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Research Article
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En este trabajo, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para estudiar la poroelasticidad de los geles de actomiosina en condiciones controladas. Se cuantifica la dinámica del gel de actomiosina y el disolvente incrustado, a través de la cual se demuestra la porosidad de la red. También discutimos los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.
Las células pueden cambiar activamente sus formas y volverse móviles, una propiedad que depende de su capacidad para reorganizar activamente su estructura interna. Esta característica se atribuye a las propiedades mecánicas y dinámicas del citoesqueleto celular, en particular, el citoesqueleto de actomiosina, que es un gel activo de filamentos de actina polar, motores de miosina y proteínas accesorias que exhiben propiedades de contracción intrínsecas. La opinión generalmente aceptada es que el citoesqueleto se comporta como un material viscoelástico. Sin embargo, este modelo no siempre puede explicar los resultados experimentales, que son más consistentes con una imagen que describe el citoesqueleto como un material activo poroelástico, una red elástica incrustada con citosol. Los gradientes de contractilidad generados por los motores de miosina impulsan el flujo del citosol a través de los poros del gel, lo que infiere que la mecánica del citoesqueleto y el citosol están estrechamente acoplados. Una característica principal de la poroelasticidad es la relajación difusiva de las tensiones en la red, caracterizada por una constante de difusión efectiva que depende del módulo elástico del gel, la porosidad y la viscosidad del citosol (solvente). Como las células tienen muchas formas de regular su estructura y propiedades materiales, nuestra comprensión actual de cómo se acoplan la mecánica del citoesqueleto y la dinámica del flujo del citosol sigue siendo poco conocida. Aquí, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para caracterizar las propiedades materiales de los geles de actomiosina poroelásticos como un sistema modelo para el citoesqueleto celular. La contracción del gel es impulsada por la contractilidad motora de la miosina, lo que conduce a la aparición de un flujo del disolvente penetrante. El documento describe cómo preparar estos geles y realizar experimentos. También discutimos cómo medir y analizar el flujo de solvente y la contracción del gel tanto a escala local como global. Se dan las diversas relaciones de escala utilizadas para la cuantificación de datos. Finalmente, se discuten los desafíos experimentales y las trampas comunes, incluida su relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.
Las células vivas tienen propiedades mecánicas únicas. Además de la capacidad de reaccionar pasivamente a las fuerzas aplicadas, también son capaces de generar activamente fuerzas en respuesta a estímulos externos1. Estas características, que son esenciales para una variedad de procesos celulares, especialmente durante la motilidad celular, se atribuyen principalmente a las propiedades mecánicas y dinámicas del citoesqueleto celular, especialmente el citoesqueleto de actomiosina, que es un gel activo de filamentos de actina polar, motores moleculares de miosina y proteínas accesorias. Estas redes de actomiosina exhiben propiedades intrínsecas de autoorganización y contracción impulsadas por las proteínas motoras de miosina, que entrecruzan los filamentos de actina y generan activamente tensiones mecánicas en la red alimentadas por la hidrólisisde ATP 2.
Se han realizado numerosos estudios experimentales y teóricos para estudiar las propiedades materiales del citoesqueleto3. La opinión comúnmente aceptada es que el citoesqueleto se comporta como un material viscoelástico4. Esto significa que en escalas de tiempo cortas, el citoesqueleto se comporta como un material elástico, y en escalas de tiempo largas, se comporta como un fluido viscoso debido a las proteínas de reticulación y al desprendimiento motor de miosina (y reconexión), lo que permite que la red se mueva dinámicamente. En muchas situaciones, sin embargo, el modelo viscoelástico no puede describir los resultados experimentales, que son más consistentes con una imagen que describe el citoesqueleto y, más generalmente, el citoplasma celular que se describe como un material activo poroelástico 5,6. Dos características principales caracterizan este tipo de materiales. (i) La primera característica principal es la generación de un flujo del citosol penetrante (el "solvente") a través de los poros del gel por gradientes de contractilidad impulsados por los motores de miosina, que subyace a procesos como el blebbing celular7, la motilidad8 y las oscilaciones de la forma celular9. La aparición de tales flujos citosólicos puede ser local, para ampollar, o global, como en la motilidad celular. En este último caso, las tensiones contráctiles aplicadas en la parte posterior de la célula impulsan el flujo del líquido citosólico hacia el frente celular, lo que repone el conjunto de proteínas necesarias para el ensamblaje de lamellipodia8. (ii) La segunda característica principal es que la relajación de las tensiones es difusiva y se caracteriza por una constante de difusión efectiva, , que depende del módulo elástico del gel, la porosidad del gel y la viscosidad del disolvente5. La constante de difusión poroelástica determina qué tan rápido responde el sistema a una tensión aplicada. Las constantes de difusión más altas corresponden a una redistribución de tensiones más rápida. Esto, a su vez, determina cuánto tiempo tarda el líquido citosólico intracelular en redistribuirse dentro de la célula después de la tensión mecánica aplicada, ya sea externa o interna, como las tensiones contráctiles activas generadas por los motores de miosina. Estos ejemplos, por lo tanto, demuestran que la mecánica del citoesqueleto y el citosol están estrechamente acoplados y no pueden ser tratados por separado3.
