Investigación de la patogénesis de la mutación MYH7 Gly823Glu en la miocardiopatía hipertrófica familiar utilizando un modelo de ratón

La miocardiopatía hipertrófica (HCM, OMIM: 613690) es la miocardiopatía más frecuente en China, con una incidencia estimada del 0,2%, afectando a 150.000 personas ^1,2.

La característica anatómica patológica que caracteriza a la MCH es la hipertrofia ventricular asimétrica, que a menudo involucra el tracto de salida ventricular y/o el tabique interventricular³. La manifestación clínica es disnea de esfuerzo, fatiga y dolor torácico. El fenotipo individual de HCM tiene una variabilidad que va desde clínicamente insidiosa hasta insuficiencia cardíaca grave. Los pacientes con MCH requieren tratamiento médico, trasplante cardíaco, equipo de soporte vital y seguimiento multidisciplinario⁴.

En el siglo pasado, la tecnología de PCR ha cambiado la forma en que estudiamos el ADN⁵. Un método de secuenciación de ADN para el diagnóstico clínico fue descubierto por Sanger y colegas⁶. La técnica de Sanger se aplicó posteriormente al Proyecto Genoma Humano, pero este enfoque era costoso y consumía mucho tiempo⁷. El advenimiento de la secuenciación del genoma completo (WGS) llevó los conocimientos sobre la enfermedad genética humana a nuevas alturas, pero siguió siendo prohibitivo en términos de costo. La tecnología de secuenciación del exoma completo (WES) se ha utilizado durante mucho tiempo para detectar variantes de la línea germinal⁸ y ha tenido éxito en la identificación de mutaciones conductoras somáticas en el exoma de varios cánceres⁹. La detección de exones de ADN o regiones codificantes por WES se puede utilizar para revelar variantes patogénicas en la mayoría de las enfermedades mendelianas. Hoy en día, con la disminución del costo de la secuenciación, se espera que WGS se convierta en una herramienta importante en la investigación genómica y pueda ser ampliamente utilizada en la detección de variantes patogénicas en el genoma.

La tecnología WES también se ha utilizado en la miocardiopatía hereditaria para identificar variantes patogénicas para dilucidar aún más la etiología. La evidencia emergente ha implicado que los genes que codifican mutaciones genéticas de proteínas estructurales del sarcómero, como MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3¹⁴, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 y^{TPM1 18} son responsables de la etiología genética de HCM. El conocimiento de variantes patogénicas en genes causantes de enfermedades raras (por ejemplo, oscurana, calmodulina citoesquelética y RhoGEF QUE INTERACTÚAN CON LA TITINA (OBSCN, OMIM: 608616)¹⁹, alfa de acción 2 (ACTN2, OMIM: 102573)²⁰, y cisteína y proteína rica en glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)²¹) también se ha asociado con HCM. Los estudios genéticos actuales han identificado múltiples variantes patogénicas distintas en el gen de la proteína sarcomérica en aproximadamente el 40% -60% de los pacientes con HCM, y las pruebas genéticas en pacientes con HCM revelaron que la mayoría de las variantes patogénicas ocurren en la cadena pesada de miosina (MYH7) y la proteína C de unión a miosina (MYBPC3). Sin embargo, la base genética de la HCM sigue siendo difícil de alcanzar. Explorar la patogenicidad de estas variaciones que subyacen a los pacientes humanos con HCM sigue siendo un desafío importante²².

En este estudio, informamos una variante patogénica en MYH7 en una familia Han china con HCM por WES. Para verificar la patogenicidad de esta variante, establecimos un ratón knockin C57BL / 6N-Myh7^{em1 (G823E)} utilizando el sistema CRISPR / Cas9. También discutimos mecanismos plausibles de esta variante.

Las historias de las familias se obtuvieron entrevistando a los miembros de la familia. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Provincial de Medicina China de Guangdong (Nº 2019074). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los miembros de la familia. Todos los animales son tratados de acuerdo con las directrices éticas del Hospital Provincial de Medicina China de Guangdong (Guangzhou, China).

1. Sujetos de estudio

NOTA: El probando III-3 buscó consejo médico en el Departamento de Cirugía Cardiovascular del Hospital Provincial de Medicina China de Guangdong en julio de 2019.

