Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones

Estudios previos encontraron que el hipocampo es una estructura cerebral esencial para procesar y recuperar recuerdos ^1,2. Desde la década de 1950, los circuitos neuronales del hipocampo en roedores han sido un foco en el estudio de la formación, almacenamiento y^{recuperación de la} memoria. Las estructuras anatómicas dentro del hipocampo incluyen las subregiones del giro dentado (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 y subículo⁴. Existen conexiones bidireccionales complejas entre estas subregiones, de las cuales DG, CA1 y CA3 forman un circuito trisináptico prominente que consta de células granulosas y células piramidales⁵. Este circuito recibe su entrada primaria de la corteza entorrinal (EC) y ha sido un modelo clásico para estudiar la plasticidad sináptica. Las investigaciones previas in vivo sobre la función del hipocampo se han concentrado principalmente en el CA1 ^6,7 debido a su fácil acceso. Si bien las neuronas CA1 desempeñan un papel importante en la formación, consolidación y recuperación de la memoria, particularmente en las células de lugar para la memoria espacial, otras subregiones del hipocampo también son vitales ^8,9. En particular, estudios recientes han puesto de relieve las funciones de la DG en la formación de la memoria. Se ha informado de que las células de lugar en DG son más estables que las de CA1¹⁰, y sus actividades reflejan información específica del contexto¹¹. Además, el marcaje dependiente de la actividad de las células granulosas DG puede reactivarse para inducir comportamientos relacionados con la memoria¹². Por lo tanto, para obtener una comprensión más profunda de la codificación de la información en DG, es crucial investigar las actividades de la subregión de DG mientras el animal lleva a cabo tareas dependientes de la memoria.

Los estudios previos de las actividades de DG han utilizado principalmente la electrofisiología in vivo ¹³. Sin embargo, esta técnica tiene algunos inconvenientes: en primer lugar, en las grabaciones eléctricas, puede ser difícil identificar directamente los distintos tipos de células que generan la señal. Las señales registradas provienen tanto de células inhibidoras como excitadoras. Por lo tanto, se requieren más métodos de procesamiento de datos para separar estos dos tipos de células. Además, es difícil combinar otra información de tipo de célula, como los subgrupos específicos de la proyección o el etiquetado dependiente de la actividad, con registros eléctricos. Además, debido a la morfología anatómica de la DG, los electrodos de registro a menudo se implantan en una dirección ortogonal, lo que limita en gran medida el número de neuronas que se pueden registrar. Por lo tanto, es difícil que los registros eléctricos logren monitorear cientos de neuronas individuales de la estructura DG en el mismo animal¹⁴.

Una técnica complementaria para registrar las actividades neuronales en DG es el uso de imágenes de calcio in vivo ¹⁵. Los iones de calcio son fundamentales para los procesos de señalización celular en los organismos, desempeñando un papel crucial en muchas funciones fisiológicas, especialmente dentro del sistema nervioso de los mamíferos. Cuando las neuronas están activas, la concentración de calcio intracelular aumenta rápidamente, lo que refleja la naturaleza dinámica de la actividad neuronal y la transmisión de señales. Por lo tanto, el registro de los cambios en tiempo real en los niveles de calcio intracelular en las neuronas proporciona información importante sobre los mecanismos de codificación neuronal.

La tecnología de imágenes de calcio utiliza tintes fluorescentes especializados o indicadores de calcio modificados genéticamente (GECI) para monitorear las concentraciones de iones de calcio en las neuronas mediante la detección de cambios en la intensidad de la fluorescencia, que luego se pueden capturar a través^{de imágenes} microscópicas. Comúnmente, se emplea la familia GCaMP de genes indicadores de calcio, que comprende secuencias de proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina y polipéptidos M13. GCaMP puede emitir fluorescencia verde cuando se une a los iones de calcio¹⁷, lo que permite registrar las fluctuaciones en la fluorescencia verde a través de imágenes¹⁸. Además, para obtener imágenes claras de la región del cerebro objetivo, se suele implantar una lente de índice de gradiente (lente GRIN) sobre la región de interés. La lente GRIN permite obtener imágenes de la región profunda del cerebro a la que no se puede acceder directamente desde la superficie.

Esta técnica es relativamente fácil de combinar con otras herramientas genéticas para etiquetar diferentes tipos de células. Además, como el plano de imagen es paralelo a la orientación de las células en DG, cientos de neuronas son accesibles para la obtención de imágenes con cada cirugía exitosa. En este trabajo presentamos un protocolo quirúrgico completo y detallado para la obtención de imágenes de calcio in vivo en el giro dentado en ratones (Figura 1). El procedimiento implica dos operaciones principales. La primera es inyectar el virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f en el DG. La segunda operación consiste en implantar una lente GRIN sobre el lugar de la inyección del virus. Estos dos procedimientos se llevan a cabo en la misma sesión. Después de la recuperación de estas cirugías, el siguiente paso es verificar la calidad de las imágenes con microscopios miniaturizados (miniscopios). Si el campo de imagen tiene cientos de células activas, el procedimiento posterior es fijar la placa base del miniscopio al cráneo del ratón con cemento dental; A continuación, el ratón se puede utilizar para experimentos de imagen. También presentamos una línea de preprocesamiento basada en MATLAB para agilizar el análisis de los datos de calcio recopilados.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan (202109004S). Todos los animales utilizados en este estudio fueron C57BL/6J de 6 meses de edad; Se utilizaron ambos sexos. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz de 12 horas, de 8 a.m. a 8 p.m. Utilizamos las siguientes coordenadas para la inyección del virus en DG: A/P: -2,2 mm, M/L: 1,5 mm, D/V: 1,7 mm de la superficie cerebral.

