Biosensores de proteína G basados en BRET para medir la actividad del receptor acoplado a proteína G en células vivas

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan la superfamilia más grande de receptores transmembrana, responsables de transducir estímulos extracelulares en cascadas de señalización intracelular que dan como resultado respuestas biológicas específicas. Son dianas farmacológicas fundamentales, con aproximadamente el 30% de los fármacos comercializados actuando sobre los GPCR¹. La unión del ligando GPCR induce cambios conformacionales en el receptor, facilitando las interacciones con proteínas G heterotriméricas y/o GPCR quinasas (GRK) y β-arrestinas, iniciando así la señalización aguas abajo o la internalización del receptor².

Las proteínas G heterotriméricas sirven como transductores intracelulares primarios de la señalización de GPCR y constan de tres subunidades: G_α, G_β y G_γ. Estos heterotrímeros se clasifican en cuatro familias: G_{i / o}, G_s, G_q y G_12/13, según el subtipo G_α , cada una de las cuales activa distintas vías de señalización: el subtipo G_{i / o} inhibe la adenilato ciclasa mientras que G_s la estimula, G_q activa la fosfolipasa C-β y G_12/13 regula las GTPasas de la familia Rho.

La activación de GPCR conduce a sus reordenamientos conformacionales, lo que permite un rápido compromiso de la proteína G dentro de la cinética de subsegundos. Este proceso induce cambios conformacionales en la proteína G, promoviendo el intercambio GDP-GTP en la subunidad G_α. La unión de GTP altera aún más la conformación de la subunidad G_α, lo que resulta en su disociación del dímero G_βγ, lo que permite la propagación de la señal. Por lo tanto, las proteínas G son cruciales para modular la especificidad y la dinámica temporal de las respuestas celulares mediante la regulación de diversas proteínas efectoras como la adenilato ciclasa o los canales iónicos ^3,4,5.

Este protocolo describe la medición de la activación o inactivación de la proteína G utilizando biosensores basados en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) tras la estimulación del ligando GPCR en células vivas. Inspirado en el trabajo pionero sobre biosensores de proteína G 6,7,8,9, el sistema G-CASE (sensores de actividad tri-cistrónicos de proteína G), introducido por Schihada et ^al.10, se basa en BRET entre subunidades G_α marcadas y G_βγ y ofrece un enfoque simplificado que requiere una sola transfección de plásmido. Esta característica mejora la sensibilidad y mitiga los desafíos asociados con la cotransfección de múltiples plásmidos que codifican para las tres subunidades (G_α, G_β y G_γ) de la proteína G heterotrimérica. Estos sensores se han puesto a disposición de grupos de investigación académica comercialmente (ver Tabla de materiales).

BRET ofrece ventajas significativas sobre la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). En BRET, la transferencia de energía se produce entre un donante bioluminiscente y un aceptor fluorescente sin necesidad de fuentes de luz externas. Esta bioluminiscencia intrínseca reduce los problemas asociados con FRET, como la autofluorescencia y la dispersión de la luz, lo que da como resultado una señal de fondo más baja y una mejor sensibilidad del ensayo ^6,7,11.

Esta ausencia de excitación externa en BRET minimiza el fotoblanqueo y los efectos fototóxicos, lo que lleva a señales de fondo más bajas en comparación con FRET. En consecuencia, los ensayos BRET suelen mostrar una mayor sensibilidad, lo que permite medir la activación de la proteína G de los GPCR constitutivamente activos. La sensibilidad mejorada de los ensayos BRET facilita la detección de interacciones biológicas sutiles, lo que es particularmente valioso en estudios farmacológicos donde la medición precisa de la actividad del receptor es crucial.

Estos biosensores se pueden traducir en cribado de alto rendimiento en placas de 96 o 384 pocillos, como lo demostraron recientemente Scott-Dennis et al., donde se ha desarrollado un método que utiliza estos biosensores en un ensayo de 384 pocillos basado en membranas para analizar la actividad de los receptores cannabinoides CB1R y CB2R¹². Este artículo describe el uso de estos biosensores en placas de 96 pocillos en células vivas midiendo la actividad del β2-AR como un GPCR prototípico de clase A, que se une a la proteína G_s y el CB1R que pertenece a los GPCR de clase A y activa la proteína de la familia G_{i / o} . Se valida el uso de dos biosensores G-CASE: G_s y G_i3 en células HEK 293T con el GPCR de forma transitoria (con el β2-AR) o expresado de forma estable (con el CB1R).

