Basándonos en la familia de miocardiopatía hereditaria familiar encontrada en nuestro trabajo clínico, creamos un modelo de ratón C57BL / 6N con una mutación puntual (G823E) en el locus MYH7 del ratón a través de la ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9 para verificar esta mutación.
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Artículo de método
Investigación de la patogénesis de la mutación MYH7 Gly823Glu en la miocardiopatía hipertrófica familiar utilizando un modelo de ratón
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Resumen
Resumen
La miocardiopatía hipertrófica familiar (HCM, OMIM: 613690) es la miocardiopatía más común en China. Sin embargo, la etiología genética subyacente de la MCH sigue siendo difícil de alcanzar.
Previamente identificamos una variante heterocigota del gen de la cadena pesada de miosina 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), en una gran familia china Han con MCH. En esta familia, la variante G823E cosegrega con un trastorno autosómico dominante. Esta variante se localiza en el dominio del brazo de palanca de la región del cuello de la proteína MYH7 y está altamente conservada entre las miosinas y especies homólogas. Para verificar la patogenicidad de la variante G823E, producimos un modelo de ratón C57BL / 6N con una mutación puntual (G823E) en el locus MYH7 del ratón con ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9. Diseñamos vectores dirigidos a ARNg y oligonucleótidos donantes (con secuencias dirigidas flanqueadas por 134 pb de homología). El sitio p.G823E (GGG a GAG) en el oligonucleótido del donante se introdujo en el exón 23 de MYH7 mediante reparación dirigida por homología. También se insertó un p.R819 silenciado (AGG a CGA) para evitar la unión del ARNg y la re-escisión de la secuencia después de la reparación dirigida por homología. La ecocardiografía reveló hipertrofia de la pared posterior del ventrículo izquierdo (BPN) con sístole en ratones MYH7 G823E/- a los 2 meses de edad. Estos resultados también fueron validados por análisis histológico (Figura 3).
Estos resultados demuestran que la variante G823E juega un papel importante en la patogénesis de la MCH. Nuestros hallazgos enriquecen el espectro de variantes de MYH7 relacionadas con la MCH familiar y pueden proporcionar orientación para el asesoramiento genético y el diagnóstico prenatal en esta familia china.
Introducción
La miocardiopatía hipertrófica (HCM, OMIM: 613690) es la miocardiopatía más frecuente en China, con una incidencia estimada del 0,2%, afectando a 150.000 personas 1,2.
La característica anatómica patológica que caracteriza a la MCH es la hipertrofia ventricular asimétrica, que a menudo involucra el tracto de salida ventricular y/o el tabique interventricular3. La manifestación clínica es disnea de esfuerzo, fatiga y dolor torácico. El fenotipo individual de HCM tiene una variabilidad que va desde clínicamente insidiosa hasta insuficiencia cardíaca grave. Los ....
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Protocolo
Las historias de las familias se obtuvieron entrevistando a los miembros de la familia. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Provincial de Medicina China de Guangdong (Nº 2019074). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los miembros de la familia. Todos los animales son tratados de acuerdo con las directrices éticas del Hospital Provincial de Medicina China de Guangdong (Guangzhou, China).
1. Sujetos de estudio
NOTA: El probando III-3 buscó consejo médico en el Departamento de Cirugía Cardiovascular del Hospital Provincial de Medicina China de Guangdong en....
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Resultados
Perfil clínico de las familias
Se obtuvieron los pedigríes familiares de HCM y se muestran en la Figura 2. Todos los miembros de la familia documentados fueron diagnosticados con HCM en el momento de la inscripción.
En la familia (Figura 2A), el probando fue el paciente III-7, que fue diagnosticado con MCH y obstrucción del tracto de salida del ventrículo izquierdo (LVOTO) a los 46 años y sometido a cirugía cardíaca. El paciente II.......
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Discusión
En este estudio, describimos una familia china Han con HCM. El análisis genético reveló que una mutación heterocigótica en MYH6 p.G823E co-segrega con la enfermedad en miembros de la familia con herencia autosómica dominante. Para validar la patogenicidad de la mutación G823E y discutir los mecanismos subyacentes, creamos un modelo de ratón C57BL / 6N con G823E en el locus Myh7 del ratón mediante ingeniería genómica mediada por CRISPR / Cas9.
Las características fenotípicas de los ratones knoc.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el proyecto del Fondo de Investigación Médica de la provincia de Guangdong (A2022363) y el proyecto principal del Comité de Ciencia y Tecnología de Guangdong, China (subvención no.2022).
Nos gustaría agradecer a Qingjian Chen de la Universidad de Maryland, College Park por la ayuda durante la preparación de este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.5 veces; TBE | Shanghái Sangon | ||
| 2&veces; Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| para animales pequeños | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| digestión in vitro para detectar el kit de eficiencia de objetivos de ARNg | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| Marcador de ADN | Thermo Fisher Scientific Estabilizador | ||
| de ADN | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | previene la degradación del ADN |
| Microtomo de parafina eléctrica | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene | Santa Clara | ||
| Portaobjetos de vidrio, cubreobjetos | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Solución de tinción de hematoxilina, solución de tinción de eosina | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten plataforma | Illumina | realizar la secuenciación en las bibliotecas capturadas | |
| Inyección de gonadotropina coriónica | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Inyección de gonadotropina sérica de yegua preñada | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurano | Proveedores | anestesia inhalatoria | |
| Microscopio de microinyección | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Máquina de inclusión de parafina | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinasa K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Secuenciador | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Microscopio estereoscópico | Nikon SMZ745T | ||
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | sonda de exoma | |
| T7 ARCA mRNA Kit Nueva | Inglaterra BioLabs, Inc. | NEB-E2065S Caja de | |
| temperatura | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Solución de clorhidrato | Sigma, Merck KGaA | Nº T2663 | |
| Ecógrafo veterinario | Royal Philips | CX50 |
Referencias
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al.
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Reimpresiones y permisos
