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Artículo de método

Establecimiento de un paro circulatorio hipotérmico profundo en ratas

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DOI:

10.3791/63571

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16 de diciembre de 2022

 , 
1Department of Cardiopulmonary Bypass, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, State Key Laboratory of Cardiovascular Medicine, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta el establecimiento de una parada circulatoria hipotérmica profunda en ratas, que puede aplicarse para investigar el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, lesión por isquemia/reperfusión, estrés oxidativo, neuroinflamación, etc.

Resumen

El paro circulatorio hipotérmico profundo (DHCA) se aplica rutinariamente durante las cirugías para la cardiopatía congénita compleja y la enfermedad del arco aórtico. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un método para establecer DHCA en ratas. Para evaluar el impacto del proceso DHCA en los signos vitales, se utilizó como control un modelo de rata de derivación cardiopulmonar (CEC) a temperatura normal sin paro circulatorio. Como era de esperar, DHCA condujo a una disminución significativa de la temperatura corporal y la presión arterial media. El análisis de gases en sangre indicó que el DHCA aumentó los niveles de ácido láctico, pero no influyó en el pH sanguíneo y las concentraciones de hemoglobina, hematocrito, Na+, Cl-, K+ y glucosa. Además, en comparación con las ratas CPB de temperatura normal, los resultados de la microscopía electrónica de transmisión mostraron un leve aumento de los autofagosomas del hipocampo en las ratas DHCA.

Introducción

El paro circulatorio hipotérmico profundo (DHCA) se ha utilizado en cirugía cardíaca desde 19531. DHCA implica reducir la temperatura central del paciente a niveles profundamente hipotérmicos (15-22 ° C) antes de interrumpir globalmente el flujo sanguíneo al cuerpo2. El paro circulatorio puede proporcionar un campo operativo relativamente incruento. La hipotermia profunda disminuye el metabolismo, especialmente en el cerebro y el miocardio, que es un método eficaz de protección contra la isquemia3. DHCA se aplica comúnmente durante cirugías para cardiopatías congénitas complejas, enfermedad del arco aórtico e incluso tumores renales o suprarrenales con trombo de vena cava 4,5. Por lo tanto, el establecimiento de modelos animales de DHCA proporciona una referencia importante para el refinamiento del procedimiento y la prevención de complicaciones en entornos clínicos.

Aunque se pueden establecer modelos con caninos6, conejos7 y otros animales, es preferible usar ratas debido a su operatividad y bajo costo. El modelo de rata DHCA fue descrito por primera vez en 2006 por Jungwirth et al.8. Se encontró que la duración del paro circulatorio tuvo un impacto en los resultados neurológicos. Desde entonces, los modelos de ratas DHCA se han investigado ampliamente. Se ha aclarado que la DHCA podría provocar el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)9. En estudios posteriores, los farmacólogos encontraron que la neuroinflamación relacionada con DHCA inducida por SIRS podría ser atenuada por resveratrol10 y triptolida11. Nuestro equipo también encontró que la neuroinflamación relacionada con DHCA podría atenuarse al inhibir la proteína de unión al ARN12 inducible por el frío. En el sistema cardiovascular, la superóxido dismutasa tiene un efecto cardioprotector sobre las lesiones por isquemia/reperfusión (I/R) durante la DHCA13. Estos resultados ampliaron la comprensión de los procesos fisiopatológicos relacionados con la DHCA y ofrecieron nuevas direcciones para mejorar los resultados de la DHCA. Sin embargo, los resultados con respecto a la endotoxemia, el estrés oxidativo y la autofagia después de DHCA no son concluyentes. La DHCA utiliza la misma tecnología operacional que el bypass cardiopulmonar (BPC)14, pero su estrategia de manejo es diferente, y los pasos para generar DHCA difieren entre varios equipos 8,9,10,11. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un método para establecer el procedimiento DHCA en ratas.

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Protocolo

Los protocolos se sometieron a una revisión institucional y recibieron la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, Hospital Fuwai, Academia China de Ciencias Médicas (FW-2021-0005). Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud.

NOTA: Las ratas macho Sprague-Dawley (peso: 500-600 g, edad: 12-14 semanas) se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio con libre acceso a alimentos y agua. Las ratas fueron asignadas aleatoriamente en dos grupos (n = 6, cada grupo): el grupo DHCA y el grupo CPB de temperatura normal (grupo NtCPB).

