Cultivo a largo plazo y monitorización de Caenorhabditis elegans aislada en medios sólidos en dispositivos multipocillos

Caenorhabditis elegans se usa comúnmente en estudios de envejecimiento debido a su corto tiempo de generación (aproximadamente 3 días), corta vida útil (aproximadamente 3 semanas), facilidad de cultivo en el laboratorio, alto grado de conservación evolutiva de procesos moleculares y vías con mamíferos y amplia disponibilidad de técnicas de manipulación genética. En el contexto de los estudios de envejecimiento, C. elegans permite la rápida generación de datos de longevidad y poblaciones envejecidas para el análisis de fenotipos tardíos en animales vivos. El enfoque típico para realizar estudios de envejecimiento de gusanos consiste en medir manualmente la vida útil de una población de gusanos mantenidos en grupos de 20 a 70 animales en medios de crecimiento de nematodos de agar sólido (NGM) en placas de Petri de 6 cm¹. El uso de poblaciones sincronizadas por edad permite la medición de la esperanza de vida o fenotipos transversales en animales individuales en toda la población, pero este método impide monitorear las características de animales individuales a lo largo del tiempo. Este enfoque también requiere mucha mano de obra, lo que restringe el tamaño de la población que se puede probar.

Hay un número limitado de métodos de cultivo que permiten el monitoreo longitudinal de C. elegans individuales a lo largo de su vida útil, y cada uno tiene un conjunto distinto de ventajas y desventajas. Los dispositivos de microfluídica, incluidos WormFarm², NemaLife³ y el chip^de "comportamiento" 4, entre otros 5,6,7^, permiten el monitoreo de animales individuales a lo largo del tiempo. El cultivo de gusanos en cultivo líquido utilizando placas de pocillos múltiples permite de manera similar el monitoreo de animales individuales o pequeñas poblaciones de C. elegans a lo largo del tiempo ^8,9. El ambiente líquido representa un contexto ambiental distinto del ambiente de cultivo común en medios sólidos en placas de Petri, que puede alterar aspectos de la fisiología animal que son relevantes para el envejecimiento, incluido el contenido de grasa y la expresión de genes de respuesta al estrés^10,11. La capacidad de comparar directamente estos estudios con la mayoría de los datos recopilados sobre el envejecimiento de C. elegans está limitada por las diferencias en variables ambientales potencialmente importantes. El Worm Corral¹² es un enfoque desarrollado para albergar animales individuales en un entorno que replica más de cerca la cultura típica de medios sólidos. El Corral de Gusanos contiene una cámara sellada para cada animal en un portaobjetos de microscopio utilizando hidrogel, lo que permite el monitoreo longitudinal de animales aislados. Este método utiliza imágenes estándar de campo claro para registrar datos morfológicos, como el tamaño corporal y la actividad. Sin embargo, los animales se colocan en el ambiente de hidrogel como embriones, donde permanecen inalterados durante toda su vida. Esto requiere el uso de antecedentes genéticos mutantes o transgénicos condicionalmente estériles, lo que limita tanto la capacidad de cribado genético, ya que cada nueva mutación o transgén necesita ser cruzado a un fondo con esterilidad condicional, como la capacidad de cribado de fármacos, ya que los tratamientos solo se pueden aplicar una vez a los animales como embriones.

Un método alternativo desarrollado por el laboratorio Fang-Yen permite el cultivo de gusanos en medios sólidos en pozos individuales de un dispositivo microfabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) llamado WorMotel^13,14. Cada dispositivo se coloca en una bandeja de un solo pozo (es decir, con las mismas dimensiones que una placa de 96 pocillos) y tiene 240 pozos separados por un foso lleno de una solución aversiva para evitar que los gusanos viajen entre pozos. Cada pozo puede albergar un solo gusano durante toda su vida útil. El dispositivo está rodeado por gránulos de gel de poliacrilamida que absorben agua (denominados "cristales de agua"), y la bandeja está sellada con una película de laboratorio Parafilm para mantener la humedad y minimizar la desecación de los medios. Este sistema permite recopilar datos de salud y vida útil para animales individuales, mientras que el uso de medios sólidos recapitula mejor el entorno experimentado por los animales en la gran mayoría de los estudios de vida de C. elegans publicados, lo que permite comparaciones más directas. Recientemente, se ha desarrollado una técnica similar utilizando microbandejas de poliestireno que se utilizaron originalmente para ensayos de microcitotoxicidad¹⁵ en lugar del dispositivo PDMS¹⁶. El método de microbandejas permite la recopilación de datos individualizados para gusanos cultivados en medios sólidos y ha mejorado la capacidad de contener gusanos en condiciones que normalmente causarían huida (por ejemplo, factores estresantes o restricciones dietéticas), con la desventaja de que cada microbandeja solo puede contener 96 animales¹⁶, mientras que el dispositivo de múltiples pocillos utilizado aquí puede contener hasta 240 animales.

Aquí se presenta un protocolo detallado para preparar dispositivos de múltiples pocillos que está optimizado para la consistencia de placa a placa y la preparación de múltiples dispositivos en paralelo. Este protocolo fue adaptado del protocolo original del laboratorio Fang-Yen¹³. Específicamente, hay descripciones de técnicas para minimizar la contaminación, optimizar el secado constante tanto de los medios sólidos como de la fuente de alimento bacteriano, y administrar ARNi y medicamentos. Este sistema se puede utilizar para rastrear la duración de la salud individual, la vida útil y otros fenotipos, como el tamaño y la forma del cuerpo. Estos dispositivos de múltiples pozos son compatibles con los sistemas de alto rendimiento existentes para medir la vida útil, lo que puede eliminar gran parte del trabajo manual involucrado en los experimentos tradicionales de vida útil y brindar la oportunidad de una medición automatizada y directa de la longevidad y el seguimiento de la salud en C. elegans individuales a escala.

1. Preparación de soluciones madre y medios

NOTA: Antes de comenzar la preparación de los dispositivos multipocillos, prepare las siguientes soluciones y medios de stock.