1. Inyección de virus en la circunvolución dentada

1. Use equipo de protección, incluidos guantes y batas estériles de un solo uso.
2. Prepare el instrumental quirúrgico necesario, dos tubos de 5 mL de solución salina (NaCl al 0,9% [estéril] o líquido cefalorraquídeo artificial) y dos agujas romas Luer Lock de 25 G.
   NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos deben estar completamente esterilizados antes de la operación. Utilizamos autoclave a alta temperatura (121-134 °C) y presión (20 psi) para esterilizar el instrumental quirúrgico. Además, rociamos las superficies con desinfectantes a base de alcohol. En todos los procedimientos quirúrgicos se utilizó suero fisiológico estéril al 0,9%. Los instrumentos se esterilizaron intermitentemente durante la cirugía con perlas de vidrio calentadas.
3. Prepare una solución de lejía al 10% en agua para desinfectar cualquier suministro que pueda entrar en contacto con el virus.
4. Diluir el virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f si es necesario, utilizando solución salina esterilizada, y almacenarlo en el refrigerador a 4 °C o en hielo. El título final objetivo del virus es de 1 × 10¹² GC/mL.
   NOTA: Recomendamos evitar los ciclos repetidos de congelación y descongelación del virus para preservar la integridad del virus. Con este fin, generalmente alícuotas el virus cuando se recibe del fabricante en pequeños volúmenes (por ejemplo, 2 μL por tubo) y los mantenemos en un congelador a -80 °C. El virus debe usarse el día de la descongelación y no debe almacenarse a 4 °C para su uso a largo plazo.
5. Utilice un extractor de micropipetas para tirar de la micropipeta hasta una punta fina, corte una pequeña porción de la punta con unas tijeras quirúrgicas y llene el tubo con aceite mineral. Asegúrese de que la pipeta pueda succionar líquido normalmente y, a continuación, instálela en el inyector.
   NOTA: Utilizamos un método de tracción de un solo paso con el calentador configurado a ~ 60% de la potencia máxima. Se pueden usar otros tiradores para este paso. El objetivo general es hacer que la punta tenga ~50-100 μm de diámetro; un diámetro demasiado pequeño afectará el flujo del líquido; Demasiado grueso puede causar daño al tejido cerebral del ratón.
6. Encienda todos los instrumentos, incluida la máquina de anestesia del mouse, la máquina de mantenimiento de temperatura (almohadilla térmica) y la bomba de vacío. Además, mida el peso corporal de los ratones antes de la cirugía.
   NOTA: Durante el procedimiento, monitoreamos visualmente la respiración del ratón y ocasionalmente verificamos la temperatura corporal para asegurarnos de que estuvieran en buenas condiciones.
7. Coloque el ratón en la cámara de gas con un 2,5% de isoflurano y 1 L de oxígeno/min. Controle las condiciones respiratorias del ratón para medir el estado de la anestesia.
   NOTA: La frecuencia respiratoria debe ser de aproximadamente 1 respiración/s para mantener al ratón en buen estado de salud.
8. Saque el ratón de la cámara de gas y colóquelo en el aparato estereotáxico.
9. Asegúrese de que el mouse esté adecuadamente anestesiado antes de comenzar la siguiente operación. Pruebe el reflejo de retirada del pedal pellizcando las almohadillas de ambos pies traseros. Si el ratón responde al pellizco de la almohadilla del pie, administre anestesia adicional y vuelva a probar el reflejo antes de continuar.
10. Cubra la nariz del ratón con una mascarilla y ajuste el caudal de isoflurano al 1,5%. Fije la cabeza del ratón firmemente con las barras de las orejas (Figura 2A).
    NOTA: Tenga cuidado de no fijar las barras de los oídos demasiado apretadas en el mouse, ya que esto podría afectar fácilmente la respiración del mouse y, en algunos casos, causar la muerte.
11. Recorta la parte superior de la cabeza del ratón con unas tijeras quirúrgicas y usa crema depilatoria para eliminar los restos de vello hasta que la piel quede completamente expuesta. Aplique la crema depilatoria en el cuero cabelludo del ratón, déjela reposar durante aproximadamente 5 minutos y use una gasa para limpiar la crema.
12. Aplica ungüento oftálmico en los ojos del ratón.
13. Desinfecte el área sin vello con desinfectante de yodóforo y etanol al 75% con hisopos de algodón.
