestino en PBS en una placa de Petri^de 10 cm 2 sobre hielo y use fórceps para eliminar la grasa suavemente pero completamente del intestino.
   5. Retire los parches de Peyer (~ 5-10; corriendo en una línea opuesta a la línea de tejido graso) usando tijeras de microdisección para agotar las células inductoras de tejido linfoide y las células B.
      NOTA: Los parches de Peyer están ausentes en Rag^-/- y otros animales agotados por el linaje. A diferencia de las burbujas de aire, los parches de Peyer permanecerán en su lugar si se empujan.
   6. Cortar el tejido longitudinalmente usando tijeras de microdisección (preferiblemente con puntas redondeadas para evitar perforaciones). Manteniendo el intestino sumergido en PBS, agite para eliminar la materia fecal.
   7. Corte el tejido en trozos de 2-4 cm de longitud y transfiéralos a un tubo de 50 ml.
   8. Agregue aproximadamente 20-40 ml de PBS helado y agite vigorosamente durante 5-15 s para eliminar la mucosa y los desechos.
   9. Deseche el contenido del tubo en una placa de Petri fresca y reemplace los fragmentos intestinales en el mismo tubo de 50 ml con fórceps.
   10. Repita los pasos 3.1.8 y 3.1.9 3-4 veces, o hasta que el PBS esté despejado.
2. Eliminación del epitelio
   1. Coloque los fragmentos intestinales en una placa de Petri fresca sobre hielo. Usando fórceps, recoja los segmentos intestinales y elimine el exceso de líquido golpeando una superficie seca.
   2. Corte el tejido en trozos de ~ 0.75-1 cm y transfiéralos a un tubo fresco de 50 ml. Añadir 5-7 ml de tampón de eliminación epitelial (Tabla 1). Vórtice el tubo y asegúrese de que todos los segmentos intestinales estén sumergidos en el tampón.
   3. Incubar las muestras a 37 °C con balanceo (100-150 rpm) durante 12-15 min. Vórtice el tubo durante 20-30 s.
   4. Repita los pasos 3.2.1-3.2.3 una vez más, descartando el sobrenadante turbio (la fracción contiene células epiteliales e intraepiteliales) y reemplazándolo con un tampón de eliminación epitelial fresco.
3. Digestión del tejido
   1. Vierta el contenido en una placa de Petri fresca. Usando fórceps, recoja los segmentos intestinales y toque una superficie seca para desechar el exceso de líquido. Coloque los segmentos en una placa de Petri fresca sobre hielo.
   2. Agrupa los segmentos en el centro de la placa de Petri en una masa densa. Usando dos bisturíes o tijeras afiladas, triture finamente el tejido hasta que alcance una consistencia viscosa que podría pasar a través de una punta de pipeta p1000.
   3. Usando pinzas, coloque el tejido picado en un tubo limpio de 50 ml. Enjuague la placa de Petri con 1-2 ml de tampón de digestión (Tabla 1) para recoger cualquier tejido restante y agruparlo en el tubo de 50 ml con el tejido triturado.
   4. Agregue 5-7 ml de tampón de digestión al tejido triturado y asegúrese de que todo el tejido se recoja en la parte inferior del tubo.
   5. Incubar las muestras a 37 °C, con balanceo medio (~100-150 rpm) durante 15 min. Vórtice el tubo durante 20-30 s cada 5 minutos para ayudar a la digestión.
   6. Mientras las muestras se incuban, coloque un colador de células de 40 μm encima de un tubo fresco de 50 ml para cada muestra. Cubra los filtros con 1-2 ml de tampón neutralizante (Tabla 1).
   7. Vórtice las muestras durante 20-30 s después de que la incubación haya terminado.
   8. Filtre el tejido parcialmente digerido a través del filtro recubierto de 40 μm en el tubo de 50 ml que contiene el tampón neutralizante.