1. Obtenga un historial médico familiar detallado del probando. Notifique y llame a todos los miembros de la familia del proband. Todos los miembros de la familia han sido sometidos a exámenes físicos meticulosos.
   1. Realizar una revisión sistemática de todos los datos clínicos, incluidos los registros médicos, ECG, ecocardiogramas e informes de cateterismo cardíaco.
   2. Reconfirmar fenotipos cardíacos en todos los pacientes durante la intervención o cirugía.
2. Seleccione un total de 174 controles saludables basados en la población de la base de datos local. Recolectar aproximadamente 4.0 mL de sangre venosa periférica de cada paciente.

2. Extracción de ADN

NOTA: El ADN se extrae con un kit de sangre comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1. Lise las células sanguíneas con un detergente aniónico en presencia de un estabilizador de ADN siguiendo el protocolo del fabricante.
2. Agregue 10 μL de solución de RNasa A al lisado celular y mezcle invirtiendo el tubo 25 veces. Incubar a 37 °C durante 15 min a 1 h.
3. Eliminar las proteínas por precipitación de sal. Use solución de precipitación de proteínas (0,25 mg de albúmina sérica bovina disuelta en 25 ml de agua destilada) y 100% de isopropanol para precipitar proteínas. Luego, use 200 μL de etanol al 70% y realice la centrifugación a 12,000 x g / min a 4 ° C durante 15 minutos para lavar el pellet de ADN.
4. Recuperar el ADN genómico por precipitación con 500 μL de etanol al 70%. Centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Aspirar y luego disolver el pellet en solución de hidratación (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
5. Utilice un espectrofotómetro (por ejemplo, NanoDrop 2000) para determinar la pureza. El ADN purificado típicamente tiene una relación A260 / A280 entre 1.7 y 1.9 y tiene un tamaño de hasta 200 kb.
6. Almacene el ADN a largo plazo a 2-8, -20 o -80 °C.

3. Secuenciación completa del exoma y análisis de variantes

NOTA: Para buscar sistemáticamente mutaciones genéticas causantes de enfermedades, se realizó la secuenciación del exoma en individuos afectados (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 y IV-3) e individuos no afectados (III-2, III-5, IV-4).

1. Utilice la sonda del exoma de acuerdo con las instrucciones del fabricante para realizar la captura del exoma.
2. Aplique las bibliotecas calificadas a la secuenciación de extremo emparejado de 2 × 150 pb en la plataforma HiSeq X-ten. Consulte el archivo complementario 1.
3. Alinee los archivos FASTQ con el genoma de referencia humano (hg19/GRCh37) con BWA v0.7.1318,19. Ordene los archivos alineados (archivos en formato sam/bam) con samtools y, a continuación, marque los duplicados con Picard. Consulte el archivo complementario 1.
4. Utilice GATK, realinear lecturas localmente y recalibrar las cualidades base. Consulte el archivo complementario 1.
5. Genere estadísticas de mapeo que incluyan cobertura y profundidad de archivos recalibrados por BEDTools y scripts internos de perl/python.
6. Variantes de genotipo (SNV e indels) a partir de archivos BAM recalibrados utilizando el modo de procesamiento multimuestra de la herramienta HaplotypeCaller de GATK.
7. Utilice VQSR (recalibración de puntuación de calidad variante) para reducir los falsos positivos de las llamadas variantes.
8. Anote SNV e indeles utilizando el software ANNOVAR21 en múltiples bases de datos, incluyendo el Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), el Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) y 1,000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretar la patogenicidad de las variantes de secuencia de acuerdo con las directrices del ACMG.

4. Secuenciación de Sanger

1. Realizar la secuenciación de Sanger para confirmar posibles variantes causales y determinar la segregación de variantes en la familia utilizando un secuenciador ABI 3500²³.
2. Diseñe secuencias de cebadores para la variante en el gen MYH7 (NM_000257) de la siguiente manera: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' y 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
3. Confirme una variante, examine a todos los miembros de la familia disponibles para determinar la segregación de variantes dentro de la familia²³.