14. Haga una incisión continua a lo largo de la línea media del cuero cabelludo con unas tijeras quirúrgicas (o una hoja de bisturí) y corte parte del cuero cabelludo para exponer la superficie del cráneo (Figura 2B). Enjuague la superficie del cráneo con solución salina; A continuación, elimine la fascia y el exceso de solución salina con una bomba de vacío. Repite este proceso varias veces hasta que el área alrededor de la herida deje de sangrar. Limpie la superficie del cráneo con hisopos de algodón para mantenerlo seco.
    NOTA: Hay otras formas de quitar la fascia, como limpiarla con una bola de algodón o un hisopo de algodón.
15. Utilice la aguja de localización para ajustar la superficie craneal cuando el bregma y la lambda sean visibles. Realice varios ajustes hasta que toda la cabeza esté nivelada (el error total en la dirección del eje Z es inferior a 0,05 mm).
16. Mueva la punta de la aguja desde el bregma hasta la posición objetivo adecuada. Para las coordenadas de destino, utilice el bregma como punto de referencia. Marque los cuatro puntos para definir el perímetro del sitio de inyección del virus: A/P: -2,0 mm, M/L: -1,5 mm; A/P: -2,5 mm, M/L: -1,5 mm; A/P -2,25 mm, M/L: -1,0 mm; y A/P -2,25 mm, M/L: -2,0 mm, con rotulador borrable.
    NOTA: Este protocolo realiza la inyección del virus y el implante de lentes GRIN en la misma cirugía. En este protocolo, todas las cirugías se realizaron en el hemisferio derecho, pero es concebible que se pueda utilizar cualquiera de los dos hemisferios. Dentro del área de inyección definida por los cuatro puntos mencionados anteriormente, inyecte el virus en tres dosis separadas de 80 nL en diferentes lugares. Aunque las tres ubicaciones se eligieron arbitrariamente, recomendamos que se dispersen para una mejor propagación del virus. Esto aumentará el número de células infectadas.
17. Realice la craneotomía en la región con el microdrill y establezca estos cuatro puntos como borde. Deje de perforar cuando el tejido cerebral sea visible (Figura 2C).
    NOTA: Trate de perforar el cráneo lentamente. La broca puede dañar el tejido cerebral debido a una fuerza excesiva. La perforación lenta también puede prevenir el sobrecalentamiento del cerebro.
18. Retire los restos óseos y la duramadre con pinzas ultrafinas y enjuague constantemente esta área con solución salina estéril.
    NOTA: Es normal que ocurra una pequeña cantidad de sangrado durante este paso, ya que algunos capilares se rompen; Solo sigue enjuagando con solución salina hasta que no haya más sangrado.
19. Utilice el panel de control del inyector para expulsar un poco de aceite mineral para generar el espacio necesario para la posterior carga del virus. Llene la micropipeta con al menos 240 nL del virus diluido a una velocidad de 100 nL/s.
    NOTA: Las burbujas de aire en el tubo deben descargarse utilizando el panel de control para garantizar que la micropipeta dispense la cantidad adecuada de líquido. Si el volumen de líquido sigue siendo inexacto después de varios intentos, considere la posibilidad de cambiar la micropipeta y empezar de nuevo. Recomendamos aspirar algún virus adicional al volumen real de inyección; Este enfoque evita la inyección inadvertida de aceite mineral en el cerebro del ratón.
20. Mueva la micropipeta por encima de la región de la craneotomía; luego, muévalo lentamente hacia abajo en el tejido cerebral hasta el eje Z objetivo de D / V: 1,70 mm por debajo de la superficie del cerebro.
    NOTA: Muchos atlas de referencias utilizan la superficie del cráneo como D/V 0. En nuestra experiencia, el uso de las coordenadas de la superficie del cerebro produjo una orientación más fiable para la DG.
21. Utilice el panel de control para configurar el inyector para inyectar 80 nL del virus a un caudal de 1 nL/s (Figura 2D). Haga clic en el botón INYECTAR en el panel de control para inyectar el virus. Posteriormente, seleccione otras dos posiciones dentro de la craneotomía y repita la operación anterior.
    NOTA: Cada inyección tarda ~2 min. Después de terminar la inyección, espere 8-10 minutos adicionales antes de pasar a otra posición. Cuando se produzca sangrado durante la extracción, lávese rápidamente con solución salina.
22. Retire lentamente la micropipeta del cerebro (Figura 2E).

2. Implante de lentes GRIN en el giro dentado

NOTA: Realice este paso inmediatamente después de completar la inyección viral de 240 nL.