1. Soluciones madre para medios de crecimiento de nematodos (NGM) y NGM de bajo punto de fusión (lmNGM):
   1. Prepare 1 M K 2 HPO₄: Agregue 174.18 g de K₂HPO4 auna botella de 1 L y llénela hasta 1 L con agua desionizada estéril. Conservar en autoclave (121 °C, 15 psig) durante 30 min y conservar a temperatura ambiente (RT).
   2. Preparar 1 M KP_i, pH 6.0: Añadir 136,09 g de KH₂HPO₄ a una botella de 1 L, y llenarla hasta 1 L con agua desionizada estéril. Valorar con 1 M K₂HPO₄ a pH 6.0. Autoclave (121 °C, 15 psig) durante 30 min, y conservar en RT.
   3. Prepare 1 M de CaCl 2: Agregue 73.5 g de CaCl₂ a una botella de 500 ml y llénela hasta 500 ml con agua desionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) durante 30 min, y conservar en RT.
   4. Prepare 1 M MgSO 4: Agregue 123.25 g de MgSO₄ a una botella de 500 ml y llénela hasta 500 ml con agua desionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) durante 30 min, y conservar en RT.
   5. Prepare 5 mg/ml de colesterol: Combine 2,5 g de colesterol, 275 ml de etanol al 100% y 25 ml de agua desionizada estéril en una botella de ámbar de 500 ml. Tienda en RT.
   6. Preparar 50 mM de floxuridina: Combine 0,1231 g de floxuridina y 10 ml de agua desionizada estéril en un tubo cónico de 15 ml. Esterilícelo con filtro con un filtro de 0,22 μm con una jeringa de 10 ml. Alícuota 1 ml cada uno en 10 tubos de microcentrífuga y almacénelos a −20 °C.
   7. Prepare 50 mg/ml de carbenicilina: En un tubo cónico de 15 ml, combine 500 mg de carbenicilina con 10 ml de agua desionizada estéril. Esterilícelo con filtro con un filtro de 0,22 μm con una jeringa de 10 ml. Alícuota 1 ml cada uno en 10 tubos de microcentrífuga y almacénelos a −20 °C.
   8. Prepare 1 mM de isopropilß-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG): En un tubo cónico de 15 ml, combine 2,38 g de IPTG con 10 ml de agua desionizada estéril. Esterilícelo con filtro con un filtro de 0,22 μm con una jeringa de 10 ml. Alícuota 1 ml cada uno en 10 tubos de microcentrífuga y almacénelos a −20 °C.
   9. Prepare 100 mg/ml de ampicilina: En un tubo cónico de 15 ml, combine 1 g de ampicilina con 10 ml de agua desionizada estéril. Esterilícelo con filtro con un filtro de 0,22 μm con una jeringa de 10 ml. Alícuota 1 ml cada uno en 10 tubos de microcentrífuga y almacénelos a −20 °C.
2. Preparación de medios de crecimiento de nematodos (NGM) para el mantenimiento general de C. elegans
   1. Para hacer 50 placas, en un matraz de 1 L, combine 10 g de agar Bacto, 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptona de Bacto y 486 ml de agua ultrapura. Autoclave en un ciclo líquido (121 °C, 15 psig) durante al menos 30 min para esterilizar.
   2. Después del autoclave, después de que el medio se haya enfriado a 55 °C, añadir 12,5 ml de 1 M KP_i, 500 μL de 1 M MgSO₄, 500 μL de 1 M CaCl₂ y 500 μL de 5 mg/ml de colesterol.
   3. Usando una técnica estéril, vierta 10 ml de medio en cada placa de 60 mm (50 en total). Después de que el medio se haya solidificado (al menos 30 minutos después del vertido), pipetear 300 μL de cultivo bacteriano (preparado de acuerdo con los pasos 4 y 10) que se haya cultivado durante la noche en el centro de la placa. Deje la placa en el banco, permitiendo que el cultivo bacteriano se seque y crezca más grueso (1-2 días). Conservar las placas a 4 °C.
3. Prepare la premezcla de medios de crecimiento de nematodos de bajo punto de fusión (lmNGM):
   1. En un matraz de 500 ml, combinar 4 g de agarosa de bajo punto de fusión, 0,5 g de Bacto Peptone y 195 ml de agua ultrapura. Autoclave en un ciclo líquido (121 °C, 15 psig) durante al menos 30 min para esterilizar.
   2. Mientras el medio aún esté fundido, distribuir 10 ml de alícuotas en tubos de ensayo de vidrio estéril. Selle cada tubo de ensayo con Parafilm seguido de una tapa de tubo de ensayo para preservar la premezcla lmNGM y evitar la desecación. El medio se solidificará y se puede almacenar durante ~ 2 semanas en RT antes de su uso.
4. Prepare 142.8 mM de NaCl: En una botella de 250 ml, combine 0.8345 g de NaCl y 100 ml de agua desionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) durante 30 min, y conservar en RT.
5. Preparar solución detergente: En un tubo cónico de 15 ml, combine 3 ml de Tween 20 y 7 ml de agua desionizada estéril. Mezclar bien, filtrar-esterilizar con un filtro de 0,22 μm con una jeringa de 10 ml y almacenar en RT.
6. Prepare la solución de sulfato de cobre: En un frasco estéril de 50 ml, combine 20 ml de agua desionizada estéril, 0,5 g de CuSO₄ y 100 μL de solución detergente (preparada en el paso 1.5). Mezclar hasta que el CuSO₄ se haya disuelto. Tienda en RT.
7. Prepare cristales de poliacrilamida que absorban agua: En una botella de compresión segura para autoclave, combine 150 ml de agua desionizada y 1 g de polímero súper absorbente tipo S. Mezclar suavemente invirtiendo la botella varias veces. Autoclave en un ciclo líquido (121 °C, 15 psig) durante al menos 20 min, y conservar en RT.
8. Prepare caldo de lisogenia (LB): En un vaso de precipitados de 1 L o más, combine 20 g de LB en polvo con 1 L de agua desionizada. Alícuota en dos vasos de precipitados de 500 ml. Autoclave (121 °C, 15 psig) durante 30 min, y conservar en RT
9. Prepare placas de agar caldo de lisogenia (LB):
   1. En un matraz de 1 L, combinar 10 g de LB en polvo, 7,5 g de Agar Bacto y 500 ml de agua desionizada. Autoclave en un ciclo líquido (121 °C, 15 psig) durante 30 min.
   2. Si lo desea, agregue antibióticos opcionales (post-autoclave, después de que el medio se haya enfriado a 55 °C): 500 μL de ampicilina de 100 mg/ml. Utilizando una técnica estéril, verter 20 ml de medio en cada placa de 100 mm (25 en total) y almacenar a 4 °C.