   9. Use pinzas para recolectar tejido no digerido del filtro de 40 μm y colóquelo nuevamente en el tubo de 50 ml en el que se realizó la digestión, para la segunda ronda de digestión. Retire los filtros y enjuáguelos con tampón de digestión para desalojar cualquier tejido no digerido que se adhiera al filtro.
   10. Una vez que se haya retirado del filtro la mayor cantidad posible de tejido no digerido y se haya colocado de nuevo en el tubo de 50 ml en el que se realizó la digestión, enjuague el filtro con un tampón neutralizante de 1-2 ml sobre el tubo de 50 ml que contiene el sobrenadante filtrado.
   11. Agregue 20-25 ml de tampón neutralizante al sobrenadante filtrado y colóquelo en hielo para mantener la viabilidad de las células aisladas durante la segunda ronda de digestión del tejido.
   12. Agregue otros 5-10 ml de tampón de digestión al tejido no digerido y repita los pasos 3.3.5-3.3.10, asegurándose de filtrar el tejido digerido en el mismo tubo que se usó en el paso 3.3.8 (el mismo filtro también se puede reutilizar). Enjuague el filtro con tampón neutralizante hasta que se alcance la línea de 50 ml y luego deseche cualquier tejido no digerido restante.
4. Aislamiento de linfocitos por gradiente de densidad
   1. Girar los sobrenadantes recolectados para cada réplica biológica a 500 x g durante 10 min.
   2. Durante el paso 3.4.1, agregue 5 ml de LVDGM isotónico al 80% a un tubo de 15 ml para cada réplica biológica.
   3. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante del tejido filtrado y digerido. Resuspender el pellet en 10 mL de 40% isotónico LVDGM, asegurando que el pellet esté bien homogeneizado y que no queden grandes trozos.
   4. Ajuste de la ayuda de pipeta a su ajuste más lento, incline el tubo de 15 ml que contiene 80% de LVDGM isotónico y superponga muy suavemente los 10 ml de suspensión celular en 40% isotónico LVDGM asegurando que la suspensión celular no se mezcle con la fracción del 80%.
      NOTA: Si las fracciones alguna vez se mezclan accidentalmente, distribuya rápidamente los linfocitos que alcanzaron la fracción del 80% entre dos tubos de 50 ml llenos de PBS y centrífuga durante 10 minutos a 500 x g. A continuación, deseche el sobrenadante y repita los pasos 3.4.3-3.4.4.
   5. Gire los tubos a 900 x g y 20 °C, con la aceleración y la desaceleración configuradas en la configuración más baja para garantizar que las fracciones no se interrumpan. Centrifugadora durante 20 min (sin incluir el tiempo de descanso).
      NOTA: Todos los procedimientos a partir de este paso deben realizarse en una campana de cultivo de tejido aséptico utilizando materiales y reactivos estériles.
   6. Cubra previamente un tubo de 50 ml para cada muestra con PBS2 y agregue 45 ml de PBS helado.
   7. Después de la centrifugación, retire suavemente la capa superior de escombros del tubo de 15 ml. Cubra una punta p1000 con PBS2 y úsela para recolectar la interfase cargada de linfocitos entre los gradientes del 40% al 80% en el tubo de 50 ml que contiene 45 ml de PBS helado.
   8. Girar los tubos a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
   9. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 500 μL de tampón FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA y 10 mM HEPES; ver Tabla 1). Recubrir previamente un filtro de 40 μm con tampón FACS y usarlo para filtrar la suspensión celular en un tubo de flujo. Enjuague el tubo de 50 ml con 500 μL adicionales de tampón FACS y filtre en el mismo tubo de flujo.
   10. Extraer una alícuota de 10 μL de los 1 ml resultantes de suspensión celular. Cuente el rendimiento de los linfocitos utilizando un contador celular o un hemocitómetro y calcule la concentración celular para cada muestra.