1. Desinfectar la lente GRIN de 1 mm de diámetro en etanol al 75% durante 20 min; Enjuáguelo adecuadamente con solución salina antes de la implantación.
2. Expanda la craneotomía con el microtaladro para aumentar la abertura en la dirección A/P a aproximadamente 1 mm. Limpie los escombros con solución salina.
3. Sujete la lente GRIN en su lugar con un soporte y asegúrese de exponer una longitud adecuada.
   NOTA: Es fácil pegar el soporte a la lente GRIN al fijarlo en el cráneo usando resina UV en los pasos siguientes. Sin embargo, esto se puede evitar si la longitud expuesta de la lente es adecuada.
4. Utilice el soporte para mover la lente GRIN por encima de la región de la craneotomía. Establezca la posición del eje Z en cero cuando la parte inferior de la lente GRIN toque la superficie del tejido cerebral. A continuación, retira el soporte de la lente GRIN y déjalo a un lado.
5. Conecte la aguja roma Luer Lock de 25 G al tubo de succión de la bomba de vacío y ajuste la presión a 0,04 MPa.
   NOTA: Si este paso se realiza por primera vez, la presión se puede reducir adecuadamente para aspirar lentamente el tejido cerebral.
6. Succionar el tejido encefálico girando la punta de la aguja roma muy por encima del tejido encefálico y presionar suavemente sobre el tejido encefálico para facilitar la aspiración. Enjuague con solución salina (almacenar a 4 °C) continuamente durante la succión para mantener una visión clara del cerebro. Observe de cerca las características del tejido para controlar la profundidad de la aspiración: el tejido cortical es de color rosa pálido, el cuerpo calloso inferior aparece como tejido blanco y fibroso, y la capa CA1 del hipocampo es de color rojo oscuro y gris. Detenga la succión cuando la superficie del tejido se alise y quede expuesta una gran área de CA1 (Figura 3).
   NOTA: Este paso es fundamental para el éxito de todo el procedimiento y, a menudo, es la parte más difícil. Hemos proporcionado una lista de problemas comunes para ayudar a los lectores a solucionar este paso (Tabla 1). Además, recomendamos enjuagar la herida continuamente con suero fisiológico frío, ya que esto puede reducir el sangrado hasta cierto punto.
   1. Si la aguja se obstruye; Conecte la aguja bloqueada a una jeringa y lave la obstrucción. Intente cambiar la aguja si esto no funciona.
   2. Si el sangrado es constante, puede bloquear la visión del tejido cerebral. Si esto sucede, espere a que la sangre se coagule y luego enjuáguela con solución salina.
7. Mueva el soporte por encima del orificio perforado. Establezca el eje Z en 0 cuando la lente GRIN entre en contacto con la superficie del tejido cerebral. Si la lente GRIN supera el diámetro del orificio, utilice el microtaladro para expandir el orificio. A continuación, repita este procedimiento.
8. Inserte la lente GRIN en el orificio en el D/V: -1,32 mm. Deje reposar el soporte durante 5-10 min. Después de levantar el soporte, enjuague el orificio con solución salina. Repita este paso 3 veces (Figura 4A).
   NOTA: Es normal que el tejido cerebral sangre durante este paso. Después de repetidos enjuagues con solución salina, no debería haber más sangre en el orificio. La calidad de la imagen se ve muy afectada por este paso, y si la sangre no se limpia, puede hacer que el campo de la imagen se vuelva negro.
9. Use solución salina para limpiar el cráneo a fondo y luego deje que el cráneo se seque antes de aplicar la resina UV.
10. Utilice una aguja para aplicar la resina UV alrededor de la lente GRIN. Ilumine esta área con una luz UV durante 15 s y asegúrese de que la resina UV se solidifique (Figura 4B).
    NOTA: Aplique la resina UV poco a poco y repita esta operación varias veces hasta cubrir el área alrededor de la lente GRIN. Tenga cuidado de no fijar la lente GRIN al soporte cuando utilice la luz ultravioleta para la iluminación.
11. Retire el soporte de la lente GRIN con cuidado. Cubra todo el cráneo expuesto con resina UV y coloque la placa de cabeza sobre el cráneo en la posición adecuada. Ilumine todo el cráneo y la placa de la cabeza con una luz ultravioleta durante 15 s (Figura 4C).
    NOTA: La placa frontal es un componente para sujetar de forma segura la cabeza del ratón en su lugar al colocar la placa base (consulte el Archivo Suplementario 1 para ver el diseño). Asegure la placa frontal con la mayor firmeza posible; Una placa de cabeza desprendida resultará en el fracaso de toda la cirugía. En nuestra experiencia, la aplicación completa de la resina UV debería ser capaz de proporcionar una fijación firme. Si se requiere una fijación más fuerte, se podría considerar la instalación de tornillos de cráneo.
12. Cubra la lente GRIN expuesta con una tapa protectora impresa en 3D (consulte el archivo complementario 2 para ver el diseño). Fije la tapa a la placa principal con tornillos M1.6 (Figura 4D).
13. Inyectar dexametasona por vía intraperitoneal (disuelta en solución salina al 0,9%, 2 mg/kg) después de la operación para prevenir la inflamación postoperatoria. Además, administrar inyecciones subcutáneas de carprofeno (disuelto en solución salina al 0,9%, 5 mg/kg) para reducir el dolor postoperatorio.
14. Vuelva a colocar a los ratones en la jaula y transfiéralos a una manta térmica para facilitar su recuperación. Luego, transfiera los ratones a la casa de animales experimentales después de que puedan moverse libremente.
    NOTA: Para evitar daños en la placa base por peleas, los ratones que se han sometido a la cirugía pueden alojarse individualmente o con un número mínimo de cohabitantes. Recomendamos no exceder de tres ratones en una jaula después de la cirugía.
15. Desinfecte las superficies de trabajo con una solución de lejía al 10%. Quítese el equipo de protección personal (EPP) desechable y deséchelo en bolsas de riesgo biológico.
16. Monitoree a los ratones diariamente durante 3 días después de la cirugía. Registre el peso corporal de los ratones y observe su estado de cicatrización de heridas y sus actividades de locomoción. Administre inyecciones intraperitoneales diarias de dexametasona y soluciones de carprofeno (la misma dosis que en el paso 2.13) durante 3 días. Proporcione comida húmeda o tratamiento para facilitar la recuperación cuando sea necesario.