Como las células pueden regular sus propiedades mecánicas de varias maneras, la interacción entre la mecánica de red y la dinámica del flujo de fluidos sigue siendo poco conocida. Un enfoque alternativo poderoso es el uso de sistemas reconstituidos in vitro que permiten un control total de los diversos componentes microscópicos y los parámetros del sistema, lo que hace que estos sistemas modelo sean óptimos para el análisis físico10,11. Este enfoque se ha empleado con éxito para estudiar el impacto de la composición de proteínas y la geometría del sistema en la motilidad basada en actina 12,13,14,15,16,17,18, el patrón 2D de las redes de actomiosina 19,20,21,22, y la interacción entre la contractilidad de la red y la dinámica del flujo de fluidos de geles de actomiosina poroelástica, que es el foco de este trabajo23.
En este manuscrito se discute la preparación de redes de actomiosina elásticas contráctiles de dimensiones controlables y propiedades del material basadas en el trabajo de Ideses et al.23. Se analiza y cuantifica la dinámica del gel de contracción y el disolvente drenado, a través de los cuales se demuestra que estos geles de actomiosina pueden describirse como un material activo poroelástico. El estudio del efecto de la viscosidad del disolvente sobre la difusividad de tensión confirma aún más la naturaleza poroelástica de estas redes. Se proporcionan las diversas relaciones de escala utilizadas para la cuantificación de datos. Finalmente, también se discuten los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia de los resultados experimentales para el citoesqueleto celular.
1. Tratamiento y pasivación de superficies de vidrio:
NOTA: Esta sección incluye tres pasos principales (ver Figura 1): (i) limpieza e hidrofilización, (ii) silanización y (iii) pasivación superficial.
2. Purificación de proteínas
3. Preparación de la muestra
NOTA: Polimerizar los monómeros de actina en presencia de grandes agregados de motores de miosina II y la fuerte fascina reticulante pasiva para producir redes de actomiosina elásticas contráctiles macroscópicamente19,23. La adición de perlas fluorescentes a la solución permite rastrear el flujo de solvente durante la contracción del gel.
4. Ejecutar un experimento
5. Técnicas de microscopía
Se utilizan dos cubreobjetos de vidrio por experimento. Los cubreobjetos de vidrio se limpian y pasivan con polímeros PEG. La pasivación es esencial para evitar que las proteínas solubilizadas se adhieran a las superficies de vidrio en las primeras etapas experimentales y para minimizar la interacción de la red de contracción con las paredes de vidrio. No lograr una buena pasivación puede conducir a una contracción ineficiente y, en casos extremos, incluso puede inhibir la formación de la red de actina.
La figura 1 describe los tres pasos principales del procedimiento de tratamiento de superficies. Estos pasos incluyen lo siguiente: (i) limpieza de superficies e hidrofilización utilizando una solución de piraña, que elimina la contaminación orgánica de las superficies de cobertura y expone los grupos OH en la superficie del vidrio; ii) silanización superficial con (3-mercaptopropil)trimetoxisilano, que tiene como objetivo unir covalentemente el silano a la superficie del vidrio, donde cada molécula de silano termina con un grupo SH; (iii) pasivación con polímeros PEG (mPEG-mal, 5 kDa): en este paso, el grupo maleimida del polímero PEG interactúa covalentemente con el grupo SH en el (3-mercaptopropil)trimetoxisilano, lo que resulta en la formación de una monocapa de PEG en la superficie del vidrio.