5. Preparación de muestras para la clasificación - tinción extracelular
   NOTA: Los anticuerpos utilizados en la mezcla maestra de tinción extracelular, así como los reactivos para preparar el tinte de viabilidad fijable y la solución de bloque Fc, se utilizan en concentraciones suficientes para hasta 5 x 10⁶ células por 100 μL. Los volúmenes deben ajustarse en consecuencia. Para que la compensación de la máquina FACS clasifique ILC1, se requieren controles de un solo color para cada uno de los fluoróforos en la mezcla maestra de tinción extracelular. Para los anticuerpos, se pueden usar perlas de compensación que contienen una población de cuentas de unión de anticuerpos positiva y una población de cuentas de no unión de anticuerpos negativas. Para el control de color único de color fijo de color de color fijo de color ultravioleta (UV), se pueden usar perlas de compensación que contienen poblaciones reactivas amina (para señal positiva) y no reactivas (para señal negativa). No se recomienda utilizar células de la RORγt^GFPratones reporteros para el control de color único de color de color de color único de color fijable, ya que estas células contendrán un GFP⁺ señal.
   1. Retire una pequeña alícuota de ~10 μL de cada muestra y agréguela en un tubo de flujo separado que contenga 250 μL de tampón FACS. Coloque el tubo sobre hielo. Esto se utilizará para el control no detenido.
   2. Agregue 1 ml de PBS al volumen restante en los tubos de muestra. Centrifugadora a 300-400 x g durante 3-5 min.
   3. Preparar 200 μL de solución de colorante de viabilidad fijable UV por muestra. Colorante de viabilidad fijable UV diluido (resuspendido en DMSO siguiendo las instrucciones del fabricante) 1:500 en PBS (o siguiendo las instrucciones del fabricante).
   4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las muestras en 200 μL de solución de colorante de viabilidad fijable por UV. Vórtice los tubos e incube en la oscuridad a 4 °C durante 10-15 min.
   5. Agregue 2 ml de tampón FACS a los tubos para apagar el tinte de viabilidad fijable UV, vórtice durante 10 s y centrífugue los tubos a 300-400 x g durante 3-5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante de los tubos centrifugados.
   6. Preparar 200 μL de solución de bloque Fc por muestra (0,25 mg/ml de bloque Fc en el tampón FACS).
   7. Añadir 200 μL de solución de bloque Fc a cada una de las muestras del paso 3.5.5, vórtice durante 10 s, e incubar en la oscuridad a 4 °C durante 10 min.
   8. Añadir 500 μL de tampón FACS a un tubo de flujo nuevo. Retire una alícuota de 2-5 μL de cada muestra y agréguela en el tubo para los controles de fluorescencia menos uno (FMO).
   9. Vórtice el tubo FMO durante 10 s y distribúyalo uniformemente (100 μL por tubo) en tubos de flujo frescos etiquetados para cada uno de los controles FMO (cóctel Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO y NK1.1 FMO; consulte la Tabla 3). Añadir todos los anticuerpos excepto el anticuerpo de interés a cada tubo (como se describe en la Tabla 3) y vórtice durante 10 s. Coloque los controles FMO a un lado en la oscuridad a 4 °C.
   10. Centrifugar las muestras (no controles FMO) a 300-400 x g durante 3-5 min a 4 °C.
   11. Preparar mastermix de tinción extracelular (200 μL por muestra) con las diluciones finales de anticuerpos como se describe en la Tabla 4. Ajuste el volumen de tinción para la concentración celular adecuada (hasta 5 x 10⁶ células por 100 μL) dependiendo del recuento de células del paso 3.4.10.
   12. Agregue la mezcla maestra de tinción extracelular a las muestras, vórtice durante 10 s y colóquelas a un lado en la oscuridad a 4 ° C.
   13. Preparar un nuevo control de un solo color para cada anticuerpo destinado a ser utilizado en la estrategia de cierre (Figura 2). Perlas de compensación de anticuerpos de vórtice durante 20 s, agregue 1 gota de perlas a un tubo de flujo, manche con 0,5 μL de anticuerpo (como se muestra en la Tabla 2 o siguiendo las instrucciones del fabricante) y vórtice durante 10 s.