3. Compruebe la calidad del campo de imagen

NOTA: El ratón se recupera en 2-3 semanas después de la cirugía antes de la primera sesión de imágenes de calcio in vivo . El objetivo de este paso es comprobar la calidad de la cirugía y la recuperación del ratón. Si se puede observar la actividad de una sola célula en el campo de imágenes y el ratón está en buenas condiciones, fije la placa base al cráneo del ratón. El ratón debe ser sacrificado por luxación cervical si la calidad de las imágenes o el estado de salud no son adecuados.

1. Conecte la caja de recolección de datos del miniscopio a la computadora con un cable USB 3.0. A continuación, conecte el cable coaxial a la caja a través del conector To Scope (SMA).
2. Encienda el software de control del miniscopio. En el Software, haga clic en Seleccionar archivo de configuración | Archivos de configuración de usuario V4 plus para ver las imágenes en vivo.
3. Utilice un soporte personalizado para sujetar el ratón en la rueda de rodadura sujetando la placa principal. Sostenga el miniscopio con el soporte para miniscopio (hecho con impresión 3D; consulte el archivo complementario 3 para ver el diseño) y utilice un instrumento estereotáxico para mover el miniscopio por encima de la cabeza del mouse (Figura 4E).
4. Retire la tapa con un destornillador. Limpie suavemente la superficie de la lente GRIN con etanol al 75%. Coloque el miniscopio justo encima de la lente GRIN expuesta y haga que la superficie inferior del visor sea paralela a la superficie de la lente. Encuentre el mejor plano focal bajando lentamente el miniscopio hacia la lente GRIN.
   NOTA: Establezca el plano focal en 0 y, a continuación, ajuste la posición del miniscopio; Esto proporciona más espacio para ajustar el enfoque. Seleccione el plano focal con una visualización clara del mayor número de celdas.
5. En el software de control del miniscopio, ajuste la potencia de la luz LED al nivel óptimo.
   NOTA: Para observar la actividad de una sola célula, el campo de imagen no debe estar sobreexpuesto ni demasiado oscuro. La intensidad del LED suele estar dentro del 10%.
6. Si el flujo sanguíneo vascular es visible y las células son numerosas y están distribuidas uniformemente por todo el campo de imágenes, continúe con la siguiente sección del experimento.
   NOTA: En este paso, es importante poder observar la actividad de una sola célula. Esto puede influir en los resultados del análisis de datos. Normalmente, las actividades regionales (manchas de fluctuaciones fluorescentes) son difíciles de interpretar. Esto puede ser una indicación de que las neuronas objetivo están desenfocadas por la lente GRIN. El ratón no se utilizará en los experimentos posteriores si parece que el campo de imagen es negro, las células exhiben actividad regional o no hay un número suficiente de células.
7. Desconecte el cable del miniscopio.

4. Coloque la placa base del miniscopio en el cráneo del ratón

1. Coloque la placa base en el miniscopio y vuelva a ajustar las posiciones del miniscopio para obtener un campo de visión con buena calidad de imagen.
2. Mezcle los materiales de la base de la dentadura postiza en el tazón para mezclar.
   NOTA: Es importante que la mezcla no fluya demasiado libremente ni sea demasiado firme. Demasiada fluidez tiende a cubrir la superficie de la lente GRIN, lo que provoca la pérdida del campo de imagen. Si son demasiado firmes, los materiales de la base de la dentadura postiza no podrán cubrir herméticamente el espacio entre la placa base y la placa principal.
3. Tenga cuidado de no cambiar la posición del miniscopio mientras aplica la primera capa de materiales de la base de la dentadura postiza alrededor de la placa base del miniscopio con cuidado. Espere a que la primera capa de cemento se endurezca antes de aplicar una segunda capa de cemento desde la placa base hasta la placa principal. Después del endurecimiento de todos los materiales de la base de la dentadura postiza, afloje el tornillo de fijación y separe el miniscopio de la placa base.
   NOTA: Cuando utilice materiales de base para dentaduras postizas, preste atención al campo de imágenes en el software y realice los ajustes necesarios antes de que el cemento se solidifique.
4. Retire suavemente el brazo de sujeción del miniscopio.
5. Coloque la tapa de la placa base en la placa base para proteger la lente GRIN expuesta y apriete el tornillo de fijación (Figura 4F).
6. Vuelve a colocar al ratón en su jaula de origen. Dale al ratón varios días para que se recupere antes de realizar los experimentos de comportamiento.