Es importante señalar que este experimento se puede realizar en varias líneas celulares, lo que demuestra la versatilidad y robustez de esta técnica en varios contextos celulares. Esto asegura que el método se pueda aplicar a diversos modelos experimentales, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para estudiar la señalización de GPCR en diferentes entornos fisiológicos y farmacológicos. La Figura 1 ilustra el principio de los sensores de actividad de la proteína G basados en BRET.

Figura 1: Principio de los sensores de actividad de la proteína G basados en BRET. Los sensores de proteína G constan de tres subunidades: G_α,_{G β} nativa y G_γ. La subunidad G_α está fusionada con la pequeña y brillante NanoLuciferasa (Nluc), mientras que la subunidad G_γ está marcada N-terminal con Venus permutado circularmente (cpVenus¹⁷³). Los genes que codifican estas subunidades de proteína G modificadas se combinan en un solo plásmido. La unión del ligando a los GPCR induce cambios conformacionales en el GPCR, promoviendo el reclutamiento de la proteína G y la posterior disociación seguida de hidrólisis de GTP. Esta disociación interrumpe la transferencia de energía entre los socios, lo que resulta en una disminución de la señal BRET. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Siembra de placas de pozos (Día 1)

NOTA: Siga todos los protocolos de cultivo celular en una campana de flujo laminar estéril para mantener las condiciones estériles. Las placas de pocillos blancos con fondos planos transparentes se utilizan para seguir el crecimiento y la viabilidad celular. Utilice la placa de pocillos blanca completa para evitar el uso de una pegatina en el paso 3.2.1.

1. Recubrimiento de placas de pocillos
   NOTA: Se pueden usar placas prerrevestidas para omitir este paso.
   1. Vierta en un depósito multicanal alrededor de 6 ml de solución de poli-L-lisina (PLL) filtrada estérilmente (0,01%). Con una pipeta multicanal, llene cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos blancos con 60 μL de PLL.
   2. Coloque la microplaca en un lugar oscuro e incube durante 20 min.
   3. Durante la incubación, proceda con la preparación de las células como se describe en los pasos 1.2.1-1.2.3.
   4. Aspire la solución de PLL con la pipeta multicanal y guárdela a 4 °C en un tubo de 15 ml.
   5. Lave la placa tres veces con DPBS para eliminar la PLL libre que podría causar degradación celular.
2. Preparación y recubrimiento de celdas
   1. Cultive células HEK293 en el medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina a 100 U/ml y estreptomicina a 37 °C al 5% de CO₂.
      NOTA: FBS se agrega al medio de cultivo para proporcionar los nutrientes y factores de crecimiento necesarios para la viabilidad celular adecuada.
   2. Retire el medio y enjuague las células con 2 ml de DPBS.
   3. Añadir 0,5 mL de tripsina e incubar durante 3-5 min a 37 °C para desprender las células.
   4. Agregue 4,5 ml de DMEM al matraz para neutralizar la tripsina, luego pipetee hacia arriba y hacia abajo repetidamente para separar las células y volver a suspenderlas.
   5. Transfiera las células separadas a un tubo de 15 ml y centrifugue durante 5 min a 1000 x g (a temperatura ambiente, RT).
   6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 2 ml de DMEM.
   7. Cuente las células con una cámara de recuento Malassez y prepare 9 ml a 300.000 células/ml. Colóquelos en un depósito multicanal y siembre la microplaca de 96 pocillos vertiendo 100 μL por pocillo con la pipeta multicanal (densidad final de 30.000 células/pocillo).
   8. Incubar la microplaca a 37 °C, 5% de CO₂ durante aproximadamente 24 h.
      NOTA: Las células deben alcanzar alrededor del 70% -80% de confluencia para una transfección eficiente.

2. Transfección de plásmidos (Día 2)

NOTA: La transfección celular se puede realizar el primer día en celdas suspendidas antes de la siembra, durante el paso 1.2.7, y la adquisición de datos el día 3.