5. Generación de ratones knockin C57BL / 6N-MYH7^{em1 (G823E)}

1. Utilice el sistema CRISPR/Cas9 para generar ratones knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E). El gen Myh7 del ratón (número de acceso de GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) se encuentra en el cromosoma 14 del ratón y tiene 41 exones. El codón de inicio ATG en el exón 4 y el codón de parada TAG en el exón 41, y el G823E se encuentra en el exón 23. Seleccione el exón 23 como sitio de destino.
2. Diseñar la secuencia del vector objetivo de ARNg y el oligo donante (con secuencia de diana, flanqueada por secuencias homólogas de 134 pb combinadas en ambos lados).
   1. Inicie sesión en el sitio web de NCBI y haga clic en la función de diseño de imprimación en línea BLAST a la derecha.
   2. Haga clic en la función Primer-BLAST en la parte inferior de la página para diseñar imprimaciones.
   3. Pegue el número de secuencia de referencia NCBI MYH7 NM_000257.4 en el cuadro de plantilla de PCR.
   4. Amplíe el fragmento objetivo (MYH7 cDNA exon 23 y sus exones adyacentes) así que diseñe el cebador aguas arriba en el exón 21 (2392-2528) y el cebador aguas abajo en el exón 25 (3205-3350). Introduzca el número de exón de los cebadores ascendentes y descendentes en el cuadro de rango derecho.
   5. Haga clic en el botón Obtener cebadores en la parte inferior para generar automáticamente varios pares de cebadores .
3. Ingrese el gen MYH7 en la base de datos ZFIN, introduzca el sitio de mutación p.g823e (GGG a GAG) en el oligonucleótido del donante y la mutación silenciosa p.r819 (AGG a CGA) en el exón 23. La mutación silenciosa impide la unión y el recorte de la secuencia por el ARNg después de la reparación dirigida por homología.
   1. Diseñe el ARNg de acuerdo con la secuencia general, las secuencias en ambos extremos son TAATACGACTCACTATA- y -GTTTTAGAGCTA. El centro de la secuencia es el sitio de destino mencionado anteriormente.
4. Co-inyectar ARNm Cas9, ARNg generado por transcripción in vitro y oligo donante en óvulos fertilizados para la producción de ratones KI.
   1. Utilice el kit de detección de eficiencia del objetivo Cas9/gRNA para transcribir el objetivo de gRNA diseñado en gRNA in vitro y detectar la actividad de la transcripción (consulte las instrucciones del kit VK007 para conocer los métodos de detección específicos) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   2. Descongele los componentes del kit de ARNm ARCA T7, mezcle y gire el pulso en un microfugio para recolectar soluciones en el fondo de los tubos. Ensamble la reacción a temperatura ambiente en el siguiente orden: 2x mezcla ARCA/NTP a 10 μL, 1 μg de ADN moldeador, 2 μL de mezcla de ARN polimerasa T7 y agua libre de nucleasa a 20 μL.
   3. Mezclar bien y pulsar-girar en una microfuga. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   4. Eliminar el ADN plantilla añadiendo 2 μL de DNasa I, mezclar bien e incubar a 37 °C durante 15 min para obtener ARNm.
   5. Realizar la inyección intraperitoneal de gonadotropina sérica y gonadotropina coriónica humana en ratones hembra C57BL/6 preparados previamente a las 4 semanas de edad con una jeringa de 0,5 ml a una dosis de aproximadamente 5 U por ratón con un intervalo entre las dos inyecciones de 48 h.
   6. Dieciocho horas después de la dosificación, sacrifique ratones hembra C57BL / 6 y un ratón macho C57BL / 6 de 8-12 semanas de edad por dislocación cervical después de la inyección de hormonas. Recoja los óvulos y los espermatozoides por separado.
   7. El espermatozoide está capacitado en el líquido de capacitación. Tome y deje caer los espermatozoides en el borde del líquido en los óvulos de corta duración para la fertilización in vitro durante 3-4 h.
   8. Diluir el ARNg transcrito con éxito y el ARNm Cas9 in vitro con agua libre de RNasa a 25 ng/μL y 50 ng/μL. Introducir en el citoplasma de óvulos fertilizados de ratón mediante microinyección. Trasplantar huevos fertilizados en buenas condiciones en el oviducto agrandado de los ratones hembra. Co-jaula con ratones machos ligados.
5. Genotipar a los cachorros por PCR. Utilice las siguientes condiciones de PCR: 94 °C durante 3 min, 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 35 s y 72 °C durante 35 s; 72 °C durante 5 min. Siga con el análisis de secuencia.
   1. Cortar las colas de ratones de 4 meses de edad con tijeras y colocarlas en un tubo de EP de 1,5 ml. Añadir 180 μL de tampón GL, 20 μL de proteinasa K y 10 μL de RNasa A por pieza de cola (2-5 mm) en un tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no cortar demasiada cola.
   2. Incubar el tubo a 56 °C durante la noche.
   3. Girar en un tubo de microcentrífuga a 1.000 x g durante 2 min para eliminar las impurezas.
   4. Añadir 200 μL de tampón GB y 200 μL de alcohol etílico absoluto con suficiente mezcla.
   5. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección. Aplicar la muestra al centrifugador y centrifugar a 1.000 x g durante 2 min. Deseche el flujo continuo.
   6. Añadir 500 μL de tampón WA a la columna de centrifugado y centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
   7. Añadir 700 μL de tampón WB a la columna de centrifugado y centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
      NOTA: Asegúrese de que el Buffer WB haya sido premezclado con etanol 100%. Al agregar Buffer WB, agréguelo a la pared del tubo para lavar la sal residual.
   8. Repita el paso 5.5.7.
   9. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección y centrifugar a 1.000 x g durante 2 min.
   10. Coloque la columna de centrifugado en un tubo nuevo de 1,5 ml. Agregue 50-200 μL de agua esterilizada o tampón de elución al centro de la membrana de la columna y deje reposar la columna durante 5 minutos.
       NOTA: Calentar agua esterilizada o tampón de elución hasta 65 °C puede aumentar el rendimiento de la elución.
   11. Para eluyir el ADN, centrifugar la columna a 1.000 x g durante 2 min. Para aumentar el rendimiento de ADN, agregue el flujo continuo y / o 50-200 μL de agua esterilizada o tampón de elución al centro de la membrana de la columna de centrifugado y deje reposar la columna durante 5 minutos. Centrifugar a 1.000 x g durante 2 min.
   12. Cuantificar el ADN genómico eluyido mediante electroforesis.