Para el tratamiento y silanización de piraña, se colocan 10-12 cubreobjetos de vidrio # 1.5 (22 mm x 22 mm) en un soporte de politetrafluoroetileno (Figura 2A), y ese soporte se transfiere a un vaso de precipitados de 400 ml. Para la etapa de pasivación, dos cubreobjetos de vidrio se transfieren a una placa de Petri recubierta de parapelícula (Figura 2B). La colocación de los cubreobjetos sobre una capa de parafilm hidrófobo garantiza que la solución de polímero PEG hidrófilo permanezca confinada a la superficie del vidrio durante todo el tiempo de incubación. Cada cubreobjetos se incuba con 1 mL de 4 mg·mL−1 5 kDa mPEG-mal en 1x PBS durante 1 h a 22 °C (Figura 2B). Para este peso molecular y concentración del polímero PEG, la pasivación del vidrio conduce a la formación de una monocapa PEG, donde cada polímero PEG está en una conformación similar a un hongo29. Al final del proceso de incubación, cada cubreobjetos se enjuaga con 5 ml de DDW y se seca con un flujo deN2 (gas). Si los cubreobjetos no se utilizan inmediatamente, se debe colocar 1 ml de Tris de 10 mM en las superficies pegiladas para mantener húmedas las superficies del cubreobjetos. Los cubreobjetos se secan con un flujo de N2 (gas) justo antes de comenzar un experimento. Es mejor usar los cubreobjetos dentro de 2 h.
Las redes de actomiosina elásticas contráctiles macroscópicamente se forman mezclando 5 μM de actina G con miosina de 16,7 nM, que se agrega en forma de agregados grandes (~ 150 dímeros / agregados de miosina) y 280 nM de la fascina reticulante fuerte. La solución incluye 1 mM de ATP, que se mantiene constante utilizando un sistema de regeneración de ATP y una solución antiblanqueo (ver detalles en la sección de protocolo). Para analizar el flujo del disolvente penetrante, se agregan perlas fluorescentes a la solución de actomiosina.
Los experimentos se llevan a cabo en un portamuestras casero, que se ajusta a las dimensiones de una etapa de microscopio estándar (Figura 3). Se coloca un espaciador de parafilm engrasado de espesor h (~150 μm) en uno de los dos cubreobjetos pasivados con PEG, y ese cubreobjetos se coloca en el soporte de la muestra (Figura 3A). Luego, la solución de actomiosina se prepara en hielo en un tubo de microcentrífuga incorporando los diversos componentes microscópicos, agregando por último la actina G, los agregados de miosina y luego EGTA, que desencadena la polimerización de actina. La solución debe mezclarse bien, esto establece el tiempo de inicio de los experimentos (t = 0). Inmediatamente, se colocan 1,1 μL de esa solución en el cubreobjetos (Figura 3B), el segundo cubreobjetos pasivados con PEG se coloca encima de él (Figura 3C) y el soporte se atornilla para confinar la gota entre ellos (Figura 3D). Para este volumen de gota y tipo de espaciador, el diámetro de la gota es de aproximadamente 3.000 μm, pero los investigadores no deben confiar en estos valores estimados. El espesor y el diámetro reales de la gota siempre deben medirse directamente a partir de las imágenes de microscopía. Para el grosor, se debe usar un microscopio confocal.
El portamuestras se coloca en el microscopio y se inicia la adquisición. El microscopio debe prepararse de antemano para reducir al mínimo el tiempo de inicio de la adquisición. Por lo general, toma de 1 a 2 minutos iniciar la imagen de la muestra. Las muestras se excitan a 488 nm y / o 561 nm y se obtienen imágenes utilizando un microscopio fluorescente invertido controlado por un software dedicado. Las imágenes deben adquirirse a una velocidad de 100 ms por fotograma (o menos) en modo streaming con una cámara EMCCD. Para obtener imágenes simultáneas de la red de actina y los agregados motores de miosina, o las perlas fluorescentes en la solución, se debe utilizar un sistema de doble emisión. La intensidad de la lámpara fluorescente debe mantenerse lo más baja posible para evitar la saturación de la señal en las etapas avanzadas de la contracción de la red.
Se utiliza un objetivo Plan-NEOFLUAR 2.5x/0.075 para caracterizar la dinámica de contracción lateral del gel y la direccionalidad y velocidad del flujo de fluido en la escala de longitud del gel. Estas son imágenes de baja resolución que son útiles para seguir los cambios en el radio del gel con el tiempo, a partir de las cuales se puede deducir la velocidad de contracción radial (lateral) del gel. Para resolver la estructura y porosidad de la red, la ubicación de los agregados motores de miosina dentro de la red y el movimiento de perlas fluorescentes individuales a través de los poros del gel, se deben usar objetivos de mayor aumento (por ejemplo, un objetivo UPlanFL 10x/0.3 Ph1). También se pueden usar aumentos más altos, pero a expensas de un campo de visión reducido, que es más significativo si se emplea el modo de imagen de doble color. Los datos de microscopía de fluorescencia (2D) deben complementarse con imágenes confocales del gel de contracción en 3D para caracterizar la dinámica de contracción tanto en la dirección lateral como vertical. La microscopía confocal se utiliza para medir el espacio entre los dos cubreobjetos, esta distancia define el grosor inicial del gel. Además, el grosor del gel debe medirse al final del experimento cuando se alcanza un estado mecánicamente estable.