1. Diluir 10 μg del ADN plásmido deseado (por ejemplo, 5 μg de receptor β2-adrenérgico y 5 μg de G_s(corto)-CASE en células HEK wt o solo 10 μg de G_i3-CASE en células HEK CB1) y 20 μL de lipofectamina en los tubos que contienen 500 μL de medio Opti-MEM. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   1. Para un control negativo, reemplace el receptor β2-adrenérgico con el plásmido pcDNA 3.1 vacío a la misma concentración. Combine las soluciones en un tubo y mezcle para obtener una mezcla de transfección (1 ml).
2. Incube la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 20 min.
3. Agregue 10 μL de mezcla de transfección del paso 2.2 gota a gota a cada pocillo, y mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para asegurar una mezcla completa.
   NOTA: Se obtiene una concentración final de 100 ng de ADN por pocillo.
4. Incubar la microplaca en una incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO₂ durante 24 h.

3. Adquisición de datos (Día 3)

1. Preparación de ligandos
   NOTA: Tampón de solución salina equilibrada de Hank (HBSS): NaCl 140 mM, cloruro de potasio 5 mM, cloruro de calcio 1 mM, sulfato de magnesio heptahidratado 0,4 mM, cloruro de magnesio hexahidratado 0,5 mM, fosfato de sodio dibásico dihidratado 0,3 mM, fosfato de potasio monobásico 0,4 mM, D-glucosa (dextrosa) 6 mM, bicarbonato de sodio 4 mM, pH 7,4, filtrado 0,22 μm.
   1. Preparar una solución madre a la mayor concentración posible en el disolvente de solubilización adecuado para los diferentes ligandos (en este protocolo, el isoproterenol se prepara en H₂0 mQ y WIN-55.212-2 en DMSO).
      NOTA: La concentración de la solución madre del ligando debe ajustarse en función de la solubilidad y la constante de disociación conocida (K_d) del ligando.
   2. A partir de este stock, preparar una dilución en serie del ligando que oscile alrededor del K_d del ligando, de 10 μL en el disolvente de solubilización apropiado. Almacene esta dilución en serie a -20 °C.
      NOTA: Dependiendo del ligando, el rango de dilución en serie se puede congelar y descongelar hasta diez veces antes de que ocurra la degradación. Preparar una solución que contenga únicamente el disolvente utilizado para la disolución del ligando para incluir una condición del vehículo (en este protocolo, H₂0 o DMSO).
   3. Para cada concentración de ligando y vehículo, realice una dilución de 1/100 en HBSS agregando 1,3 μL de cada concentración a un volumen total de 130 μL. Esto da como resultado una concentración final del 1% del vehículo en HBSS.
      NOTA: Este rango de dilución final es el que se utiliza para los experimentos agregando 10 μL para obtener un volumen total de 100 μL por pocillo. Esto da como resultado una concentración final del vehículo del 0,1% en todos los pozos. El volumen de 130 μL corresponde a la cantidad necesaria para llenar una fila de una placa de 96 pocillos: (10 x 12) ± 10%. Cada fila corresponde a una concentración de ligando diferente, y la última fila sirve como control del vehículo.
   4. Preparar 980 μL de dilución de Furimazina 1/100 a partir de la solución madre (9,8 μL en 970,2 μL de HBSS para obtener un volumen total de 980 μL).
      NOTA: Prepare una solución fresca de furimazina y déjela incubar durante al menos 3 min. Luego, agréguelo inmediatamente antes de la adquisición. No debe prepararse demasiado pronto, ya que la señal tiene una vida media de aproximadamente 120 min a temperatura ambiente. Para superar esta limitación, se pueden utilizar derivados de furimazina de acción prolongada, como vivazina y endurazina. Estos sustratos mantienen una señal BRET estable hasta 48 h.
2. Lecturas de matrículas
   NOTA: Utilice un lector de placas multimodo. Ajuste la medición a las condiciones estudiadas y al número de réplicas. Aquí, la adquisición de datos se divide en tres lecturas de 4 columnas, lo que corresponde a 32 pozos. Todas las lecturas se realizan con ópticas superiores con una tapa transparente para evitar la evaporación del tampón. Antes de todas las lecturas, ajuste la ganancia de medición. En este estudio, la ganancia se fijó en 3600. Es posible evitar la adición manual de ligandos mediante el uso de un sistema automatizado de inyectores o jeringas, que está disponible en muchos lectores de placas.
   1. Retire el medio de las primeras 4 columnas de la placa de 96 pocillos. Enjuague cada pocillo con 100 μL de HBSS y agregue 80 μL de HBSS. Pega una pegatina blanca en la parte inferior del plato. Esto mejora las mediciones de fluorescencia y/o bioluminiscencia.
   2. Registro de espectros de luminiscencia de la proteína G: Inserte la placa de 96 pocillos en el lector de placas. Registre la emisión de cpVenus¹⁷³ utilizando un monocromador de 535/30 nm y mida la emisión de luminiscencia entre 500 y 600 nm con una resolución de 2 nm.
      NOTA: Esta grabación es un control para garantizar que se emita fluorescencia tras la excitación de cpVenus¹⁷³ .
   3. Registro de espectros de luminiscencia de proteínas G: Registre la intensidad de emisión de Nluc utilizando un monocromador de 450/40 nm y mida la emisión de luminiscencia entre 400 nm y 600 nm con una resolución de 5 nm.
      NOTA: Este registro es un control para garantizar que no se emita bioluminiscencia antes de la adición del sustrato Nluc, furimazina.
   4. Retire la placa del lector de placas y añada 10 μl de la solución de furimazina previamente preparada (paso 3.1.4.) en cada pocillo con la ayuda de una pipeta multicanal.
   5. Repita el paso 3.2.3.
      NOTA: Esta grabación es un control para garantizar que se emita bioluminiscencia tras la adición de furimazina. Proceda directamente con el paso 3.2.6 después de esta medición para evitar la variación de la señal debido al consumo y/o degradación de furimazina. La variación de la señal BRET puede ocurrir debido al consumo de furimazina y / o degradación y los procesos reguladores que ocurren para terminar la respuesta inducida por la estimulación agonista. Para superar esta limitación, se podrían usar inhibidores de GRK (CMPD101) e inhibidores de internalización (dynasore) o células editadas genéticamente desprovistas de GRK o arrestinas.
   6. Registro de la proteína G basal BRET: Antes de agregar el ligando GPCR, registre la intensidad de emisión de Nluc y cpVenus¹⁷³ utilizando un monocromador de 450/40 nm y 535/30 nm, respectivamente. Mida 3 ciclos de 60 s con un intervalo de tiempo de medición de 0,30 s (tiempo total de lectura de 3 min).
      NOTA: Aumentar el tiempo del intervalo de medición a 0,90 s generalmente mejora significativamente la relación señal/ruido, pero da como resultado un tiempo de lectura mucho más largo. El experimentador debe decidir si la mayor resolución temporal o la mejora de la relación señal-ruido es más importante para su aplicación.
   7. Retire la placa del lector de placas y agregue 10 μL del rango de dilución previamente preparado del ligando GPCR (paso 3.1) respectivamente en cada pocillo de una columna con la ayuda de una pipeta multicanal. Siga el mismo procedimiento para las otras 3 columnas.
   8. Registro de Bret inducido por ligando de proteína G: Registre la intensidad de emisión de Nluc y cpVenus¹⁷³ utilizando un monocromador de 450/40 nm y 535/30 nm, respectivamente. Mida 16 ciclos de 60 s con un tiempo de intervalo de medición de 0,30 s (tiempo total de lectura de 16 min).
      NOTA: Configure los parámetros de medición para medir los pocillos en columnas. Los duplicados se leen con una diferencia de tiempo de 2,4 s.
   9. Repita el paso 3.2. para las siguientes cuatro columnas 2 veces.