2. Impresión del molde del dispositivo multipozo 3D

NOTA: Cada dispositivo se moldea a partir de PDMS utilizando un molde impreso en 3D personalizado. Un solo molde puede producir tantos dispositivos como sea necesario; sin embargo, si se intenta preparar varios dispositivos al mismo tiempo, se requiere un molde impreso en 3D para que cada dispositivo se haga en paralelo.

1. Descargue el archivo STL (consulte el archivo complementario 1).
2. Imprime el molde con una impresora 3D de alta resolución.
   NOTA: La resolución de la impresora debe ser lo suficientemente alta para permitir volúmenes de pozo y foso consistentes. La resolución de impresora sugerida es una resolución XY mínima de ~40 μm y una resolución de capa de 28 μm. El material utilizado por la impresora 3D es igualmente importante, ya que muchos tipos de materiales evitarán que el PDMS se cure. Por experiencia, los moldes producidos por impresoras PolyJet de alta resolución (resolución: eje X = 600 ppp, eje Y = 600 ppp, eje Z = 1.600 ppp) que utilizan el material de impresión Vero Black funcionan de manera consistente. La impresión 3D de los moldes utilizados en este estudio se subcontrató (los detalles de impresión se pueden encontrar en la Tabla de materiales).

3. Preparación del dispositivo multipozo

NOTA: Esta sección describe cómo se utiliza el molde impreso en 3D para crear el dispositivo PDMS multipocillos.

1. Ajuste el horno de curado a 55 °C para permitir el precalentamiento.
2. Determine el número de dispositivos que se prepararán en un lote. Para cada dispositivo, mezcle 60 g de base PDMS y 6 g de agente de curado en un bote de pesaje grande y desechable (o recipiente desechable similar) utilizando una espátula desechable.
3. Coloque la mezcla PDMS en una cámara de vacío durante 30 minutos a -0,08 MPa para eliminar las burbujas.
4. Vierta la mezcla PDMS en cada molde impreso en 3D. Llene el molde completamente, con la mezcla PDMS extendiéndose ligeramente por encima de la parte superior del molde. Mantenga el exceso de mezcla de PDMS para rellenar el molde en caso de derrames.
5. Coloque el molde lleno y cualquier mezcla adicional de PDMS en la cámara de vacío durante 25 minutos a -0.08 MPa para eliminar cualquier burbuja creada durante el proceso de vertido.
6. Retire el molde lleno de la cámara de vacío y haga estallar las burbujas restantes con una espátula desechable. Use la espátula para cepillar cualquier residuo visible o burbujas restantes en el borde del molde lejos de los pozos. Cualquier residuo o burbuja restante puede interferir potencialmente con las imágenes en los pasos posteriores.
7. Asegúrese de que el molde esté completamente lleno con la mezcla PDMS; Es común que una pequeña porción de la mezcla se derrame mientras está en la cámara de vacío o durante la transferencia. Rellene utilizando la mezcla PDMS adicional que se desgasificó en el paso 3.5. Esto no debe crear burbujas, pero si se forma alguna, se pueden cepillar suavemente hacia el lado del molde con la espátula.
8. Coloque una lámina de acrílico plana encima del molde relleno de PDMS colocando primero un borde y bajando lentamente el otro hasta que el acrílico se asiente plano sobre el molde, desplazando cualquier mezcla de PDMS que se extienda por encima del borde. Si se forman burbujas al colocar la lámina de acrílico, retire lentamente el acrílico, vuelva a llenar el molde con la mezcla de PDMS si es necesario y reinicie la colocación de acrílico. La lámina de acrílico formará un fondo plano para el dispositivo moldeado y asegurará que todos los pocillos estén al mismo nivel en relación con la base.
9. Coloque un peso de 2.5 lb encima del acrílico. Se pueden apilar múltiples moldes, cada uno con una hoja de acrílico separada. Coloque los moldes pesados en el horno y déjelos curar a 55 °C durante la noche.
10. Al día siguiente, retire las pesas y los moldes del horno.
11. Trabaje cuidadosamente una cuchilla de afeitar entre el acrílico y el PDMS curado para romper el sello. Retire con cuidado el acrílico de la parte superior del molde. El PDMS se habrá establecido en este punto, y la eliminación del acrílico puede requerir algo de fuerza.
12. Usando una navaja de afeitar o una espátula de metal, afloje cuidadosamente los lados del PDMS curado del molde. Es fácil romper el PDMS en esta etapa; trabaje lenta y suavemente alrededor del borde para extraer el dispositivo PDMS intacto.
    NOTA: Los moldes recién impresos son particularmente pegajosos para los primeros tres usos, y el PDMS a menudo se rompe al intentar quitar el dispositivo. Con más usos, se hace más fácil eliminar el PDMS curado del molde.
13. Envuelva el dispositivo en papel de aluminio y séllelo con cinta de autoclave. Autoclave en un ciclo seco durante al menos 15 min a 121 °C, 15 psig para esterilizar. Después del autoclave, guarde los dispositivos envueltos en el banco y utilícelos según sea necesario.

4. Rayar las bacterias

NOTA: Comience a preparar las bacterias que se utilizarán como fuente de alimento de los gusanos mientras están en el dispositivo de pocillos múltiples. La bacteria más común es Escherichia coli cepa OP50 (o cepa HT115 para experimentos de ARNi). Complete este paso al menos 2 días antes de agregar los gusanos al dispositivo.

1. Raye las bacterias en una placa LB fresca. Asegúrese de que cualquier aditivo selectivo específico de la cepa (por ejemplo, ampicilina para seleccionar un plásmido que confiera resistencia a la ampicilina a las bacterias) se incluya en las placas LB.
2. Incubar la placa a 37 °C durante la noche (~18 h) para permitir que las colonias crezcan.