5. Adquisición de datos

NOTA: Las imágenes de calcio in vivo se pueden realizar simultáneamente con cualquier prueba de comportamiento. En este protocolo, usamos la pista lineal como ejemplo. Esta pista lineal es de 1,5 m y tiene agua en ambos extremos, lo que sirve como recompensa para los ratones. Los ratones pueden usar un microscopio en miniatura (miniscopio) y correr de un lado a otro a lo largo de la pista durante una duración de 20 minutos. Durante este tiempo, los ratones suelen ser capaces de realizar ~60 ensayos.

1. Conecte la caja de recolección de datos del miniscopio a la computadora con un cable USB 3.0. A continuación, conecte el cable coaxial a la caja a través del conector To Scope (SMA).
2. Encienda el software de control del miniscopio. En el software de control del miniscopio, haga clic en Seleccionar archivo de configuración | Archivos de configuración de usuario V4 plus para ver las imágenes en vivo.
3. Conecte la cámara industrial al ordenador con un cable USB 3.0.
4. Encienda el software de control de la cámara. En el software, haga clic en Abrir equipo y seleccione el archivo para importar los parámetros de recopilación de datos. Seleccione el formato de video como Video sin comprimir en el contenedor AVI. Haga clic en el botón Inicio para ver las imágenes en vivo.
   NOTA: Para disminuir el tamaño del archivo del video de grabación de comportamiento, el campo de visión debe excluir cualquier área innecesaria fuera de la pista.
5. Utilice un soporte personalizado para sujetar el ratón en la rueda de rodadura sujetando la placa principal.
6. Afloje el tornillo de fijación con un destornillador, retire la tapa de la placa base y limpie la superficie de la lente GRIN con etanol al 75%.
7. Monta el miniscopio en su base. Sujeta el miniscopio a su base en la cabeza del ratón.
8. Encuentre el mejor plano focal deslizando el botón de plano focal.
9. Mueva suavemente el ratón de la rueda de rodadura a la pista lineal.
10. Haga clic y mantenga presionado el botón Grabar para comenzar a grabar con el miniscopio. A continuación, haga clic en el botón Iniciar recopilación para iniciar la grabación de la cámara. Grabación durante 20 min.
11. Guarde los datos de imágenes de calcio in vivo , los datos de comportamiento y los datos de Arduino por separado. Asigne un nombre a estos archivos con la fecha, el número de sesión y el número del mouse.
    NOTA: Los estudios que utilizan un miniscopio tienden a tener un período de recopilación de datos a largo plazo en un solo animal experimental. Nombrar los archivos claramente puede ayudar con el procedimiento de procesamiento de datos.
12. Separe el miniscopio de su base.
13. Cierre el software de control de la cámara, el software de control del miniscopio y la computadora.
14. Desconecte el cable coaxial del To Scope (SMA) y el cable USB 3.0 de la cámara.
15. Desatornille el tornillo de fijación en la base, vuelva a colocar la tapa de la placa base y apriete el tornillo.
16. Vuelve a poner al ratón en su jaula de origen.

6. Tratamiento de datos

1. Cargue los datos de imágenes de calcio registrados en MATLAB.
   NOTA: Reconocemos que el análisis de los datos debe adaptarse al diseño experimental. Aquí proporcionamos una tubería de preprocesamiento que convierte el video de imágenes de calcio en bruto en trazas de actividad de células individuales. Creemos que este procedimiento es relativamente universal y útil para los usuarios. Todos los scripts descritos en esta sección se pueden encontrar en el Archivo Complementario 4.
2. Convierta los datos de imagen de AVI a formato HDF5 (.h5).
   NOTA: La salida sin procesar del miniscopio genera archivos AVI con compresión. Los archivos sin comprimir suelen tener un tamaño de decenas de gigabytes. El formato de archivo HDF5 permite un acceso virtual y parcial que puede ser fácilmente visualizado y manipulado para su posterior análisis.
3. Aplique la corrección de movimiento no rígida (NoRMCorre)¹⁹.
4. Reduzca el muestreo de la película corregida por movimiento en caso de que la computadora tenga RAM limitada para pasos posteriores.
   NOTA: Los datos originales recopilados por el miniscopio tienen un tamaño de 600 x 600. Mediante el uso de una muestra descendente espacial, podemos reducir el tamaño del video a 200 x 200. Este método disminuye significativamente los requisitos de almacenamiento de datos y permite un procesamiento de datos más rápido.
5. Aplique EXTRACT en los datos muestreados para identificar señales de una sola célula, siguiendo las instrucciones para el código EXTRACT en el repositorio en línea²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public).