4. Análisis de datos

NOTA: Recopile los datos de cada lectura en archivos de hoja de cálculo de datos separados.

1. Lecturas de control
   1. Grafique la intensidad de la emisión contra la longitud de onda.
2. Lecturas basales de BRET
   1. Para cada pocillo, calcule la relación BRET de las tres lecturas. La relación BRET se define como emisión aceptor/emisión donante.
      
   2. Para cada pocillo, calcule el promedio de las tres proporciones BRET antes de la adición del ligando. Este valor se denomina relación BRET basal antes de la estimulación del ligando: Relación_basal.
   3. Para normalizar las relaciones BRET anteriores de todos los pozos, para cada una de las tres mediciones, reste respectivamente el valor de la relación BRET calculado de los pocillos de control del vehículo de la relación BRET en el momento de medición correspondiente.
      NOTA: Los datos analizados corresponden a los puntos de tiempo antes de la adición del ligando. Dado que se conocen los pozos en los que se agrega el ligando, los pozos de control del vehículo se pueden identificar en consecuencia.
3. Lecturas de BRET inducidas por ligando de proteína G
   1. Para cada pocillo, calcule la relación BRET de cada lectura, como se describe en la sección 4.2.1. Esos valores se denominan Ratio_stim.
   2. Para cuantificar los cambios inducidos por ligandos, calcule el ΔBRET para_{cada estímulo de} la relación de cada pozo como un porcentaje sobre el basal. Para ello, utilice el Ratio_basal correspondiente calculado previamente en la sección 4.2.2.
      