5. Preparación del dispositivo multipocillo para la carga de medios

NOTA: La superficie del material PDMS de silicona que compone el dispositivo es hidrófoba, lo que evita que los pozos de pequeño volumen y los fosos aversivos se llenen con NGM y sulfato de cobre, respectivamente. Para evitar este problema, se utiliza un plasma de oxígeno para modificar temporalmente las propiedades de la superficie del dispositivo para que sea hidrófilo, lo que permite que los pozos y el foso se llenen dentro de una ventana de tiempo limitada (hasta ~ 2 h). Esta sección establece los pasos para completar el proceso de limpieza por plasma. Complete este paso al menos 1 día antes de detectar el pozo del dispositivo con bacterias, ya que los efectos persistentes de la limpieza del plasma pueden interferir con el manchado. Dado el tiempo de las secciones 5-7, el límite práctico para estos pasos por técnico es de tres dispositivos en paralelo.

1. Precaliente una incubadora de baño de perlas secas a 90 °C en preparación para la sección 6.
2. Como el volumen total de medios necesario para llenar los pocillos de un dispositivo de pocillos múltiples es pequeño en comparación con el de las placas de Petri, prepare un lote grande de NGM y alícuota en tubos de ensayo (ver paso 1.3).
   NOTA: Esto se puede hacer con anticipación, ya que los tubos de medios se pueden almacenar en el banco durante ~ 2 semanas. Si el soporte se ha preparado y alíficado en tubos, continúe con el paso 5.3.
3. Mientras usa guantes, desenvuelva un dispositivo de pocillos múltiples esterilizado en autoclave; Evite tocar cualquiera de los pozos. Corte una pequeña muesca en la esquina superior derecha del dispositivo para indicar cuántas veces se ha utilizado/reutilizado (consulte la sección 15 a continuación para obtener instrucciones y recomendaciones para limpiar y reutilizar cada dispositivo).
4. Coloque hasta tres dispositivos sin envolver en el limpiador de plasma con los pocillos hacia arriba. Ejecute el limpiador de plasma.
   NOTA: Las siguientes instrucciones detalladas son para el limpiador de plasma Plasma Etch PE-50. Los pasos y ajustes específicos deben adaptarse y posiblemente volver a optimizarse para otros limpiadores de plasma.
   1. Compruebe que el nivel de potencia del limpiador de plasma esté establecido en 75%.
   2. Asegúrese de que las válvulas de ventilación y aislamiento estén en la posición OFF .
   3. Abra la válvula principal del tanque de oxígeno. Espere hasta que la presión del regulador descienda a entre 15 psig y 20 psig, y luego gire la válvula de aislamiento a la posición ON .
   4. Encienda la bomba de vacío y la limpiadora de plasma.
   5. Introduzca los siguientes ajustes en el limpiador de plasma (primer uso) o compruebe que los ajustes programados anteriormente son correctos:
      Tiempo de plasma: 3:00 min
      Punto de ajuste de vacío: 149,5 mTorr
      Respiradero atmosférico: 45 s
      Purga de ventilación: 5 s
      Estabilización de gas: 15 s
      Alarma de vacío: 3:00 min
      Apagado automático: ON
   6. Pulse Intro para ir al menú Comandos. Utilice la tecla de flecha derecha para seleccionar el menú de configuración y, a continuación, presione Entrar. Desplácese por todos los ajustes pulsando Intro para confirmar cada ajuste actual y, a continuación, la flecha derecha para pasar al siguiente ajuste.
   7. Vuelva al menú Comandos pulsando la flecha arriba y, a continuación, la flecha izquierda.
   8. En la pantalla Menú de comandos , presione Entrar. Seleccione Comandos PLASMA pulsando Intro. El sistema pasará por las siguientes fases:
      Bombeo de plasma
      Estabilización de gas: Durante esta fase, ajuste la perilla Gas 1 del limpiador de plasma hasta que el medidor de flujo esté a 10 cc / min.
      Tiempo de plasma
      Purgar bombeo
      Ciclo de plasma completo
      Ventilación de la cámara
      NOTA: Este proceso debería tardar aproximadamente 5-10 minutos en completarse. Cuando se completen todas las fases, el menú de comandos se muestra de nuevo en la pantalla. Si durante la fase de bombeo de plasma, la presión no baja lo suficiente, el limpiador de plasma no pasará a la siguiente fase y la pantalla mostrará un mensaje de error. Si esto sucede, compruebe el aceite de la bomba de vacío. Si los niveles de aceite son bajos o el aceite está turbio / sucio, cambiar el aceite puede permitir que la presión de vacío alcance el nivel necesario.
   9. Apague la válvula principal del tanque de oxígeno.
   10. Muy lentamente, gire la válvula de ventilación a la posición ON y permita que la presión del regulador del tanque de oxígeno vuelva a cero.
   11. Gire la válvula de aislamiento a la posición OFF .
   12. Apague la bomba de vacío y el limpiador de plasma.
       NOTA: La modificación de la superficie hidrofílica del dispositivo multipocillo por el limpiador de plasma es temporal y se vuelve progresivamente menos efectiva con el tiempo (hasta aproximadamente 2 h). Proceda a través de la sección 6 y la sección 7 lo más rápido posible.

6. Llenado de pozos con lmNGM

NOTA: Una incubadora de baño de perlas secas debe estar encendida y precalentada a partir del paso 5.1. Asegúrese de que el baño ha alcanzado los 90 °C.