1. Trabajos preparatorios

  1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos (fórceps, tijeras, microfórceps, un electrocoagulador, una afeitadora, etc.) antes del experimento (Figura 1).
  2. Asegurar la disponibilidad de los consumibles, que incluyen seda 2-0, una cánula 16 G (catéter endotraqueal), una cánula 22 G, una cánula casera 16-G (catéter intravenoso multiorificio), jeringas de inyección, gasa y cinta.
    NOTA: Para la cánula casera de 16 G, use un bisturí para cortar dos o tres orificios de 2 mm de diámetro en la punta de la cánula, lo que ayudará a suavizar el drenaje venoso.
  3. Asegurar la disponibilidad de sevoflurano, lidocaína al 2%, solución salina, heparina (5 UI/ml, 250 UI/ml), epinefrina (40 μg/ml), norepinefrina (20 μg/ml), hidroxietil almidón y bicarbonato.
  4. Asegúrese de que los circuitos DHCA contengan un depósito (modificado del gotero de Murphy), una bomba de rodillos, un intercambiador de calor, un oxigenador de membrana, tubos de conexión y un tanque de agua (Figura 2). Conecte el circuito y mezcle 12 ml de hidroxietil almidón con 1 ml de heparina sódica (250 UI) y 1 ml de solución salina. Prepare el circuito con 14 ml de la solución de cebado con la bomba de rodillos girando suavemente (10-40 ml / min).
    NOTA: El reservorio se remodela a partir de un dispositivo de transfusión de sangre con gotero de Murphy. La parte de entrada venosa del gotero permanece a 10-15 cm, y la parte de salida venosa permanece a 10 cm.

2. Anestesia y canulación

  1. Anestesiar a las ratas con 2% -3% de sevoflurano, y luego probar la falta del reflejo conjuntival y la relajación muscular después de que la rata pierde el conocimiento.
    NOTA: El reflejo conjuntival se refiere al cierre instantáneo del párpado cada vez que se toca la córnea. Use un hisopo de algodón para tocar ligeramente la córnea. Cuando la profundidad de la anestesia es suficiente, los párpados no se cerrarán.
  2. Realizar intubación endotraqueal con una cánula de 16 G después de que el reflejo conjuntival desaparece y no se observa resistencia muscular. Conecte el tubo a un ventilador y ajuste los parámetros haciendo clic en los botones del ventilador (volumen corriente: 1.0-1.2 ml / 100 g, frecuencia cardíaca: 80 latidos por minuto [lpm], I: E = 1: 1, fracción de oxígeno inspirado: 60%).
  3. Coloque una manta térmica eléctrica debajo de la rata y fije la rata con cinta adhesiva. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad. Afeite el pelo en la región inguinal izquierda, la región cervical derecha y la cola con una afeitadora. Luego, desinfecte la piel tres veces con yodo y alcohol.
  4. Verifique la profundidad de la anestesia antes de pasar a los siguientes pasos. Si la frecuencia respiratoria es más alta que la establecida por el ventilador (80 lpm), o si hay rigidez muscular, aumente la concentración de salida de sevoflurano.
    NOTA: Cuando la profundidad de la anestesia es adecuada, el ritmo respiratorio debe sincronizarse con el ventilador y los músculos deben estar completamente relajados sin tensión. Verifique la profundidad de la anestesia cada 30 minutos para asegurarse de que la rata no experimente ningún retorno de la conciencia durante todo el procedimiento.
  5. Use un bisturí para cortar la piel en la región inguinal izquierda (aproximadamente 1 cm) y disecte suavemente el músculo y el tejido para exponer la vena femoral izquierda y la arteria. Separe la arteria cuidadosamente.
  6. Canular un catéter intravenoso de 22 G en la arteria femoral izquierda. Ligate la arteria y el catéter con una seda 2-0 (en la región de la canulación ). Use heparina que contenga solución salina (5 UI/ml) para enjuagar la cánula y evitar la coagulación. Conecte el catéter con el sensor de presión para controlar la presión arterial.
  7. Corte la piel de la cola (aproximadamente 1,5 cm) y luego use un bisturí para cortar la fascia superficial de la arteria de la cola para exponer la arteria de la cola, que se encuentra en el medio del campo quirúrgico.
  8. Canular la arteria de la cola con un catéter intravenoso de 22 G. Ligate la arteria y el catéter con una seda 2-0 (en la región de la canulación ). Use heparina que contenga solución salina (5 UI/ml) para enjuagar el catéter y evitar la coagulación.
    NOTA: Al canular el catéter intravenoso, la mano izquierda sostiene la arteria/vena con fórceps, y la mano derecha perfora la arteria/vena con la aguja dentro del catéter y luego coloca la cánula en la arteria.
  9. Corte la piel de la vena yugular derecha (aproximadamente 2 cm) y luego separe el músculo y el tejido para exponer la vena. Inserte un catéter intravenoso multiorificio casero de 16 G en la vena yugular externa derecha y colóquelo cuidadosamente en la vena cava inferior derecha o en la aurícula derecha.
    NOTA: La vena femoral izquierda y la arteria están debajo de la superficie de la región inguinal izquierda. La vena es más gruesa que la arteria, y el color de la sangre de las arterias es rojo brillante. La vena yugular derecha está en el medio de la región cervical derecha; Cuando se corta la piel y se separan los músculos, se puede ver la vena (aproximadamente 0.3-0.4 cm de ancho). Cuando la punta del catéter toca la aurícula derecha, la onda de presión arterial fluctuará. Luego, después de tirar un poco del catéter hacia atrás, la punta del catéter estará en la vena cava superior.
  10. Administrar heparina sódica (500 UI/kg) por vía externa derecha. Cubra cada región canulada con una gasa húmeda para evitar la contaminación.
    NOTA: Coloque una caja debajo de la mesa de operaciones para elevarla unos 40 cm.