   14. Prepare un control de color único de tinte de viabilidad fijable a los rayos UV utilizando un kit de perlas de compensación reactiva amina. Perlas de compensación reactivas a la amina Vortex durante 20 s, agregue 1 μL de colorante UV vivo / muerto (como se muestra en la Tabla 2, o siguiendo las instrucciones del fabricante) y vórtice durante 10 s.
   15. Incubar las muestras, fmO y controles de un solo color en la oscuridad durante 30 min a 4 °C.
   16. Durante este tiempo, prepare tubos para recolectar las células clasificadas. Agregue 400-500 μL de FBS al 10% en tubos Advanced DMEM/F12 a 1.5 mL para cada muestra.
   17. Después de la incubación, agregue 2 ml de PBS2 a cada una de las muestras, controles FMO y controles de un solo color.
   18. Centrifugue las muestras, controles FMO y controles de un solo color a 300-400 x g durante 3-5 min a 4 °C.
   19. Deseche el sobrenadante de todos los tubos centrifugados. Resuspend las muestras y los controles FMO en 250 μL de tampón FACS y vórtice durante 10 s.
   20. Resuspendir los controles de un solo color en 250 μL de PBS2. Agregue 1 gota de perlas de amina no reactivas al tinte de viabilidad fijable UV solo para el control de un solo color. Vórtice todos los controles durante 10 s.
   21. Las celdas ya están listas para ser clasificadas. Mantenga las muestras, los controles FMO y los controles de un solo color en el hielo en la oscuridad siempre que sea posible para mejorar la viabilidad celular y evitar la pérdida de señal por fotoblanqueo.

4. Cocultivo de organoides del intestino delgado con células linfoides innatas

NOTA: En esta sección se describe el cocultivo de ILC1 del intestino delgado murino clasificado (aislado siguiendo el protocolo de la sección 3) con organoides del intestino delgado murino (descritos en las secciones 1 y 2). Los organoides deben usarse de manera óptima 1-2 días después del paso. El cocultivo implica la recolección de los organoides, la adición del número apropiado de ILC1, la centrifugación a organoides de pellets e ILC1 juntos, y la resuspción en TBEM. Complete esta sección lo antes posible una vez que se haya aislado la ILC1. Todos los procedimientos deben realizarse en un ambiente aséptico utilizando materiales y reactivos estériles.

1. Asegúrese de que TBEM del paso 3.1.1 se ha descongelado.
2. Cosechar organoides de 1-2 días de antigüedad como se describe en los pasos 2.3 y 2.4.
3. Resuspend el pellet organoide en 1 mL de frío frío y frío Advanced DMEM/F12. No doble la punta p1000 como se hace al pasar los organoides, ya que la intención aquí es mantener la estructura organoide para el cocultivo. Si es necesario, coloque los organoides en tubos separados de PBS2 recubiertos de 1,5 ml en hielo durante un corto período para distribuirlos entre diferentes condiciones de cocultivo.
   NOTA: Solo comience la preparación de organoides una vez que las muestras de ILC estén listas para el cocultivo; trabajar en hielo y rápidamente tan pronto como los organoides han sido cosechados para minimizar la muerte de las células epiteliales.
4. Pre-recubrimiento de un tubo de 1,5 ml con PBS2 por muestra de réplica ILC. Distribuya ~ 100-200 organoides (aproximadamente 1 pocillo de una placa de 24 pocillos) en cada tubo.
5. Pre-recubrir una punta p1000 en PBS2 y usarla para evaluar el volumen de ILC1s después de la purificación de FACS (250-300 μL + volumen clasificado). Determine la concentración de ILC1 por ml utilizando el número de celdas registradas de la clasificación y determine el volumen requerido.
6. Usando la misma punta p1000 recubierta de PBS2, agregue no menos de 500 ILC1 al tubo de 1.5 ml recubierto de PBS2 que contiene los organoides. Si el número de ILC1 producidos por la clasificación es inferior a 500, agregue el organoide directamente al tubo que contiene el tipo original para minimizar la pérdida de células de la transferencia.