1. Esterilice una bandeja de poliestireno de un solo pocillo por dispositivo rociando el interior de la bandeja con etanol al 70% y secándola con una toallita de tareas.
2. Retire cada dispositivo del limpiador de plasma con una mano enguantada y colóquelo en una bandeja limpia.
3. Coloque un recipiente de pipeta desechable de 25 ml en la incubadora del baño de perlas después de calentarlo a 90 °C.
4. Reúna un tubo de premezcla lmNGM solidificada por dispositivo que desee llenar (ver paso 1.3).
5. Coloque los tubos de ensayo de premezcla lmNGM en un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml y retire las tapas y el parafilm. Microondas durante ~20 s hasta que el medio se derrita lo suficiente como para verter (la presencia de algunos medios sólidos está bien en esta etapa).
6. Combine la premezcla lmNGM fundida de varios tubos de ensayo en otro vaso estéril de precipitados de 200 ml. Continúe cocinando en el microondas durante 20 s adicionales para alcanzar un total de 40 s. Si la premezcla lmNGM comienza a hervir, detenga el microondas y deje que la premezcla lmNGM se asiente antes de continuar.
7. Retire la premezcla lmNGM fundida del microondas y deje que se enfríe a ~60 °C.
   NOTA: En esta etapa, los medios se enfriarán y se volverán a solidificar después de ~ 5 min. Continúe inmediatamente con los pasos 6.8 y 6.9.
8. Por cada 10 ml de premezcla de lmNGM, añadir lo siguiente (en orden): 250 μL de 1 M KP_i, 10 μL de 1 M MgSO₄, 10 μL de 1 M CaCl₂ y 10 μL de 5 mg/ml de colesterol.
   1. Para evitar la eclosión de huevos al monitorear adultos en el dispositivo, agregue 10 μL de floxuridina a 50 mM.
   2. Para seleccionar un plásmido de ARNi e inducir la expresión del ARN, añadir 5 μL de 50 mg/ml de carbenicilina y 12 μL de 1 mM de IPTG.
      NOTA: Los antibióticos u otros aditivos pueden ser alterados dependiendo del diseño del experimento. Los compuestos / medicamentos de prueba también se pueden agregar a los medios en esta etapa.
9. Vierta el lmNGM fundido en el recipiente de 25 ml en el baño de cuentas.
10. Llene los pocillos del dispositivo con lmNGM utilizando una pipeta repetidora multicanal de 200 μL.
    1. Ajuste el repetidor para dispensar alícuotas de 14 μL (14 μL se pueden dispensar hasta 14 veces si se utiliza una punta de pipeta de 200 μL).
    2. Monte cinco puntas de pipeta. Los pozos del dispositivo tienen el mismo espacio que una placa de 384 pocillos. Las pipetas multicanal estándar están espaciadas de tal manera que el usuario puede pipetear en cualquier otro pocillo en una fila/columna.
    3. Cargue las puntas con lmNGM fundido. Vuelva a dispensar los primeros 14 μL en la cuenca que contiene lmNGM.
    4. Moviéndose rápida pero cuidadosamente, dispense 14 μL en los pocillos interiores (blanco en la Figura 1B), comenzando con los marcados con una "x" en la Figura 1B y moviéndose a través de la placa hacia la derecha y luego hacia abajo, dispensando un total de 12 veces (60 pocillos).
    5. Dispensar el lmNGM restante de nuevo en la cuenca, ya que la alícuota final suele ser inferior a 14 μL.
    6. Repita los pasos 6.10.3-6.10.5 hasta que se hayan llenado todos los pocillos interiores.
    7. A continuación, configure el repetidor para dispensar alícuotas de 15 μL. Repita los pasos 6.10.3-6.10.5, pero en lugar de los pocillos interiores, llene el anillo más externo de pocillos (gris en la Figura 1B), comenzando con los pocillos marcados con "+" en la Figura 1B y moviéndose alrededor del borde exterior de la placa.
       NOTA: Trabaje rápidamente para que el medio no se solidifique en las puntas de la pipeta. Evite derramar cualquier lmNGM en el foso. Los pozos exteriores tienden a secarse más rápidamente. El 1 μL adicional de lmNGM permite que el pozo secado final tenga una superficie nivelada en el mismo tiempo de secado que los pocillos interiores.
11. Como paso de control de calidad, examine cada pozo para identificar aquellos con defectos que pueden interferir con las imágenes, incluidos los pozos que están subllenos (la superficie lmNGM está hundida debajo del borde del pozo), sobrellenos (la superficie lmNGM tiene una parte superior abovedada) y contienen burbujas o escombros.
12. Retire el lmNGM solidificado de los pocillos insatisfactorios con un pico corto de alambre de platino o un aspirador de vacío. Rellene los pozos vacíos con lmNGM fundido fresco. Además, retire cualquier medio que se haya desbordado en el foso con un pico de alambre de platino corto o un aspirador de vacío.

7. Adición de sulfato de cobre al foso

NOTA: Los pozos de este dispositivo están rodeados por un foso continuo. Aquí, el foso está lleno de sulfato de cobre, que actúa como repelente y disuade a los gusanos de huir de sus pozos.

1. Con una pipeta de 200 μL, dispensar 200 μL de solución de sulfato de cobre (ver paso 1.6) en el foso del dispositivo en cada esquina, 2 veces por esquina. Este debe ser un volumen lo suficientemente grande como para que el sulfato de cobre fluya a través de todo el foso. Tenga cuidado de no llenar demasiado el foso en ningún momento; El sulfato de cobre no debe tocar la superficie superior de los pozos.
2. Si el sulfato de cobre no fluye fácilmente a través de todo el foso, use un pico corto de alambre de platino para ayudar a romper la tensión y arrastre el sulfato de cobre a través del foso.
3. Después de que el sulfato de cobre haya fluido a través de la totalidad del foso, retire la mayor cantidad posible de sulfato de cobre del foso utilizando una pipeta de 200 μL o aspiración con vacío. El residuo dejado atrás será suficiente para disuadir a los gusanos de salir de sus pozos. Dejar el foso lleno de solución de sulfato de cobre corre el riesgo de que el sulfato de cobre se derrame en los pozos, lo que haría que los gusanos huyan.

8. Adición de cristales de agua esterilizados en autoclave

NOTA: Para mantener la humedad dentro de la placa y evitar la desecación del lmNGM, cada dispositivo está rodeado de cristales de poliacrilamida absorbentes de agua saturada.

1. Preparar los cristales de agua (ver paso 1.7).
2. Con una botella de presión, agregue los cristales de agua en los espacios entre el dispositivo y las paredes de la bandeja. Cierre la tapa de la bandeja y envuelva los cuatro lados con un trozo de Parafilm. Agregue dos piezas adicionales de Parafilm para sellar completamente la placa.
   NOTA: Los cristales de agua se pueden preparar en un vaso de precipitados y recoger en la bandeja con una espátula esterilizada. Sin embargo, esto agrega tiempo al procedimiento y aumenta el tiempo que cada bandeja está abierta y expuesta a posibles contaminantes.
3. Deje el dispositivo sellado en el banco hasta el día siguiente, cuando las bacterias estén listas para ser detectadas. Asegúrese de que los dispositivos se almacenan con los pocillos hacia arriba después de que se haya agregado el lmNGM.

9. Preparación de una población de gusanos sincronizada por edad

NOTA: Los pasos siguientes producen una población sincronizada de gusanos que están listos para agregar al dispositivo de múltiples pocillos en la cuarta etapa larvaria (L4). Sin embargo, también se pueden agregar gusanos en diferentes etapas de desarrollo. Este paso debe completarse 2 días antes de agregar los gusanos al dispositivo si se desean L4. Ajuste el tiempo de sincronización para la etapa de vida deseada.