La Figura 1 muestra el esquema del procedimiento experimental, incluida la inyección del virus, la implantación de lentes GRIN, la afijación de la placa base, las imágenes de calcio in vivo a través de un miniscopio y el procesamiento de datos. Por lo general, todo el procedimiento dura 1 mes. La Figura 2 muestra ejemplos de procedimientos de inyección de virus, incluida la posición del orificio perforado en el cráneo y la condición del tejido cerebral antes de la implantación de la lente GRIN.

La figura 3 muestra el proceso de extirpación del tejido cerebral, que es crucial para el éxito de esta cirugía. A medida que se succiona más tejido, las diferentes capas de tejido se vuelven visibles. Este paso de succión se puede detener una vez que se observa una capa gris reflectante.

La Figura 4 muestra el procedimiento de la implantación de GRIN, incluida la inserción de la lente GRIN, la adherencia de la placa frontal en el cráneo y la cobertura de la lente GRIN con una tapa personalizada. La calidad de las imágenes de calcio in vivo depende del éxito de la inyección del virus y de la implantación de la lente GRIN.

La Figura 5 muestra cuatro tipos de resultados de imágenes de calcio in vivo. La figura 5A es el resultado fallido; No se observaron células activas en el campo de visión de la imagen. En la figura 5B-D se muestran los resultados exitosos. La figura 5B tiene menos de 10 células activas, pero no hay vasos sanguíneos obvios. La figura 5C tiene más de 50 células activas y vasos sanguíneos visibles. En la Figura 5D, hay cientos de células activas en el campo de visión de la imagen; Al mismo tiempo, observamos vasos sanguíneos claros. Las imágenes de calcio in vivo de alta calidad suelen tener cientos de células activadas. Se cree que menos de una docena de células activadas no son óptimas para obtener resultados de imagen. Por lo general, el número de células se correlaciona con el diámetro del cristalino GRIN, así como con la parte de la región del cerebro. Un diámetro de lente GRIN más grande y una región del cerebro más cercana a la cara dorsal aumentarán la probabilidad de observar más células activas. También es vital tener en cuenta que cuanto mayor sea el diámetro de la lente GRIN, más daño hace al cerebro del ratón; Por lo tanto, seleccionar el tamaño adecuado es crucial. La implantación de una lente GRIN de 1 mm de diámetro no afecta la capacidad del animal para adquirir el comportamiento lineal de la pista (Figura suplementaria S1).

Los datos de comportamiento y los datos de imágenes de calcio generalmente se procesan por separado. Los datos de comportamiento del ratón pueden etiquetarse manualmente o procesarse mediante un software de análisis de código abierto. Los datos de imágenes de calcio se procesan mediante Non-Rigid Motion Correction (NoRMCorre) y EXTRACT en MATLAB. La Figura 6 muestra las células individuales extraídas superpuestas en el campo de visión y muestra cinco trazas de calcio representativas de un registro exitoso de imágenes de calcio in vivo . Consulte el vídeo complementario S1 para ver un vídeo representativo de los datos sin procesar.

Verificar que la implantación de la lente GRIN y la inyección viral tienen lugar en la región cerebral prevista es el último paso y también es muy importante para la interpretación de los datos. La figura 7 es un corte de cerebro de ratón que muestra la posición de la expresión de GCaMP6f (la región de fluorescencia verde) y la pista de la lente GRIN.