   3. Calcule el ΔBRET(%) para normalizar los valores de ΔBRET de cada pocillo. Para eso, reste los valores ΔBRET respectivos del vehículo.
   4. Para visualizar la cinética de ΔBRET en una hoja de cálculo de datos, agregue las tres lecturas basales de BRET normalizadas en el paso 4.2.3. delante de los valores correspondientes de ΔBRET(%) calculados para cada pocillo en la sección 4.3.3.
   5. Grafique los datos anteriores contra el tiempo de la lectura para obtener un gráfico cinético.
   6. Cuando se alcanza una meseta, tome los valores de ΔBRET (%) en un momento elegido y grafique contra la concentración del ligando utilizado, ya que cada pocillo corresponde a una concentración de ligando diferente. Se obtiene una curva dosis-respuesta.
      NOTA: La meseta generalmente se alcanza alrededor de 5 minutos después de la estimulación del ligando. En este protocolo, se trazan los valores obtenidos después de 15 min de estimulación del ligando. Para comparar datos de diferentes experimentos, ajuste el tiempo según la cinética de activación.
   7. Grafique los datos anteriores en el software de análisis y ajuste utilizando un ajuste sigmoidal de tres-respuesta dosis-respuesta basado en la siguiente ecuación:
      
      donde, X es la concentración del ligando utilizado, Y son los valores de ΔBRET (%), Top e Bottom representan las mesetas y EC₅₀ es la concentración de ligando requerida para alcanzar el 50% del efecto máximo. Esto permite obtener el E_max y EC₅₀.
   8. Compare los datos de la condición de control utilizando una prueba de Mann-Whitney no paramétrica. Los resultados se consideran significativos a p < 0,05.

Figura 2: Pasos clave para realizar el ensayo BRET. Descripción general de los tres pasos experimentales principales descritos en este protocolo (siembra celular, transfección celular y adquisición de señales BRET) y guía detallada paso a paso para la adquisición de datos. Configuración experimental: El día 1, las células se siembran en una placa blanca de 96 pocillos prerrecubierta de PLL con un fondo plano y transparente a una densidad de 30.000 células/pocillo. En el día 2, las células se transfectan con el sensor de proteína G seleccionado junto con los plásmidos GPCR o pcDNA3.1 estudiados. Después de 24 h de incubación, la actividad del sensor de proteína G se mide a través de lecturas de bioluminiscencia y fluorescencia tras la adición del ligando. Adquisición de datos: Después del lavado de HBSS de las células, se agregan 80 μL de HBSS a los pocillos y se mide la emisión de fluorescencia de cpVenus¹⁷³ entre 500 nm y 600 nm utilizando un monocromador de 535/30 nm (1). A continuación, la bioluminiscencia de Nluc se mide entre 400 nm y 600 nm utilizando un monocromador de 450/40 nm, tanto antes ( 2) como después ( 3) de la adición de furimazina. Finalmente, la señal BRET para la actividad de la proteína G basal e inducida por ligandos se mide utilizando monocromadores de 450/40 nm y 535/30 nm, respectivamente, durante 3 min (3 ciclos de 60 s con un intervalo de medición de 0,30 s) (4) y 16 min (16 ciclos de 60 s con un intervalo de medición de 0,30 s) (5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la Figura 2 se detalla un esquema generalizado de la configuración y ejecución experimental. La activación de las proteínas de la familia Gs o Gi / o después de la activación del ligando de dos GPCR se evaluó utilizando los biosensores G-CASE. Primero, se estudió un GPCR prototípico de la familia A, el β2-AR transfectado transitoriamente en células HEK 293T. Cuando se aplicó un agonista (es decir, isoproterenol) a las células HEK wt que expresan el β2-AR junto con el sensor de proteína Gs (corto) -CASE, se observó una disminución dependiente de la concentración en la señal BRET, lo que indica la activación de la proteína Gs (Figura 3B). Los valores de ΔBRET disminuyeron con la concentración de ligandos hasta que se alcanzó la saturación, con una meseta observada aproximadamente 5 min después de la estimulación del ligando. Por el contrario, las células HEK wt transfectadas con el plásmido pcDNA3.1 vacío y el sensor de proteína Gs (corto) -CASE exhibieron una respuesta inversa pero baja y no significativa a la estimulación con isoproterenol (Figura 3B). En este protocolo, se trazan los valores obtenidos después de 15 min de estimulación del ligando. Para garantizar la coherencia de los resultados y la independencia de la selección temporal, se deben probar otros puntos temporales, asegurando que se ha alcanzado el equilibrio. Además, para comparar los resultados de diferentes experimentos, la selección de tiempo debe ajustarse en función de la cinética de activación de cada experimento.