1. Para estudios de envejecimiento consistentes, mantener C. elegans en placas NGM estándar (ver paso 1.2 a 20 °C en condiciones bien alimentadas).
2. Obtenga una población sincronizada de animales de una placa de stock a través de métodos estándar, por ejemplo, blanqueo¹⁷ o puesta de huevos cronometrada¹.
3. Agregue huevos aislados a una placa NGM manchada con bacterias. Los huevos eclosionarán en esta placa, y los gusanos alcanzarán la etapa larvaria L4 en 2 días para animales de tipo salvaje.

10. Inocular el cultivo bacteriano

NOTA: Las bacterias se utilizan como la principal fuente de alimento para C. elegans, más comúnmente E. coli cepas OP50 o HT115 . Las bacterias se concentran 10 veces, lo que debe tenerse en cuenta en el volumen del cultivo preparado. Prepare un cultivo bacteriano el día antes de detectar el dispositivo.

1. De la placa LB preparada en el paso 4, escoja una sola colonia e inocule 12 ml de LB estéril por dispositivo a detectar. Incluya agentes selectivos si es necesario para la cepa de bacterias que se está utilizando.
2. Cultivar el cultivo bacteriano durante la noche (~18 h) en una incubadora a 37 °C con agitación a ~250 rpm.

11. Detectar los pozos con bacterias concentradas

NOTA: Se agrega un pequeño volumen de bacterias concentradas a cada pocillo, que es suficiente para alimentar a los gusanos durante toda su vida útil en el dispositivo. El cultivo bacteriano debe secarse antes de que los gusanos puedan agregarse a los pozos. Como el volumen de medios en cada pozo es pequeño (14-15 μL) en relación con el volumen de bacterias agregadas (5 μL), el contenido químico de los medios bacterianos puede afectar el entorno químico del pozo. Para explicar esto, las bacterias se concentran y se resuspenden en agua salada para eliminar el LB agotado y evitar el estrés hipoosmótico. No se agrega sal a la receta lmNGM (consulte los pasos 1.3-1.4) ya que se agrega en esta etapa.

1. Después de cultivar las bacterias durante la noche como se describe en la sección 10, concentrar el cultivo bacteriano 10x. Granular las bacterias centrifugando a ~3.400 x g durante 20 min, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1/10 del volumen de cultivo original de 142,8 mM de NaCl (ver paso 1.4). Por ejemplo, para detectar un dispositivo de 240 pocillos, haga girar 12 ml de cultivo y resuspender en 1,2 ml de 142,8 mM de NaCl.
   NOTA: Se pueden agregar compuestos/medicamentos de prueba al cultivo bacteriano resuspendido antes de la detección.
2. Con una pipeta repetida, localice cada pocillo con 5 μL de las bacterias concentradas. Evite el contacto directo con la superficie lmNGM, ya que la punta de la pipeta puede perforar el lmNGM y permitir que el gusano excave debajo de la superficie del pozo. Tenga cuidado de no dejar que las bacterias se derramen en el foso porque los gusanos se sentirán atraídos por él y huirán al foso.
3. Seque las bacterias manchadas con las tapas de la bandeja retiradas. Este paso es importante para la integridad a largo plazo del entorno del pozo, y hay una variedad de formas de secar los dispositivos manchados. Cualquiera que sea el método utilizado, asegúrese de que el dispositivo permanezca en un ambiente estéril, ya que debe permanecer descubierto mientras las bacterias se secan. El aumento del flujo de aire reduce en gran medida el tiempo de secado. El secado se puede realizar como se describe en los pasos a continuación:
   1. Deje el dispositivo descubierto en un recipiente limpio y sellado, como un recipiente de plástico que se haya limpiado con un 10% de lejía, seguido de un 70% de etanol. Este método de secado puede tardar varias horas.
   2. Coloque los dispositivos descubiertos en una campana de flujo laminar estéril (similar al método preferido a continuación).
   3. Seque los dispositivos utilizando una "caja de secado" hecha a medida (el método optimizado seguido en este estudio), que se puede construir a un costo mínimo utilizando ventiladores de caja de computadora y filtros HEPA (consulte el Archivo complementario 1).
      NOTA: Independientemente del método utilizado, el paso de secado debe optimizarse para el entorno local. Controle con frecuencia la rapidez con que se están secando los pozos hasta que se haya identificado el tiempo de secado típico. En un ambiente de baja humedad, el uso de una caja de secado da como resultado un tiempo de secado de ~ 30-40 min. No deje que las placas se sequen demasiado, ya que los medios en los pozos se encogerán y se hundirán. Es mejor retirar el dispositivo del secado mientras algunos pozos aún están húmedos que dejarlo secar por más tiempo y potencialmente secar en exceso una gran cantidad de pozos.
4. Revisa los cristales de agua. Si la mayoría de los cristales de agua en la bandeja se han secado y han perdido volumen durante el proceso de secado, agregue más a la bandeja.
5. Después de que las bacterias estén secas, agregue los gusanos inmediatamente (sección 12) o selle la bandeja para usarla más tarde. Para sellar, cierre la tapa de la bandeja y envuelva los cuatro lados con una sola pieza de Parafilm. Repita dos veces para un total de tres capas de Parafilm. Después de envolver la bandeja por completo, el dispositivo se puede dejar en el banco a temperatura ambiente hasta 4 días antes de agregar los gusanos (sección 12).

12. Agregar gusanos al dispositivo multipocillo

1. Añadir manualmente un gusano por pocillo a cada pocillo utilizando una púa de platino para transferir los animales de las placas de lombrices preparadas en la sección 9. Solo recoja gusanos que estén en la etapa y edad de vida deseadas.
   NOTA: Tomar más de 1 h para agregar los gusanos al dispositivo puede resultar en la desecación lmNGM, por lo que los gusanos deben agregarse lo más rápido posible. Recoger varios gusanos (20+) a la vez antes de agregarlos a los pozos del dispositivo puede ayudar a aumentar la velocidad.

13. Finalización de la preparación del dispositivo para uso a largo plazo

NOTA: Estos pasos aseguran que los pozos del dispositivo permanezcan hidratados durante la duración del experimento.