3. Inicio de DHCA

  1. Conecte primero el circuito DHCA con el catéter en la arteria de la cola y mantenga el caudal de la bomba a 1-2 ml / min. Luego, conecte el reservorio con el catéter en la vena yugular externa derecha. Asegúrese de que siempre haya un nivel sanguíneo de aproximadamente 1 cm en el reservorio.
  2. Encienda el tanque de agua y ajuste primero la temperatura del agua a 37 ° C.
  3. Después de que la presión arterial esté estable, aumente suavemente el flujo de la bomba hasta 80-100 ml / kg / min para bombear la sangre.

4. Enfriamiento

  1. Ajuste la temperatura ambiente a unos 20 °C. Coloque cubitos de hielo en guantes desechables y luego colóquelos en la cabeza y los lados de la rata. Ajuste la temperatura del tanque en tiempo real de acuerdo con la temperatura rectal de las ratas.
  2. Recoja 0.1 ml de sangre de la arteria femoral izquierda y colóquela en la máquina de gases en sangre para el análisis de gases en sangre. Cambie los parámetros relevantes del ventilador adecuadamente de acuerdo con los resultados del análisis de gases en sangre (por ejemplo, PaCO2).
    NOTA: La frecuencia cardíaca y la presión arterial pueden cambiar, y la tasa de flujo de la bomba debe ajustarse en consecuencia. El gradiente de temperatura entre el tanque de agua y la rata debe ser inferior a 10 ° C. Asegúrese de que la temperatura se puede reducir a 15-20 ° C en 30 minutos. El rango normal de PaCO2 es de 35-45 mmHg. Si los resultados de gases en sangre muestran un PaCO2 más bajo, se puede disminuir el volumen corriente y viceversa.

5. Paro circulatorio hipotérmico profundo

  1. Cuando la temperatura rectal descienda a 15-20 °C, cambie los guantes desechables (que contienen hielo) para asegurar el mantenimiento de la hipotermia profunda durante el paro circulatorio.
  2. Detenga la bomba de rodillos, mantenga el depósito en contacto con el medio ambiente y drene la sangre lentamente desde la vena yugular externa hasta el depósito.
  3. Preste atención a la forma de onda de la presión arterial. Cuando la presión arterial y la frecuencia cardíaca sean 0, detenga el drenaje y mantenga el reservorio cerrado. Apague el ventilador.
    NOTA: La duración del paro circulatorio varía según el propósito del experimento.

