Examen de leucocitos positivos para peroxidasa en el semen

La infertilidad se ha convertido en un problema de salud pública mundial que afecta aproximadamente al 15% de las parejas en edad reproductiva. Los factores masculinos son aportados por alrededor del 50% del total de los casos de subfertilidad, y entre el 20% y el 30% pueden atribuirse únicamente a factores masculinos ^1,2,3. Las infecciones del tracto genital masculino (ITMG) constituyen una de las causas significativas de infertilidad masculina, representando alrededor del 15% de los casos ^4,5.

La mayoría de los individuos tienen leucocitos en su semen, constituyendo el 13% de las células no espermatozoides, siendo las proporciones diferenciales neutrófilos 12%, macrófagos 0,9% y linfocitos 0,1%^6,7. De acuerdo con el manual de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el examen y procesamiento del semen humano (5ª ed.), la leucocitopsia suele definirse como la presencia de >1 × 10⁶ células/ml de leucocitos en el semen⁸. Esta afección puede ser causada por numerosos factores, como toxinas ambientales, abuso de sustancias, varicoceles, MGTI, etc., todos los cuales pueden conducir a un aumento anormal de la concentración de leucocitos en el semen⁹. Los leucocitos pueden elevar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el semen, causando peroxidación lipídica y daño oxidativo a las proteínas y al ADN, lo que resulta en una disminución de la motilidad de los espermatozoides, un aumento de las anomalías morfológicas de los espermatozoides, un índice elevado de fragmentación del ADN de los espermatozoides, un deterioro de la función del acrossoma de los espermatozoides e incluso impactos negativos en el desarrollo embrionario^10,11.

En la actualidad, los andrólogos suelen optar por examinar las células redondas del semen o la elastasa del plasma seminal al identificar la inflamación del tracto genital. Sin embargo, a menudo es difícil distinguir las células espermatogénicas desprendidas y las células epiteliales del tracto reproductivo, que no contribuyen a reducir el uso indiscriminado e innecesario de antibióticos⁶. Este último método de examen es relativamente complicado y requiere mucho tiempo, con un informe lento de los resultados, lo que no es beneficioso para el diagnóstico y tratamiento tempranos de enfermedades como las MGTI. La Asociación Americana de Urología (AUA, por sus siglas en inglés) sugiere una mayor diferenciación entre los leucocitos y las células desprendidas del tracto genital cuando la concentración de células redondas en el análisis de semen es superior a 1 × 10⁶ células/mL¹². Algunos laboratorios de andrología utilizan la citometría de flujo¹³ o la inmunocitoquímica del antígeno leucocitario (por ejemplo, CD45)¹⁴ para examinar los leucocitos. Si bien estos métodos son precisos, son costosos y requieren mucho tiempo, lo que dificulta la implementación clínica a gran escala, especialmente en los países en desarrollo.

La peroxidasa está ampliamente distribuida en varios tipos de células y desempeña un papel crucial en la resistencia al daño por estrés oxidativo. La mieloperoxidasa (MPO) es un miembro de la subfamilia de las peroxidasas que generalmente se expresa en las células inmunitarias. Se expresa más en los gránulos azurófilos^de los neutrófilos ^15,16 y también se expresa en linfocitos^17,18, monocitos y macrófagos¹⁹. La concentración de leucocitos, especialmente neutrófilos, en el semen puede obtenerse mediante el examen de células redondas que son peroxidasas positivas ^7,20. Para que el proceso de examen de leucocitos en semen sea económico, conveniente y eficiente, rediseñamos el método de examen. Con la ayuda del sistema de análisis de semen asistido por ordenador (CASA), se puede obtener la concentración de leucocitos en 60 minutos. Este nuevo método reduce los costos de examen de los pacientes y el tiempo de espera para obtener los resultados, alivia la carga de trabajo de los técnicos de laboratorio y acorta el período de espera del diagnóstico y tratamiento del médico.

Este estudio ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética Médica del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen.