7. Gire hacia abajo ILC1 y organoides a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Si es posible, evite las centrífugas de mesa de diámetro pequeño, ya que estas agruparán las células a lo largo del borde del interior del tubo en lugar de crear un gránulo en la punta del tubo. Dado que el número de células es muy bajo, es imperativo minimizar la pérdida de células durante estos pasos.
8. Retire lenta y suavemente la mayor cantidad posible del sobrenadante sin perturbar el gránulo (que puede no ser visible a simple vista, especialmente en controles sin organoides solo ILC). Coloque la muestra sobre hielo.
9. Resuspendir el pellet frío en 30 μL por pocillo de TBEM. Mientras sostiene el tubo sobre una superficie fría (por ejemplo, una pequeña caja de hielo colocada en la campana de cultivo de tejidos), mezcle los organoides y la ILC al menos 10-15 veces para garantizar una distribución uniforme. Triturar con frecuencia pero suavemente, para evitar dañar los organoides y la formación de burbujas.
10. Aplique 30 μL por pocillo de organoides ILC en TBEM a una placa precalentada de 24 o 48 pocillos para formar una sola cúpula. Coloque directamente la placa en la incubadora (37 °C y 5% de CO₂) durante 10-20 min.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente que los controles solo de ILC y solo de organoides estén configurados para el análisis posterior. ILC1 son raros, pero ^GFP-ILC2 puede ser sustituido por inmunofluorescencia o controles de citometría de flujo FSC / SSC cuando sea científicamente apropiado.
11. Añadir 550 μL (por pocillo) de medio ILC1 completo (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoetanol; ver Tabla 1) con cualquier citoquina experimental deseada o anticuerpos bloqueadores e incubar a 37 °C y 5% CO₂ durante 24 h.
12. Después de 24 h, retire suavemente la placa de la incubadora y deje que la placa se asiente en una campana de cultivo de tejidos durante 1 minuto para asegurarse de que los linfocitos estén asentados.
13. Retire 200-250 μL de medio y colóquelo en un pozo vacío de una placa de 24 pocillos. Revise este sobrenadante con un microscopio invertido para asegurarse de que no se extirpó ningún linfocitos.
    1. Si el sobrenadante es claro, agregue 300 μL de medio ILC1 fresco al cocultivo en el pozo original. Si los linfocitos están presentes en el sobrenadante, centrífuga a 300-400 x g durante 3-5 min a 4 °C y resuspenda en 300 μL de medio ILC1 fresco y agregue esto a los 200-250 μL restantes de medios en el pozo original. Asegúrese de reponer los medios cada 1-2 días o cuando los medios se vuelvan de color naranja pálido / amarillo.
       NOTA: No permita que los medios se evaporen lo suficiente como para que la punta de la cúpula de la matriz rompa la superficie del medio. Asegúrese siempre de que la matriz esté completamente sumergida. El exceso de evaporación se puede evitar mediante el uso de pozos centrales en las placas de cultivo de tejidos y la adición de ~ 600 μL de PBS a los pozos circundantes. Los cocultivos con ILC adulto son estables durante 1-4 días, después de lo cual los organoides que se sembraron sin interrupción importante se romperán y volverán a sembrar como nuevas criptas. Si se analiza el epitelio, se recomienda que los cultivos se analicen dentro de los 1-4 días posteriores al establecimiento de los cocultivos.
    2. Realizar análisis aguas abajo utilizando inmunofluorescencia, citometría de flujo o purificación FACS de poblaciones objetivo en tampón de lisis para el análisis de expresión génica mediante RNA-seq o RT-qPCR de una sola célula o a granel, como se describe en la referencia⁸.

Cuando se completan con éxito, las criptas recién aisladas deben formar estructuras de cripta en ciernes dentro de 2-4 días (Figura 1A). Los cultivos organoides sanos y robustos deben estar creciendo activamente y pueden pasarse y expandirse como se detalla en el protocolo.