Se deben cumplir varios criterios para demostrar que las redes de actomiosina se comportan como un material poroelástico: (i) la red no se remodela, lo que inferiría que se comporta como un material elástico (Figura 4), (ii) el flujo de agua (solvente) a través de los poros del gel es impulsado por la contractilidad de la miosina (Figura 5), y (iii) la relajación del estrés elástico se caracteriza por una constante de difusión efectiva, D ~ κ/γ, que depende del módulo elástico efectivo del gel, κ, y de la constante de fricción efectiva, γ, que explica la fricción entre el disolvente en movimiento y los poros del gel (Figura 6). A continuación, discutimos cada criterio por separado y demostramos cómo se cumplen en el sistema actual.
Objetivo i)
En primer lugar, se debe analizar la estructura y la porosidad del gel, y se debe determinar si la red se está remodelando dinámicamente. Una representación esquemática de la red de actomiosina se representa en la Figura 4A. La formación de la red comienza con la nucleación espontánea y la polimerización de los filamentos de actina, que posteriormente se agrupan (Figura 4B). Luego, la red se autoorganiza activamente en una red interconectada macroscópicamente isotrópica de haces de actina, que se engrosa dinámicamente con el tiempo y finalmente se contrae. La autoorganización y contracción de la red son impulsadas por los agregados de miosina, que se localizan predominantemente en los puntos de intersección de los haces de filamentos (Figura 4C). Los agregados de miosina permanecen unidos a la red a través de la contracción del gel, de lo cual se puede concluir que estos geles de actomiosina se comportan como materiales activos elásticos (Figura 4C). Además, en estos geles de actomiosina, la contracción se rige por el deslizamiento del filamento, como se deduce al comparar las distancias de extremo a extremo de los haces de filamentos, l de extremo a extremo y las longitudes de contorno, lcont (Figura 4D, E). Esto contrasta con la contracción de haces de actina sueltos reticulados por α-actinina, que están dominados por el pandeo del filamento de actina29.
La porosidad del gel se caracteriza por el tamaño de los poros del gel a través de los cuales se mueve el flujo de disolvente. Para redes de actina purificadas, el tamaño de la malla, que define la distancia entre los enlaces cruzados en el gel (aquí, los agregados de miosina), proporciona una buena estimación también del tamaño del poro del gel. El tamaño de la malla se puede extraer directamente de las imágenes de fluorescencia (2D) y se evalúa a partir de la media geométrica de las distancias entre pares de haces de actina opuestos en un poro de gel (Figura 4B). Dado que la red es isotrópica hasta el inicio de la contracción, los tamaños medios de malla en las direcciones vertical (es decir, a través del espesor) y lateral (a lo largo del radio) son los mismos, ξ 0, = ξ 0,
ll = ξ0 (= 67 μm). Dado que los haces de actina permanecen rectos durante la contracción, los tamaños de malla y poro se reducen en proporción a los cambios en el grosor y diámetro del gel. Para el sistema experimental actual, la contracción en el plano (radial) se inicia después de que la contracción vertical prácticamente termina (no se muestra), de modo que la contracción radial procede a un espesor de gel constante menor que el espesor inicial por un factor de ~ 0.3. En consecuencia, mientras que el tamaño de la malla dentro del plano de contracción, ξ ll (t) = r (t) / R, disminuye durante la contracción radial, donde r (t) es el radio del gel en el momento t, el tamaño medio de la malla en la dirección perpendicular es constante, ξ
= 20μm23. Estos valores de los tamaños de malla/poro se utilizan para evaluar el módulo elástico del gel, κ, y el coeficiente de fricción, γ, como se detalla a continuación (Objetivo [iii], Figura 6).