6. Evaluación de la morfología y función cardíaca

NOTA: Aplique la ecocardiografía en modo M para evaluar la morfología cardíaca y la función de los ratones knockin C57BL/6N-Myh7^{em1 (G823E).}

1. Coloque los ratones knockin en una caja de acrílico cerrada conectada a la máquina de anestesia y ajuste la interfaz de tres vías para permitir que el isoflurano (concentración: 3%) fluya hacia la caja de acrílico. Después de que los ratones knockin dejen de moverse de forma autónoma, retire los ratones knockin.
2. Coloque los ratones knockin planos en la plataforma de monitoreo de vida de la máquina de anestesia para animales pequeños, y la anestesia por inhalación continua mezclada con oxígeno (flujo: 0.8 L / min) e isoflurano (concentración: 3%). Aplique lubricante ocular a los ratones anestesiados para evitar el secado de la córnea.
3. Fije los ratones knockin horizontalmente en la plataforma. Incline la plataforma 30° caudal hacia el ratón knockin. Elimine el vello de la pared torácica anterior del ratón golpeador con una crema depilatoria.
4. Coloque la sonda verticalmente con la protuberancia hacia la cabeza del animal. Luego, gire la sonda en sentido contrario a las agujas del reloj, aproximadamente 45°.
5. En la vista paraesternal de eje largo, gire la sonda 90° en el sentido de las agujas del reloj para observar la vista paraesternal de eje corto. Después de girar la sonda 90°, ajuste el desplazamiento del eje y para obtener el corte correcto.
6. Observe la imagen de eje largo del corazón (Figura 1C) y, a continuación, seleccione los datos de medición en modo M.
7. Adquirir datos de ultrasonido de vistas paraesternales de eje largo de ratones (Figura 1). Se miden la frecuencia cardíaca (FC), la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI), el gasto cardíaco (CO), la dimensión diastólica final del ventrículo izquierdo (DCV), la dimensión sistólica final del ventrículo izquierdo (DSVI), el tabique interventricular (IVS) y la pared posterior del ventrículo izquierdo (PCV).
8. Después de la medición, proporcione oxígeno a los ratones y colóquelos nuevamente en sus respectivas jaulas cuando recuperen la actividad autónoma.

Perfil clínico de las familias
Se obtuvieron los pedigríes familiares de HCM y se muestran en la Figura 2. Todos los miembros de la familia documentados fueron diagnosticados con HCM en el momento de la inscripción.

En la familia (Figura 2A), el probando fue el paciente III-7, que fue diagnosticado con MCH y obstrucción del tracto de salida del ventrículo izquierdo (LVOTO) a los 46 años y sometido a cirugía cardíaca. El paciente III-3 tenía MCH menor que no requirió tratamiento quirúrgico. El paciente IV-3 también tenía HCM menor, que era similar a su padre, el paciente III-3. El paciente II-5 tenía HCM y se sometió a cirugía para reparar el defecto a la edad de 51 años debido a LVOTO. El paciente I-1 y el paciente II-2 murieron debido a accidentes cardíacos a los 57 y 46 años de edad, respectivamente. El historial médico del paciente I-1 no estaba disponible. El paciente II-7 y el paciente III-9 presentaron dificultad para respirar y fueron diagnosticados con MCH.