6. Calentamiento y reperfusión

  1. Quítese todos los guantes desechables y aumente la temperatura ambiente a 25 °C. Restablezca la ventilación del oxigenador de membrana mientras mantiene el clipaje del tubo de drenaje venoso. Encienda la bomba de rodillos para asegurarse de que la sangre en el depósito regrese lentamente al cuerpo de la rata.
  2. Encienda el ventilador. Una vez que el nivel de sangre en el reservorio permanezca en 1 cm, afloje el tubo de drenaje y drene la sangre de la aurícula derecha al reservorio lentamente.
  3. Encienda la lámpara de calefacción, la almohadilla térmica y el tanque de agua. Ajuste la temperatura del tanque de agua a 25 ° C en primer lugar, y luego ajuste su temperatura de salida de manera oportuna de acuerdo con la temperatura rectal de la rata.
    NOTA: La lámpara de calentamiento debe dirigirse a los vasos sanguíneos grandes en la cavidad torácica de la rata, y debe mantenerse a cierta distancia para evitar quemar los tejidos. Preste atención a la diferencia de temperatura entre la temperatura de salida y la temperatura rectal de la rata (<10 °C). Si es necesario, pruebe la gasometría sanguínea y luego ajuste los parámetros del ventilador en consecuencia, y administre bicarbonato, electrolitos, etc.
  4. Retire la lámpara de calefacción después de que la temperatura rectal vuelva a 34 °C.
    NOTA: Este paso, como continuación del proceso de recalentamiento rápido, debe ser lento. En esta etapa, los parámetros del equipo del vaporizador de sevoflurano, el ventilador mecánico y la bomba de rodillos se pueden restaurar a los niveles al comienzo del CPB.

7. Destete del CPB

  1. Reduzca lenta y gradualmente el caudal de la bomba de rodillos y ajuste la velocidad de drenaje venoso hasta que el caudal se reduzca a 1 ml / min.
    NOTA: Cada ajuste del caudal debe observarse durante 3-5 min.
  2. Mantenga el depósito en contacto con el medio ambiente (quitando la tapa del depósito). Infundir la sangre restante en el circuito con un caudal de 1 ml/min.
  3. Detenga la oxigenación por membrana y la bomba de rodillos.
  4. Eutanasia a la rata después de un período de ventilación mecánica bajo anestesia profunda.
    NOTA: Este es un procedimiento terminal. La duración entre el destete del CEC y la eutanasia varía según los diferentes protocolos de estudio. Recuerde desinfectar las heridas con yodo y alcohol y luego cubrir cada región canulada con una gasa húmeda para evitar la contaminación antes de la eutanasia. Aumentar la concentración de salida de sevoflurano para aumentar la profundidad de la anestesia.

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Resultados

Como grupo control, las ratas CPB de temperatura normal (NtCPB) sin paro circulatorio mostraron una presión arterial media (PAM) y temperatura corporal estables durante todo el procedimiento, mientras que la PAM de las ratas DHCA disminuyó durante el paro cardíaco (p < 0,01, Figura 3A). La temperatura de las ratas DHCA disminuyó rápidamente durante la fase de enfriamiento y se recuperó gradualmente durante la fase de recalentamiento. Al destetar a las ratas de los circuitos de DH...

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Discusión

La canulación es el procedimiento más fundamental para establecer DHCA en ratas. Antes de la canulación , remojar la arteria con 0,5 ml de lidocaína al 2% facilitará la canulación de la lobra. Después de la canulación es necesaria la heparinización con 500 UI/kg de heparina vía vena yugular externa para evitar la formación de microtrombos17. Hemos encontrado repetidamente que esta dosis de heparina puede lograr el objetivo de un tiempo de coagulación activado (ACT) >480 s. El período de r...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Liang Zhang por ayudar a recopilar los datos de video durante el experimento. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de subvención: 82070479) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (número de subvención: 3332022128).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Intercambiadorde calor Xi' un Xijing Medical Appliance Co., LtdAnimal-M
Oxigenador de membranaDongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd.Monitor Micro-M
Chengdu Techman Co., LtdBL-420S
Bomba de rodilloChangzhou Prefluid Technology Co., LtdBL100
SD RatHFK Bioscience Co., Ltd./
SevofluranoMaruishi Pharmaceutical Co., LtdH20150020
AfeitadoraHangzhou Huayuan Pet Products Co., Ltd./
VaporizadorSPACECABS/
VentiladorShanghai Alcott Biotech Co., LtdALC-V8S Tanque de
aguaMaquet Critical Care ABJostra HCU20-600

Referencias

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