Objetivo ii)
Este objetivo consiste en demostrar que un flujo de disolvente hacia el exterior es generado por la contractilidad de la miosina. Para rastrear el flujo de solvente, se agregan perlas fluorescentes a la solución de actomiosina. Las perlas se pasivan para reducir la interacción entre las perlas en movimiento y la red de actomiosina. En general, 1 μL de perlas (Tabla de materiales) se incuba con 5 μm de actina G durante 20 minutos a temperatura ambiente, y el exceso de actina G se elimina mediante centrifugación (Tabla de materiales, consulte la sección de protocolo para obtener más detalles). Este paso se repite con 10 mg·mL-1 BSA (Tabla de Materiales). Las perlas se añaden a la solución proteica en una dilución final de 1:10.000 v/v. Dado que el objetivo es permitir que las perlas se muevan libremente a través del poro del gel, es importante adaptar los diámetros de las perlas al tamaño del poro del gel, de modo que su relación de tamaño sea siempre <<1. Como tal, se utilizan perlas de 2.300 nm de diámetro para analizar las etapas inicial e intermedia de contracción (Figura 5A, B) cuando el tamaño promedio de poro es mayor de 15 μm, y las perlas de 200 nm de diámetro se utilizan cuando el tamaño de poro es más pequeño (Figura 5D-G). La posición del centro de masa de las perlas se extrae para cada vez, t, (x(t),y(t))perla, utilizando un algoritmo estándar de seguimiento de partículas (Tabla de materiales), del cual se puede deducir la trayectoria (Figura 5B) y la velocidad local de la cuenta, , .
Las perlas y, por lo tanto, el disolvente penetrante, se mueven en promedio en la dirección radial hacia afuera (Figura 5A, B), mientras que el gel se contrae hacia adentro, como se muestra en el análisis de velocimetría de imagen de partículas (PIV) (ver las flechas verdes en la Figura 6A). Este movimiento radial se puede elaborar aún más extrayendo la velocidad radial de las perlas locales, νr, que se evalúa proyectando la velocidad de la cuenta local en la dirección radial definida por el vector unidad, , conectando el centro del gel (x 0, 
y 0) y la posición del centro de masa de la cuenta en el tiempo t: 
donde
Los datos muestran que a medida que las perlas se mueven hacia afuera desde el centro del gel, sus velocidades aumentan inicialmente, y luego disminuyen la velocidad a medida que se acercan al límite del gel (Figura 5C). En particular, la velocidad de la perla puede ser 20 veces mayor que la velocidad de contracción radial del gel (curva azul en la Figura 5C). Los círculos llenos marcan el momento en que las perlas salen del gel. Las cuentas continúan moviéndose después de salir del límite del gel durante algún tiempo. Este movimiento no puede ser el resultado de efectos inerciales, ya que el número de Reynold es <10-4. La velocidad del cordón radial disminuye con el tiempo concomitante con la disminución de la contracción del gel; En particular, cuando la velocidad de contracción radial del gel ha disminuido significativamente, la velocidad de las perlas fluctúa significativamente.
Para probar si estas fluctuaciones son el resultado de la estructura porosa de la actomiosina, la red rastrea el movimiento de las perlas a una resolución espacial más alta, lo que es posible cuando la contracción del gel se ha ralentizado significativamente (Figura 5D-F). La trayectoria de las perlas es realmente tortuosa (Figura 5D, E), con fluctuaciones significativas en la velocidad local de las perlas, lo que refleja la estructura porosa del gel, es decir, la velocidad local es más rápida cerca del centro del poro y más lenta en las proximidades de un haz de actina (Figura 5F).
Finalmente, el cálculo de la función de correlación velocidad gel-velocidad solvente demuestra que localmente el flujo de fluido se dirige opuesto al gel de contracción. Usando puntos brillantes locales en el gel como marcadores fiduciales, se puede calcular su posición del centro de masa para cada punto de tiempo, t, (x(t),y(t))gel, y se puede derivar la velocidad local del gel: 
. Luego, para cada cuenta y un punto cercano en el gel, se calcula la correlación local de la velocidad del gel-velocidad del gel para extraer el ángulo, θ, entre los dos vectores: 
, donde 
y son las velocidades locales (magnitud) de la cuenta y 
el gel, respectivamente. Los datos muestran que, independientemente de la posición de la perla dentro del poro del gel, localmente, el flujo de fluido se dirige en la dirección opuesta con respecto al gel (Figura 5G). En general, los resultados muestran que un flujo de fluido hacia el exterior es generado por la contractilidad de la miosina, como se esperaba para un material activo poroelástico 3,7,23,30.
Objetivo iii)
Este objetivo implica demostrar que la relajación de la tensión se caracteriza por una constante de difusión poroelástica efectiva, D, que depende del módulo elástico de la red, la porosidad y la viscosidad del disolvente. Primero, se cuantifica la velocidad lateral (en el plano) del gel de contracción (Figura 6A). En primer lugar, las imágenes de fluorescencia son binarizadas, y se extrae el área proyectada en gel en cada punto de tiempo t, A(t). Luego, se calcula 
el radio del gel (Figura 6B). De esto, se deriva la velocidad de contracción radial en el punto de tiempo t,
que describe la velocidad del borde del gel (Figura 6C). La velocidad del borde muestra un perfil de evolución temporal típico caracterizado por una fase lineal inicial, en la que la velocidad del borde aumenta a una velocidad constante, , hasta que se alcanza una velocidad máxima, ν max, 
en el tiempo t max. La velocidad luego decae exponencialmente con un tiempo de relajación característico, τ, hasta que se alcanza un estado mecánicamente estable (Figura 6C). El rmaxes el radio del gel al comienzo de esa fase de relajación.