1. Preparación de la solución de trabajo

1. Reúna los siguientes reactivos esenciales para preparar la solución de trabajo: solución de sustrato de orto-toluidina, solución saturada de cloruro de amonio (NH₄Cl), solución de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (Na₂EDTA) de 148 mmol/L y solución de peróxido de hidrógeno al 6% (v/v). Colóquelos en una mesa de laboratorio a temperatura ambiente (RT) junto con las herramientas necesarias, como pipetas de transferencia (1000 μL, 200 μL, 10 μL) y gradillas para tubos de ensayo.
   PRECAUCIÓN: Lea la hoja de datos de seguridad (FDS) antes de manipular los reactivos mencionados anteriormente.
2. Prepare un frasco de reactivo de color marrón opaco para almacenar y proteger la solución de trabajo preparada de la exposición a la luz.
3. Transfiera los reactivos al frasco de reactivo marrón opaco según las proporciones especificadas a continuación:
   1. Utilice la pipeta de transferencia de 200 μL y ajuste la escala a 100 μL girando la perilla. A continuación, transfiera 100 μl de la solución de NH₄Cl al frasco de reactivo marrón opaco.
   2. Sustituya la punta de la pipeta y transfiera 100 μl de la solución de 148 mmol/L de Na₂EDTA al frasco de reactivo marrón opaco utilizando la pipeta de transferencia de 200 μl mencionada anteriormente. Luego, sople suavemente pipeteando y homogeneice completamente la solución.
   3. Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 900 μL girando la perilla. A continuación, transfiera 900 μL de la solución de sustrato de orto-toluidina al frasco de reactivo marrón opaco, sople suavemente mediante pipeteo y homogeneice completamente la solución.
   4. Utilice la pipeta de transferencia de 10 μL y ajuste la escala a 5 μL girando la perilla. A continuación, transfiera 5 μL de la solución de peróxido de hidrógeno al 6% (v/v) a la botella de reactivo marrón opaco.
4. Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 1000 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, sople suavemente pipeteando y homogeneice completamente la solución en el frasco de reactivo marrón opaco.
5. Guarde la solución de trabajo lista para usar en el frasco de reactivo marrón opaco en RT, lejos de la luz. La solución de trabajo es reactiva durante 24 h.
6. Cada muestra de semen requiere 900 μL de la solución de trabajo. Asegúrese de que la cantidad de la solución de trabajo preparada cada día corresponda al número de muestras examinadas diariamente.

2. Preparación de la muestra de semen

1. Antes de recolectar la muestra de semen, asegúrese de que el paciente se haya abstenido de eyacular durante 2 a 7 días, como lo requiere el manual de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para examinar y procesar el semen humano (5ª ed.) ⁸. La masturbación es el método preferido para obtener muestras de semen. Para mejorar la precisión del examen, indique al paciente que recoja todo el semen eyaculado.
2. Encienda el soporte de temperatura constante y caliente hasta 37 °C con antelación para que la licuefacción posterior de la muestra de semen pueda realizarse sin problemas.
3. Al recibir la muestra de semen del paciente, registre meticulosamente la información detallada, incluido el código de identificación, el tiempo de recolección, la duración de la abstinencia y otra información pertinente, en la pared exterior del receptáculo a base de polímero.
4. Coloque el recipiente a base de polímero que alberga la muestra de semen en el soporte de temperatura constante precalentado a 37 °C, lo que es beneficioso para la licuefacción del semen.
5. Extraer la muestra de semen en una pipeta a base de polímeros y observar el estado de licuefacción cada 5 min hasta que la muestra de semen esté completamente licuada.
6. Si la muestra de semen no se ha licuado completamente en 30 minutos, no realice el examen todavía; Continúe esperando otros 30 minutos. Si el semen aún no está completamente licuado después de 60 minutos, agregue un volumen igual de solución tampón de fosfato para una dilución 1:1 y agite suavemente para promover la licuefacción.
7. Después de una agitación minuciosa y una homogeneización constante, conserve la muestra de semen completamente licuada para los procedimientos de examen posteriores.