1. Examina los cristales de agua. Asegúrese de que los cristales de agua estén nivelados con la parte superior del dispositivo, pero no se desborden sobre él. Agregue cristales de agua adicionales a la bandeja si es necesario.
2. Añadir una gota de detergente preparado (ver paso 1.5) en el interior de la tapa de la bandeja y frotar con una toallita de tareas hasta que la solución detergente se haya secado. Esto evita que se empañe la tapa después de sellar el dispositivo dentro de la bandeja para que los gusanos sean claramente visibles.
3. Envuelva la bandeja con tres piezas de Parafilm utilizando una técnica específica que promueva la integridad a largo plazo del sello Parafilm.
   1. Estire ligeramente un trozo de Parafilm de modo que cubra solo dos lados de la bandeja. Repita esto con una segunda pieza de Parafilm para cubrir los otros dos lados.
   2. En capas sobre la primera capa de Parafilm, tome una pieza final de Parafilm, estírela completamente y envuelva los cuatro lados. Si se sella correctamente, los pocillos del dispositivo deben permanecer hidratados durante ~ 2 meses.
      NOTA: La integridad del Parafilm debe ser monitoreada cada 1-2 semanas, y el Parafilm debe ser reemplazado si está roto.
4. Retire las huellas dactilares de la parte superior de la bandeja con una toallita húmeda con etanol al 70%.

14. Recogida de los datos

NOTA: El propósito de este estudio es describir la metodología de la cultura. Una vez poblados, los dispositivos de múltiples pocillos son compatibles con el monitoreo longitudinal de una variedad de fenotipos. Aquí, se proporciona una guía básica para medir varios de los parámetros más comunes.

1. Vida útil: Controle la vida útil golpeando la placa o exponiendo los gusanos a una luz azul brillante cada 1-3 días. Puntúe como muerto si no se observa movimiento. Estos dispositivos multipocillos también son compatibles con canalizaciones automatizadas de imágenes y análisis para estimar la vida útil^13,18.
2. Actividad: Monitoree la actividad de animales individuales a lo largo de la vida tomando imágenes estáticas o videos de los animales en los pozos del dispositivo y evaluando la distancia recorrida, la velocidad u otras métricas de movimiento. Los dispositivos también son compatibles con canalizaciones automatizadas de imágenes y análisis para estimar la actividad^13,18.
3. Tamaño y forma del cuerpo: Controle los cambios en el tamaño y la forma del cuerpo tomando imágenes estáticas de los animales en los pozos del dispositivo y cuantificando los parámetros visuales utilizando técnicas de imagen estándar. En principio, este método de cultivo debe ser compatible con el software existente para una evaluación más sofisticada de la forma del cuerpo del gusano 19,20,21.

15. Reutilización de los dispositivos

NOTA: Una vez completado un experimento, los dispositivos de múltiples pocillos se pueden limpiar y reutilizar hasta tres veces. La reutilización adicional comienza a afectar los fenotipos de gusanos, posiblemente causada por productos químicos de los medios o bacterias que se acumulan en las paredes del material PDMS.

1. Deseche el Parafilm y retire el dispositivo de la bandeja. Verifique las muescas en la esquina superior derecha del dispositivo, que indican cuántas veces se ha utilizado. Si se ha utilizado tres veces, deseche el dispositivo. Si se ha usado menos de tres veces, límpielo y vuelva a utilizarlo.
   NOTA: Las bandejas están hechas de poliestireno y no están directamente en contacto con el lmNGM, bacterias o cualquier aditivo al medio. Se pueden reutilizar muchas veces siempre y cuando permanezcan visualmente claros.
2. Enjuague los cristales de agua restantes de la bandeja. Rocíe el interior de la bandeja con una solución de lejía al 10% y déjela reposar durante 10 minutos. Enjuague con agua desionizada y seque inmediatamente para evitar manchas de agua.
3. Mantenga el dispositivo bajo agua corriente para comenzar a limpiar los medios de los pozos. Doble y gire suavemente el dispositivo bajo el agua para ayudar a aflojar los medios de los pocillos, pero no se doble tanto que el dispositivo se rompa. Elija cualquier medio restante atascado en pocillos con una punta de pipeta de 200 μL.
4. Llene un vaso de precipitados de 2 L con una barra de agitación ~ 3/4 llena con agua desionizada y lleve a ebullición en una placa caliente.
5. Agregue uno o dos dispositivos de pocillos múltiples y una barra de agitación al agua hirviendo. Encienda la agitación magnética a una velocidad baja (~ 200 rpm) para agitar suavemente los dispositivos en el agua. Deje hervir los dispositivos durante 10 minutos.
6. Retire los dispositivos del agua con pinzas de metal y colóquelos bien inclinados sobre toallas de papel para drenar. Deje que los dispositivos se sequen como mínimo durante la noche.
7. Cuando los dispositivos estén completamente secos, envuélvalos en papel de aluminio y séllelos con cinta de autoclave. Escriba en la cinta de autoclave el número de veces que se ha utilizado el dispositivo. Autoclave en ciclo seco durante 15 min a 121 °C para esterilizar. Los dispositivos ya están listos para su reutilización.

El sistema de cultivo WorMotel se puede utilizar para recopilar una variedad de datos, incluso sobre la vida útil, la duración de la salud y la actividad. Los estudios publicados han utilizado dispositivos de múltiples pocillos para estudiar la esperanza de vida y la duración de la salud 13,14, la quietud y el sueño 22,23,24, y el comportamiento 25. La vida útil se puede calificar manualmente o a través de una colección de imágenes y análisis de imágenes posteriores. En el primer enfoque, los gusanos pueden observarse manualmente después de un estímulo (por ejemplo, golpear la placa o la exposición a la luz azul) cada 1-3 días y marcarse como muertos si no se observa movimiento, similar a los métodos estándar en placas de Petri1. Este último enfoque es similar, excepto que el movimiento del gusano se puede determinar comparando las diferencias fotograma a fotograma entre las imágenes tomadas después de que se haya aplicado el estímulo. Esto proporciona un beneficio adicional en el sentido de que el movimiento proporciona información sobre el nivel de actividad de los animales individuales en ese momento y proporciona una métrica mediante la cual se puede determinar la vida útil (por ejemplo, el cese del movimiento) y la duración de la salud (se han propuesto múltiples definiciones). Las imágenes se pueden utilizar además para extraer parámetros fisiológicos adicionales, como el tamaño corporal, la forma del cuerpo y la postura corporal.