Para un material poroelástico, el tiempo 
de relajación , donde 
es una constante de difusión poroelástica efectiva, κ es un módulo de gel elástico efectivo, y γ es una constante de fricción efectiva que explica el movimiento de la solución acuosa a través de los poros del gel de actina. El módulo elástico tiene unidades de energía por unidad de volumen y es inversamente proporcional al volumen de una celda unitaria en el gel, determinado por la distancia entre enlaces cruzados o el tamaño de la malla, tal que 
. El coeficiente de fricción, γ, depende de la faceta de poro perpendicular al flujo de disolvente. Para la contracción del gel en el plano, la faceta de poro relevante es , y, en consecuencia, el coeficiente 
de fricción , donde η es 
la viscosidad del disolvente31,32. En general, obtenemos la siguiente relación: 
, donde el tamaño 
de poro en el plano relevante se evalúa en tmax. En conjunto, obtenemos 
, que infiere que el tiempo de relajación debe escalar linealmente con la viscosidad del disolvente23.
Para probar si se obedece esta relación, los experimentos se repiten con diferentes cantidades de glicerol. El uso de glicerol es ventajoso ya que no se espera que afecte la actividad de las proteínas, particularmente los motores de miosina. Además, las correlaciones entre la viscosidad de las soluciones de agua-glicerol y la cantidad de glicerol añadido están disponibles en la literatura28. Estas correlaciones muestran que un aumento en el porcentaje de peso de glicerol de 0% a 34% conduce a un aumento proporcional en la viscosidad de la solución de agua-glicerol de η ω a 2.76η ω, donde η ωes la viscosidad del agua a 20 ° C. En este rango de glicerol y para el mismo diámetro de gota inicial, 2R = 2.800 μm, un aumento en la viscosidad aumenta la duración de las fases de polimerización y autoorganización de la red, aunque la aceleración lineal y la velocidad máxima de contracción radial (νmax) se mantienen sin cambios. Esta evidencia sugiere que tanto la reorganización de la red (porosidad) como la actividad de la miosina no se ven afectadas por la viscosidad de la solución23, y el efecto de la viscosidad del solvente debe reflejarse esencialmente en el tiempo que tardan las tensiones elásticas en relajarse. De hecho, el tiempo de relajación muestra una dependencia lineal de la viscosidad de la solución (Figura 6D), lo que infiere que se obedece la relación de escala derivada anteriormente, confirmando aún más la naturaleza poroelástica del sistema.
Figura 1: Descripción esquemática de los tres pasos principales del procedimiento de tratamiento de superficies de cubreobjetos de vidrio. (i) Limpieza de superficies de vidrio (tratamiento de piraña) e hidrofilización, (ii) silanización superficial, y (iii) pasivación con mPEG-mal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasivación del cubreobjetos de vidrio. (A) La limpieza y silanización de la piraña se realizan en un vaso de precipitados de 400 ml utilizando un soporte casero de politetrafluoroetileno que consta de 12 ranuras lineales. (B) La pasivación superficial se realiza en una placa de Petri recubierta de parapelícula. Cada cubreobjetos se incuba con 1 mL de 5 kDa mPEG-mal a 4mg·mL−1 en 1x PBS (Tabla de Materiales) durante 1 h a 22 °C. La capa de parafilm hidrófobo asegura que la solución de polímero PEG hidrófilo permanezca confinada a la superficie del vidrio durante todo el tiempo de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejecución de un experimento: el portamuestras casero. Los experimentos se realizan en un portamuestras casero que se ajusta a las dimensiones de una etapa de microscopio estándar. (A) Un espaciador de parafilm engrasado de espesor h (~ 150 μm) se coloca en un cubreobjetos pasivados por PEG, y ese cubreobjetos se coloca en el soporte de muestra. B) La solución de actomiosina se prepara en hielo en un tubo de Eppendorf, y 1,1 μL de dicha solución se coloca en el cubreobjetos; luego (C) se coloca un segundo cubreobjetos pasivados con PEG encima, y (D) se atornilla el soporte de la muestra para confinar la gota, que adopta una forma de disco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Objetivo de poroelasticidad (i). La red de actomiosina se comporta como un material elástico. (A) Representación esquemática de una red de actomiosina. (B) Formación de la red de actomiosina. Las imágenes de microscopía de fluorescencia demuestran que los filamentos de actina se nuclean espontáneamente y polimerizan en una red isotrópica interconectada que se engrosa con el tiempo y finalmente se contrae macroscópicamente. La porosidad de la red se caracteriza por el tamaño de malla de la red, ξ (flecha doble). (C-E) La contracción de la red de actomiosina