3. Tinción de los leucocitos positivos para peroxidasa y análisis de la muestra de semen original

1. Antes de la toma de muestras, utilice una pipeta a base de polímeros para soplar repetidamente mediante pipeteo y homogeneizar completamente la muestra de semen que se está examinando.
2. Utilice la pipeta de transferencia de 200 μL y ajuste la escala a 100 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta y, a continuación, transfiera 100 μl de la muestra de semen a un tubo de centrífuga.
3. Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 900 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta y, a continuación, transfiera 900 μL de la solución de trabajo mencionada anteriormente al tubo de centrífuga.
4. Soplar repetidamente mediante pipeteo y homogeneizar completamente el reactivo, que consiste en la muestra de semen y la solución de trabajo, utilizando la pipeta de transferencia de 1000 μL.
5. Coloque el tubo de centrífuga en una rejilla de tubos de ensayo sobre un agitador bidimensional y sométalo a agitación continua a 200 rpm durante 30 minutos a RT.
6. Mientras espera la reacción de tinción, analice la muestra de semen utilizando el sistema CASA para determinar la concentración de espermatozoides en la muestra de semen original en el receptáculo a base de polímero.
   1. Encienda el interruptor de encendido del sistema CASA y haga doble clic en el icono SCA SCOPE para abrir el software de la aplicación.
   2. Antes de tomar muestras, sople repetidamente mediante pipeteo y vuelva a homogeneizar completamente la muestra de semen original con una pipeta a base de polímeros.
   3. Utilice la pipeta de transferencia de 10 μL y ajuste la escala a 10 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, pipetee hasta 10 μL de la muestra de semen original y colóquela en la cámara de recuento de SCA. Espere 60 s para que la muestra de semen deje de desplazarse.
   4. Coloque la cámara de recuento SCA en el portamuestras del sistema CASA y coloque la información del paciente en el cuadro de diálogo del software de aplicación para prepararse para el examen formal.
   5. Examine la muestra de semen original en la cámara de recuento de SCA con el sistema CASA haciendo clic en el botón Inicio y registre los datos necesarios, como la concentración de espermatozoides.

4. Observación de los leucocitos y espermatozoides positivos a peroxidasa

1. Utilice la pipeta de transferencia de 1000 μL y ajuste la escala a 1000 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, sople repetidamente pipeteando y homogeneice completamente el reactivo, que consiste en una muestra de semen y una solución de trabajo en el tubo de centrífuga nuevamente al final del proceso de reacción de 30 minutos.
2. Utilice la pipeta de transferencia de 10 μL y ajuste la escala a 10 μL girando la perilla. Vuelva a colocar la punta de la pipeta, pipetee hasta 10 μL del reactivo mencionado anteriormente y colóquelo en la cámara de recuento de espermatozoides. Por último, cubra la cámara de recuento de espermatozoides con un cubreobjetos de vidrio específico.
3. Coloque la cámara de recuento de espermatozoides en la platina microscópica y encienda el interruptor de encendido del microscopio óptico con dos oculares de 10x. A continuación, espere 60 s para que la muestra de reactivo deje de desplazarse.
4. Cambie el convertidor microscópico a la lente del objetivo de 10x durante el tiempo de espera. A continuación, ajuste la perilla de ajuste grueso y la perilla de ajuste fino en secuencia. Por último, observe los espermatozoides y las células redondas con un aumento de 10×10.
5. Cambie el convertidor microscópico a la lente del objetivo de 40x después de determinar el campo de visión que se va a analizar, y observe los espermatozoides y los leucocitos marrones positivos a peroxidasa con un aumento de 10 × 40.
6. Utilice el sistema de contador electrónico para contar al menos 200 espermatozoides y el número de leucocitos marrones positivos para peroxidasa dentro de los campos correspondientes.

5. Cálculo de la concentración de leucocitos peroxidasa positivos

1. Calcule la concentración de leucocitos positivos para peroxidasa mediante la siguiente fórmula:
   

Al implementar el procedimiento antes mencionado, el reactivo en el tubo de centrífuga con frecuencia manifiesta una apariencia subtranslúcida y opalescente (Figura 1). La detección de un color marrón evidente revela una posible degranulación de los leucocitos, lo que puede dar lugar a la tinción de líquidos. En consecuencia, el proceso de tinción podría fallar, lo que haría necesario volver a teñir o recolectar una nueva muestra de semen para volver a analizar21.

Los leucocitos positivos para peroxidasa mostraron un tono marrón, que contrasta con las células redondas ordinarias no teñidas (Figura 2, diapositiva ordinaria). Posteriormente, se contaron todos los espermatozoides y leucocitos marrones bajo el campo microscópico actual antes de cambiar a un campo completamente nuevo para la observación y el recuento continuos. Para garantizar una precisión óptima, es necesario contar un mínimo de 200 espermatozoides y los leucocitos presentes en el campo de visión correspondiente.

Figura 1: Solución reactiva. El reactivo que completa el proceso de reacción es un líquido opalescente subtranslúcido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Observación bajo microscopio óptico (portaobjetos ordinarios). (A) Leucocitos peroxidasa positivos y (B) células redondas ordinarias observadas en un microscopio óptico de 10 x 40 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.