Figura 1: Diagrama de los procedimientos de inyección de virus e implantación de lentes GRIN. (A) Inyectar el virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f en el giro dentado. (B) Implante la lente GRIN por encima de la circunvolución dentada. (C) Comprobar la calidad de las imágenes después de la cirugía. (D) Coloque la placa base del miniscopio después de la comprobación. (E) El cronograma y el proceso de todo el protocolo. Abreviatura: GRIN = Índice de gradiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Vista quirúrgica representativa durante la inyección del virus. (A) Coloque el ratón sobre el aparato estereotáxico. (B) Marque el área de implantación de la lente GRIN (la región negra). (C) Craneotomía en el área objetivo. (D) Inyectar 240 nL de virus en el giro dentado. (E) Retire la micropipeta después de la inyección. (F) Extirpar la corteza y parte del tejido cerebral CA1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Vista quirúrgica representativa durante la aspiración de tejido cerebral. (A) La región encerrada por el marcador negro se pule con un microtaladro, dejando (B) tejido cortical parcialmente expuesto. La parte izquierda muestra una corteza expuesta y la parte derecha está cubierta por duramadre y tejido craneal. (C) Imagen representativa durante la aspiración del tejido cerebral cortical. El tejido permanece de color rosa pálido. (D) La materia blanca es visible dentro del campo de visión, como lo indica la flecha blanca. (E) Una succión adicional reveló una superficie reflectante de color rojo grisáceo oscuro debajo de la materia blanca. Se cree que la región (flecha negra) es la superficie CA1 y la succión no debe ser más profunda. (F) No se ve más sangrado en la región después de enjuagar con solución salina varias veces. En todos los paneles, los asteriscos indican herramientas quirúrgicas: una aguja roma de 30 G para solución salina y una aguja roma de 25 G para la aspiración de tejido cerebral. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Un ejemplo de procedimiento para la implantación de lentes GRIN y la fijación de la placa base. (A) Implante la lente GRIN en el tejido cerebral utilizando un soporte para lentes GRIN. (B) Adherir la lente GRIN en el lugar adecuado con resina UV; la parte reflectante representa la resina UV. (C) Fije la placa de la cabeza en el cráneo del ratón con resina UV. (D) Cubra la lente GRIN con una tapa protectora impresa en 3D. (E) Verificar la calidad de la cirugía. El miniscopio estaba fijado por un soporte. (F) Aplique los materiales de la base de la dentadura postiza alrededor de la placa base. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resultados exitosos y no exitosos de las imágenes. (A) Resultado infructuoso de las imágenes de calcio in vivo . No hay células activas en A y varias regiones tienen manchas de sangre oscuras, como lo indican las flechas negras. (B-D) Resultados exitosos de imágenes de calcio in vivo . (B) Se pueden observar menos de 10 células activas, pero no vasos sanguíneos significativos en el campo de la imagen. (C) Se pueden observar más de 50 células activas y vasos sanguíneos significativos. (D) Se pueden observar cientos de células activas y vasos sanguíneos más significativos. Los círculos discontinuos representan el campo de visión de la imagen. Las flechas verdes representan las celdas que expresan GCaMP6f. Las flechas rojas representan los vasos sanguíneos. Barras de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Datos representativos de imágenes de calcio in vivo de un ratón que corre en la pista lineal. (A) El campo de visión de imagen registrado por el miniscopio, número total de celdas = 227. (B) Trazas representativas de calcio. Las ubicaciones de la celda se muestran en el mismo color en A. (C) Tarea conductual: Pista lineal con recompensas de agua en ambos extremos. (D) Resultado representativo del análisis conductual de la actividad del ratón; Tiempo total = 100 s. Las líneas verticales azules indican los puntos de tiempo del comportamiento de lamido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Secciones de tejido cerebral de ratones después de la cirugía. (A,B) Dos ejemplos de tejidos cerebrales de ratón. Las áreas rectangulares discontinuas indican la trayectoria de implantación de la lente GRIN. Las líneas curvas representan el giro dentado en el hipocampo. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Gráfico de solución de problemas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria S1: Adquisición normal de la tarea de memoria espacial por ratones que se han sometido a cirugía. El gráfico muestra la cuantificación del número de ensayos completados en la sesión de 20 minutos cada día. Los datos se representan como media ± SEM. N = 3 ratones en el grupo con cirugía y 4 en el grupo sin cirugía. Para la comparación estadística se utilizó el ANOVA de dos vías. Abreviatura: ns = no significativo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario S1: Datos brutos representativos de las imágenes de calcio en DG. Este video muestra la actividad del calcio durante un período de 5 minutos. El video se reproduce a 10 veces la velocidad original. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: El diseño de la placa de cabeza. Este archivo describe el dibujo en 2D del diseño de la placa principal. La producción de la placa principal implica el corte de acero inoxidable de acuerdo con el dibujo. Los dos pequeños orificios de la barra lateral deben golpearse con roscas M1.6. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: El diseño de la tapa protectora impresa en 3D. Este archivo proporciona el código g de las rebanadas de la tapa protectora que se pueden utilizar con una impresora 3D. En este protocolo, utilizamos plástico de ácido poliláctico como materia prima para la impresión. Los pequeños orificios en el lateral coinciden con las posiciones de los orificios roscados en la placa principal para la instalación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: El diseño del soporte del miniscopio. Este archivo proporciona el código g de las rebanadas del soporte del miniscopio que se pueden utilizar con una impresora 3D. El orificio cilíndrico se utiliza para la instalación en un soporte estereotáxico con un tornillo M4. Los orificios en el lateral están destinados a agregar tornillos para apretarlo, pero el soporte se puede usar sin esta característica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Código de control de Arduino y scripts para el preprocesamiento de video de imágenes de calcio en bruto. Este archivo contiene los scripts para controlar Arduino y el código para preprocesar los datos de imágenes de calcio. El código de Arduino controla la configuración del comportamiento en la que el ratón aprende a lamer para obtener recompensas de agua en extremos alternos de una pista lineal. Al aprender la tarea, los ratones correrán repetidamente de un lado a otro en la pista. El código de preprocesamiento de imágenes de calcio realiza la conversión de formato de archivo, la corrección de movimiento, la reducción de la muestra espacial y la extracción de señales celulares a partir de los datos recopilados por el miniscopio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.