es impulsada por el deslizamiento del haz de filamentos de actina. (C) La contracción de la red se inicia en la periferia del gel ("P") y se propaga hacia adentro en la masa del gel. Las flechas blancas muestran la dirección de contracción. El centro de gel está marcado con una "C". Las imágenes fluorescentes muestran que los agregados motores de miosina (561 nm, puntos rojos) están incrustados en la red de actina (488 nm, verde) y permanecen unidos a ella durante toda la contracción de la red. (D) Los haces de filamentos de actina permanecen rectos durante la contracción de la red. La relación entre la longitud del contorno, l cont y la distancia de extremo a extremo, lde extremo a extremo, en función del tiempo. (E) Distribución de la relación entre la longitud del contorno y la distancia de extremo a extremo en t = 316 s (rojo sólido) y t = 327 s (rayado, gris). Recuadro: longitud del contorno (azul) y distancia de extremo a extremo (blanco) de un paquete típico. Condiciones: (B,C,E[recuadro]): Las imágenes se adquieren en un microscopio fluorescente invertido con una cámara EMCCD y un objetivo aéreo UPlanFL 10x/0.3 Ph1 en modo regular (B) y en modo de imagen dual después de la superposición de imagen (C,E[recuadro]). Las barras de escala son (B,C) 100 μm y (E[recuadro]) 50 μm. Esta cifra ha sido reproducida con permiso de Ideses et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Objetivo de poroelasticidad (ii). Un flujo de disolvente hacia el exterior es generado por la contractilidad motora de la miosina. (A) Obtención de imágenes del gel a un aumento bajo en etapas intermedias de contracción: imágenes de fluorescencia simultánea de una red de actina que se contrae (488 nm, izquierda) y perlas fluorescentes de 2.300 nm agregadas a la solución (561 nm, derecha) en función del tiempo. Los círculos marcan las posiciones de cuatro cuentas. Las flechas marcan la dirección global del movimiento de la cuenta. (B) Se representan las trayectorias de nueve cuentas seleccionadas. Las flechas marcan la dirección radial global del movimiento de las cuentas. La cruz rodeada denota el centro del gel (x0,y0) (C) Velocidad del cordón radial local νr (círculos abiertos) y velocidad del borde del gel (radial) (puntos azules) frente al tiempo. Los círculos llenos indican la hora en que una cuenta dada sale del límite del gel. (D-F) Resolver la porosidad de la red y el movimiento del disolvente a través de los poros del gel en etapas avanzadas de contracción. (D) Imágenes de epifluorescencia del gel de contracción y perlas fluorescentes de 200 nm de diámetro agregadas a la solución. Tanto la actina como las perlas se excitan a 488 nm. Los círculos rojos siguen la posición de una cuenta con el tiempo. La línea gris indica el límite del gel. (E) Trayectoria de la cuenta mostrada en (D). En el campo mostrado, el gel se contrae en promedio hacia abajo. Las coordenadas se miden en relación con el origen de la cámara. (F) La velocidad local de la perla refleja la estructura porosa del gel. Arriba: velocidad local del talón (círculos abiertos), velocidad del gel local (círculos grises) y velocidad del borde del gel (círculos azules) frente al tiempo. Abajo: Las instantáneas muestran la posición de la cuenta para las horas seleccionadas. La cuenta está marcada por un círculo rojo. La línea discontinua marca el momento en que la cuenta sale del gel. (G) Distribución de ángulos entre el gel local y las velocidades locales del talón. Condiciones: Las imágenes se adquieren en un microscopio fluorescente invertido con una cámara EMCCD y (A) un objetivo Plan-NEOFLUAR 2.5x/0.075 y (D,F) un objetivo UPlanFL 10x/0.3 Ph1. Las barras de escala son (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) y 50 μm. Esta cifra ha sido reproducida con permiso de Ideses et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Objetivo de poroelasticidad (iii). La relajación del estrés se caracteriza por una constante de difusión poroelástica efectiva. (A) Imágenes de fluorescencia de vista superior de un gel de actomiosina que se contrae a bajo aumento desde el tiempo de mezcla hasta el estado estacionario. El campo de velocidad (flechas verdes) se extrae del análisis PIV. Las imágenes se adquieren en un microscopio fluorescente invertido con una cámara EMCCD y un objetivo Plan-NEOFLUAR 2.5x/0.075. La longitud de onda de excitación es de 488 nm (actina). La barra de escala es de 500 μm. (B) Radio del gel y (C) velocidad de contracción radial, (es decir, la velocidad del borde del gel frente al tiempo). A denota la aceleración, Vmax denota la velocidad máxima, 
y τ es un tiempo de relajación característico. (D) Las redes de actomiosina se comportan como un material activo poroelástico. 