Para demostrar la capacidad del sistema, examinamos la relación epistática clásica entre el receptor de insulina, codificado por el gen daf-2, y el factor de transcripción de la familia FOXO codificado por daf-16 en el contexto de la esperanza de vida, la salud y la actividad diaria de animales individuales. Tipo salvaje (cepa N2) y daf-16(mu68) pérdida de función (cepa CF1038) C. elegans alimentados con E. coli (cepa HT115) expresando control (vector vacío; EV) o construcciones de alimentación de ARNi daf-2 se cultivaron en dispositivos de múltiples pocillos, y cada animal fue monitoreado durante la vida útil (Figura 2A), la salud (Figura 2B) y la actividad diaria (Figura 2C). La actividad se monitoreó diariamente tomando una serie de imágenes fijas cada 5 s durante 2 min, con los gusanos expuestos a luz azul brillante durante 5 s a 1 minuto para estimular la actividad (según Churgin et al.13). La actividad diaria de cada animal se estimó normalizando el fondo a través de pozos e imágenes, identificando el área del gusano en cada imagen y calculando el cambio en el área entre imágenes adyacentes. La esperanza de vida se definió como la edad a la que se observó la actividad por última vez para cada gusano, y la duración de la salud se definió como la edad en la que un gusano ya no podía moverse a lo largo de todo el cuerpo. Como se esperaba de numerosos estudios previos (por ejemplo, Kenyon et al.26, Murphy et al.27), la mutación daf-16 (mu86) resultó en una vida útil corta e impidió la extensión de la vida útil de la eliminación de ARNi de daf-2 (Figura 2A). Se observó un patrón similar para la duración de la salud (Figura 2B). Como ventaja de utilizar sistemas de cultivo de dispositivos de múltiples pocillos, la capacidad de rastrear animales individuales a lo largo de la vida permite un análisis detallado de la variación individual en cada fenotipo medido en toda la población. Por ejemplo, la variación en la esperanza de vida y la duración de la salud entre animales individuales se puede comparar en términos absolutos (Figura 2D) o como una fracción de la vida útil total (Figura 2E). Los fenotipos de vida temprana se pueden comparar aún más con los fenotipos de vida tardía, incluida la vida útil, en animales individuales de una población. Por ejemplo, la actividad acumulada para cada animal individual a lo largo de la vida (es decir, el área bajo la curva [AUC] para la actividad individual) se correlacionó mejor con la vida útil (Figura 2F) que la vida acumulada hasta el día 5 de vida (Figura 2G) en todas las condiciones medidas. Enfatizamos que el propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado para construir el entorno de múltiples pozos para rastrear animales individuales a lo largo del tiempo, no para medir un fenotipo específico utilizando el dispositivo. Los resultados representativos presentados en la Figura 2 proporcionan solo un ejemplo de los fenotipos que se pueden medir en este sistema. Una vez construido, el entorno de múltiples pozos es compatible con una amplia gama de técnicas para medir los fenotipos de gusanos de rastreo libre en medios sólidos.

Figura 1: Esquema de los dispositivos microfabricados de múltiples pocillos. (A) Los C. elegans individuales se cultivan en almohadillas de agarosa sólidas de medios de crecimiento de nematodos de bajo punto de fusión (lmNGM) sembradas con alimentos bacterianos en pocillos individuales. El espacio entre los pozos está recubierto con un químico aversivo (sulfato de cobre) para aislar cada gusano dentro de su pozo. Cada dispositivo está asegurado dentro de una bandeja de un solo pozo. El perímetro de la bandeja se llena con cristales de agua para mantener la humedad. La bandeja está sellada con Parafilm para permitir el intercambio de oxígeno. Imagen creada con BioRender.com. (B) Descripción general del dispositivo de pozos múltiples indicando el orden sugerido para cargar los pozos. Los pocillos interiores (blancos) reciben 14 μL de lmNGM. Los pocillos exteriores (grises) reciben 15 μL de lmNGM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Correlación de fenotipos medidos entre poblaciones en animales individuales utilizando dispositivos de múltiples pocillos. Todos los paneles proporcionan datos del mismo experimento que compara cuatro grupos de animales: animales de tipo salvaje (N2) sujetos al vector vacío EV(RNAi) (N = 138), animales salvajes sujetos a daf-2(RNAi) (N = 151), daf-16(mu86) sujetos a EV(RNAi) (N = 123), y daf-16(mu86) sujetos a daf-2(RNAi ) (N = 135). (A) La extensión de la vida útil de daf-2 (RNAi) está bloqueada por la mutación nula daf-16 (mu86). Significación por pares entre grupos determinada por la prueba de rango logarítmico (función survdiff en R). (B) La duración de la salud definida aquí como el día en que un animal ya no puede mover una extensión de longitud de cuerpo completo de daf-2 (ARNi) está bloqueada por la mutación nula daf-16 (mu86). Significación por pares entre grupos determinada por la prueba de rango logarítmico (función survdiff en R). (C) La media móvil de actividad de 3 días a lo largo de la vida útil se reduce tanto en daf-16 (mu86) como en daf-2 (ARNi). Significación calculada por la prueba U de Mann-Whitney para comparar el área bajo la curva para la actividad a lo largo de la vida de animales individuales entre grupos. (D) Esperanza de vida y esperanza de vida para cada población como valores absolutos (media ± error estándar de la media). (E) Esperanza de vida y esperanza de vida para cada población normalizada a la esperanza de vida total dentro de cada grupo (media ± error estándar de la media). (F) La actividad acumulada a lo largo de la vida (área bajo la curva [AUC] a lo largo de la vida) para animales individuales se correlaciona mejor con la esperanza de vida que (G) la actividad para animales individuales en cualquier día específico a lo largo de la vida (se muestra la correlación de actividad en el día 8, que representa el punto en el que se maximiza la actividad media), calculada por regresión lineal (función lm en R). n.s. = no significativo, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Todos los valores de p se ajustaron para comparaciones múltiples utilizando el método de Bonferroni para las comparaciones realizadas dentro de cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Archivo STL para imprimir el molde del dispositivo 3D multipozo Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores afirman que no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.