Análisis de secuencias de exoma y segregación de variantes
En esta familia, la secuenciación del exoma de los cinco individuos generó una media de un total de 19.978.731 pares de lecturas secuenciadas con una longitud de lectura promedio de 125 pb. En total, el 98,72% de las lecturas secuenciadas pasaron la evaluación de calidad y se asignaron al 98,66% del genoma humano de referencia. Incluso después del filtrado, más de 42 variantes (incluidas sustituciones de nucleótidos únicos e indeles) fueron compartidas por estos cuatro pacientes. De estos, 27 eran SNV sin sentido, 15 se predijo que alterarían el empalme. Finalmente, de acuerdo con las pautas de calificación de ACMG, un c.G2468A heterocigótico; Se observó la variante p.G823E de MYH7 (NM_0002571) en la probando III-7, así como en los otros tres pacientes.

Identificación de una mutación patogénica
La secuenciación de Sanger confirmó la misma variante de MYH7 p.G823E en todos los pacientes, pero no en los individuos sanos de las familias y 174 controles (Figura 2B). El heterocigoto MYH7 p.G823E completamente co-segregado en esta familia. En esta familia, los pacientes IV-3 que albergaban esta variante la heredaron del paciente III-3. Los pacientes III-7 y III-8 portaban la misma variante, que fue heredada de su padre. La información para el paciente III-9 no estaba disponible.

Esta variante, previamente descrita en HCM por un paciente esporádico24, no ha sido reportada en las bases de datos 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar o sujetos control. El residuo de glicina en el codón 823 en la región del dominio del cuello de MYH7 está altamente conservado en todas las secuencias de miosina de vertebrados disponibles (Figura 2C). MYH7 es un gen conocido causante de HCM y desempeña un papel importante en el desarrollo cardíaco o la estructura/función. Según los estándares y directrices de ACMG, se predijo que la variante MYH7 p.G823E sería una variante patogénica (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Tomados en conjunto, estos resultados apoyan que esta variante es perjudicial y contribuye a la patogénesis de HCM en estas familias.

Los ratones knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) desarrollaron hipertrofia cardíaca severa
Para verificar aún más la patogénesis de MYH7 p.G823E, generamos ratones knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E). Los ratones knockin C57BL/6N-MYH7em1(G823E) desarrollaron una hipertrofia cardíaca dependiente de la edad después del nacimiento (Figura 2A, B). La ecocardiografía reveló que IVS y LVPW se desarrollaron con aumento de la FC en ratones knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) (Tabla 1). Estos resultados también fueron validados por análisis histológico (Figura 3). No hubo diferencias obvias en LVDd, LVDs, EF o CO entre ratones de tipo salvaje y heterocigotos (Tabla 1).

Figura 1: Adquisición de datos de ultrasonido . (A) La sonda está ubicada en el eje largo del esternón. (B) La sonda está ubicada en el eje corto del esternón. (C) Imagen de ultrasonido en modo M de la vista de eje largo del esternón. La flecha amarilla indica la ubicación del tabique interventricular. La flecha roja indica la válvula flotante. (D) Imagen de ultrasonido en modo M de la vista de eje corto del esternón. La flecha amarilla indica la ubicación del músculo papilar anterior, y la protuberancia debajo es el músculo papilar posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La gran familia portadora de la variante heterocigótica MYH7 G823E . (A) El probando está marcado por una flecha. Los círculos y cuadrados completos y abiertos indican individuos afectados y normales, respectivamente. (B) La variante G823E en MYH7 confirmada por secuenciación de Sanger. (C) Conservación del sitio MYH7 G823E en diferentes especies. La flecha amarilla representa el sitio de G823E en la secuencia de aminoácidos de diferentes especies, que está altamente conservada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cambios patológicos del tejido miocárdico . (A) Las fibras miocárdicas están dispuestas de manera ordenada, y no hay diferencia significativa entre cada parte. (B) La hipertrofia de la fibra muscular ventricular, la disposición desordenada y las lesiones se concentran principalmente en la pared posterior del ventrículo izquierdo y el tabique interventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Análisis morfológico y funcional para p.G823E y tipo salvaje. Los datos fueron analizados mediante SPSS. Las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar (DE). La t de Student o la suma de rangos de Wilcoxon prueban variables continuas. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Archivo complementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros que declarar.