y viscosidad del disolvente, η, frente al porcentaje de peso de glicerol (% en peso). Las cantidades se normalizan a sus valores al 0% en peso de glicerol. El radio inicial del gel es R = 1.400 μm. Las barras de error son las desviaciones estándar de los valores experimentales. Esta cifra ha sido reproducida con permiso de Ideses et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los autores no tienen nada que revelar.
En este trabajo, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para estudiar la poroelasticidad de los geles de actomiosina en condiciones controladas. Se cuantifica la dinámica del gel de actomiosina y el disolvente incrustado, a través de la cual se demuestra la porosidad de la red. También discutimos los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.
Nos gustaría agradecer a Dina Aranovich por la purificación y el etiquetado de proteínas. G.L. agradece al Ministerio de Ciencia, Tecnología y Espacio de Israel por la beca de doctorado Jabotinsky. A.B.G. agradece a la Fundación de Ciencia de Israel (subvención 2101/20) y al Ministerio de Ciencia y Tecnología - Estado de Israel (subvención 3-17491) por su apoyo financiero.
| (3-Mercaptopropyl)trimetoxisilano | Sigma-Aldrich Company 175617 | Almacenado bajo atmósfera de argón a 4 & grados; C | |
| Ácido acético | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluido con DMSO, almacenado bajo atmósfera de argón a -20 & grados; C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluido con DMSO, almacenado en atmósfera de argón a -20 & grados; C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | almacenado a 4 & deg; C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | La botella de stock se mantiene en atmósfera seca (gel de sílice) a -20 & grados; C |
| Cubreobjetos | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Conservado en agua miliQ después del tratamiento con Piraña y utilizado en 3 semanas |
| Creatina quinasa | Roche Life Science Products 10736988001 | Preparado fresco en tampón de glicina, mantenido en hielo y utilizado en 3 días. La botella de caldo se mantiene en atmósfera seca (gel de sílice) a 4 & grados; C | |
| Fosfato de creatina | Roche Life Science Products | 10621714001 | Cuando se disuelve debe mantenerse a -20 & grados; C y se utiliza en un plazo de 3 meses. La botella de stock se mantiene bajo atmósfera de argón y se almacena a 4 & grados; C |
| DTT | Roche Life Science Products 10708984001 | Cuando se disuelve debe mantenerse a -20 & grados; C y se utiliza dentro de los 3 meses | |
| Sistema de imágenes simultáneas de doble vista | Fotometría | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| Cámara EM-CCD Andor | Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD | Cámara Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab Ltd | 525050300 | |
| Lámpara de fluorescencia | Rapp Optoelectrónica | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm de diámetro |
| Glucosa | ICN Biomedicals Inc | 194024 | Cuando se disuelve debe mantenerse a -20 & grados; C y se utiliza en un plazo de 3 meses. |
| Glucosa oxidasa | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Conservada en -20 ° C y se utiliza en un plazo de 3 meses. El polvo de stock se mantiene bajo atmósfera de argón y se mantiene a -20 ° C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich Company 216763 | almacenado a 4 & deg; C | |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | ||
| Microscopio | 442615 Leica Microsystems DMI3000 | ||
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Dividido en lotes pequeños por peso. Almacenado bajo atmósfera de argón a -20 ° C |
| Microesferas rojas del Nilo | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm de diámetro |
| Objetivo (10x) | Leica Alemania | HC PL AP0 | UPlanFL Apertura numérica = 0.3 |
| Objetivo (2.5x) | Leica Alemania | 506304 | Plan-NEOFLUAR Apertura numérica = 0.075 |
| Horno | WTC Aglutinante | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Controlador de obturador | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Gel de sílice | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicador | Elma | Elmasonic P | |
| Ácido sulfúrico | Reactivos Carlo Erba | 410301 | |
| DV2 Sistema de imagen simultánea de doble canal | Fotometría | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| Espectrofotómetro UV-VIS | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1– 10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Cuantificación de datos | |
| MetaMorph | Dispositivos | moleculares | Software de control del sistema óptico de imágenes; cuantificación de datos (análisis de seguimiento de partículas, tamaño de malla de red) |