Para generar las curvas sigmoidales de dosis-respuesta que se muestran en la Figura 3C, los valores de ΔBRET medidos a los 15 min después de la estimulación (cuando la meseta se estabiliza) se trazaron contra las diferentes concentraciones de ligandos. La EC50 observada (9,4 nM ± 2,1 nM) está en el rango de valores de Kd conocidos del receptor para isoproterenol (13 nM ± 6 nM)13,14 (Figura 3C,D). Estos resultados demuestran la eficiencia de los sensores G-CASE en la evaluación de la activación de la proteína G con una respuesta observada específicamente asociada con la presencia del β2-AR.

Figura 3: Evaluación del sensorde proteína G s en células HEK wt. Lecturas cinéticas de ΔBRET tras la adición del agonista isoproterenol a las células HEK wt transfectadas con el sensor de proteína Gs y β2-AR (A) o pcDNA3.1 (B). (C) Curvas de dosis-respuesta obtenidas ajustando los valores de ΔBRET (%) después de 15 min de estimulación del ligando a concentraciones variables de ligando. (D) Comparación de los valores máximos de ΔBRET entre las células transfectadas de control pcDNA3.1 y β2-AR estimuladas con isoproterenol. La diferencia estadística con la condición pcDNA3.1 se probó mediante una prueba de Mann-Whitney no paramétrica (**p < 0,01). Los datos muestran ± SEM promedio de tres experimentos independientes realizados por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En segundo lugar, los biosensores se probaron en células HEK CB1, una línea celular HEK 293T que expresa de manera estable el CB1R. Estas células se transfectaron transitoriamente con el sensor de proteínas Gi3-CASE. La estimulación con el agonista CB1R WIN-55,212-2 indujo una señal ΔBRET dependiente de la concentración, lo que indica la activación de la vía Gi3 (Figura 4A). Por el contrario, las células HEK wt transfectadas con el sensor de proteína Gi3-CASE y estimuladas en las mismas condiciones no mostraron ninguna respuesta, lo que confirma la especificidad de la activación de CB1R (Figura 4B). Se alcanzó una meseta aproximadamente 5 minutos después de la activación del ligando. La curva dosis-respuesta correspondiente destacó la respuesta ΔBRET dependiente de la concentración inducida por la estimulación WIN-55,212-2 en células HEK-CB1, mientras que no se observó tal respuesta en células HEK wt (Figura 4C). La EC50 observada (112 nM ± 25 nM) está en el rango de valores de la EC50 conocida del receptor para WIN-55,212-2 (354 nM ± 62 nM)15 (Figura 4C, D). Finalmente, una comparación de los valores de ΔBRET obtenidos 15 min tras la estimulación agonista con 10 μM de WIN-55,212-2 en células HEK CB1 y HEK wt ilustran la activación dependiente de CB1R de la vía de señalización Gi3 (Figura 4D).

Figura 4: Evaluación del sensor de proteína Gi3 en células HEK CB1. Lecturas cinéticas de ΔBRET tras la adición del agonista WIN-55,212-2 a HEK CB1 (A) o células HEK wt (B). Curvas de dosis-respuesta obtenidas ajustando los valores de ΔBRET (%) después de 15 min de estimulación del ligando contra la concentración de ligando (C). Comparación de los valores máximos de ΔBRET entre las células de control HEK wt y HEK CB1 estimuladas con WIN-55.212-2 (D). La diferencia estadística con la condición de peso HEK se probó mediante una prueba de Mann-Whitney no paramétrica (****p < 0,0001). Los datos muestran una media ± SEM de cinco experimentos independientes realizados por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.