Este protocolo describe el aislamiento de ILC1 del intestino delgado de la línea reportera transgénica murina RORγtGFP , lo que permite el aislamiento de ILC1 vivo por FACS (Figura 2). Usando el protocolo descrito aquí, el rango de conteo esperado de ILC1 es de 350-3,500 células aisladas.

Después de ser sembrados con organoides, los cocultivos pueden ser visualizados por inmunocitoquímica (Figura 3A-B). Las ILC y las células epiteliales también se pueden analizar mediante citometría de flujo, como se demuestra en la Figura 3C. ILC1 regula al alza el epitelial CD44, caracterizado por citometría de flujo (Figura 4A-B) e inmunocitoquímica (Figura 4C). Específicamente, ILC1 induce la expresión de la variante de empalme CD44 v6 en organoides, como lo demuestra RT-qPCR (Figura 4D).

Tabla 1: Composiciones de medios y búferes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Controles de un solo color. Composición de controles de un solo color para aislar la lámina propia del intestino delgado ILC1 utilizando la estrategia de gating definida en la Figura 2. Los detalles de los anticuerpos utilizados se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Fluorescencia menos una mezcla maestra (FMO). Composición de mastermixes FMO para cóctel Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO y NK1.1 FMO. Las mezclas maestras FMO contienen todos los anticuerpos utilizados excepto el anticuerpo de interés y se utilizan para teñir una alícuota de muestra. El cóctel de linaje se define como CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Los detalles de los anticuerpos utilizados se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Mastermix de tinción extracelular. Las concentraciones se ajustan para teñir hasta 5 x 106 células en 200 μL de tampón FACS. Los detalles de los anticuerpos utilizados se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 1: Organoides del intestino delgado murino. Imagen representativa de (A) organoides del intestino delgado generados con éxito 2-3 días después del paso y (B) cultivo fallido. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Estrategia de gating para aislar ILC1s de la lámina propia del intestino delgado de los ratones transgénicos roRγtGFP reporteros. Diagrama citométrico de flujo representativo del aislamiento de ILC1 de la lámina propia del intestino delgado de los ratones transgénicos roRγtGFP reporteros por FACS. Los ILC1 se definen como vivo, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ y NK1.1+. Representante de N = >50 ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cocultivos organoides e ILC1. Imágenes de campo brillante (A), imágenes de microscopía confocal (B) y gráficos FACS (C) de organoides del intestino delgado (SIO) cultivados solos (arriba) o con ILC1 (abajo) (representativos de experimentos con ILC1s de N = 3 ratones). (B) La tinción con CD45 ilustra las ILC1 y la proteína 1 de Zonula occludens (ZO-1) marca las células epiteliales en los organoides. Barras de escala: 50 μm. (C) Previamente cerradas en células individuales y vivas. La molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) marca las células epiteliales intestinales (IEC) en organoides y CD45 marca ILC1. La figura está adaptada de la referencia8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: ILC1s en co-cultivo con organoides del intestino delgado impulsan la regulación ascendente de CD44 en células epiteliales intestinales. (A) Una gráfica citométrica representativa de la expresión de CD44 en células epiteliales positivas de molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) (vivas, CD45-, EpCAM+) de organoides del intestino delgado (SIO) cultivados solos (izquierda) o con ILC1s durante 4 días (derecha). (B) Cuantificación del flujo de la expresión de CD44 en células epiteliales intestinales (IEC) (ILC1s de N = 5 ratones). (C) Imagen de microscopía confocal representativa de localización de CD44 en d4 SIO solo (izquierda) o cocultivada con ILC1s (derecha) (representativa de N = 3 ratones). Barras de escala: 50 μm. (D) RT-qPCR con cebadores específicos de exón para variantes de empalme CD44 v4 y v6 (N = 3). Esta cifra se adapta de la referencia8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses.