Un modelo estandarizado de xenotrasplante cardíaco heterotópico de cerdo a macaco

El xenotrasplante de corazón ofrece una nueva esperanza para los pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal que requieren un trasplante pero no pueden recibir un órgano de donante adecuado debido a la escasez de donantes. En estudios de evaluación preclínica, el xenotrasplante cardíaco de soporte vital ha logrado duraciones de supervivencia de hasta nueve meses, cumpliendo con los criterios de eficacia requeridos para iniciar ensayos clínicos en humanos¹. Con base en estos hallazgos, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) aprobó el uso de acceso ampliado para dos casos clínicos de xenotrasplante cardíaco utilizando corazones de donantes editados genéticamente. Aunque estos casos clínicos han demostrado la viabilidad del xenotrasplante cardíaco, han surgido varios desafíos no resueltos, incluida la hipertrofia cardíaca anormal y el rechazo mediado por anticuerpos 2,3,4,5. Por lo tanto, son necesarios más estudios preclínicos en modelos animales grandes en buenas condiciones de prácticas de laboratorio para proporcionar datos adicionales y desarrollar nuevos regímenes inmunosupresores para garantizar la seguridad de futuros ensayos clínicos en humanos.

La supervivencia a largo plazo de los xenoinjertos ortotópicos de corazón no solo está limitada por el rechazo, sino también por la disfunción primaria del injerto. Se ha informado que la incidencia general de disfunción primaria oscila entre aproximadamente el 40% y el 60% en diferentes equipos de investigación ^4,6,7. Debido a la mayor susceptibilidad de los corazones de donantes porcinos a la lesión isquémica, algunos grupos han desarrollado dispositivos de perfusión hipotérmica para reducir la incidencia de disfunción primaria del injerto. Sin embargo, la hipertrofia cardíaca postoperatoria sigue siendo difícil de controlar. Incluso con cerdos donantes knockout del receptor de la hormona del crecimiento (GHR), la función cardíaca puede verse comprometida por la ausencia de GHR, lo que limita la viabilidad del injerto a largo plazo ^2,3. En este contexto, el xenotrasplante cardíaco heterotópico presenta varias ventajas: evita la precarga y poscarga excesivas, simplifica el procedimiento quirúrgico y reduce el tiempo isquémico total ^8,9. Este modelo refleja mejor la lesión del injerto impulsada por el rechazo xenogénico y, a diferencia del trasplante ortotópico, el xenotrasplante cardíaco heterotópico permite la supervivencia del injerto a largo plazo, laparotomías repetidas para biopsias in vivo y observación prolongada de la activación inmune y la función dinámica de las células inmunes. Sirve como un modelo valioso para investigar los mecanismos de rechazo inmunológico xenogénico y para evaluar la eficacia y seguridad de nuevas estrategias inmunosupresoras^10,11.

Sin embargo, la mayoría de los modelos de xenotrasplante cardíaco heterotópico abdominal han utilizado babuinos como receptores, pero la adquisición de babuinos como animales de experimentación sigue siendo un desafío en muchos países. Por el contrario, los macacos son los primates no humanos más utilizados y tienen una alta homología filogenética con los humanos¹², lo que los convierte en una alternativa práctica para la investigación de xenotrasplantes. Sin embargo, su tamaño corporal significativamente más pequeño en comparación con los babuinos requiere adaptaciones específicas del protocolo quirúrgico para adaptarse a sus distintas dimensiones anatómicas.

Este estudio presenta un protocolo paso a paso para el xenotrasplante cardíaco heterotópico de cerdo GTKO a macaco. El uso de cerdos knockout α-Gal (GTKO) tiene como objetivo principal prevenir el rechazo hiperagudo, que de otro modo conduciría a la falla del injerto minutos después del xenotrasplante cardíaco. Está estructurado de la siguiente manera: (1) principios de compatibilidad entre cerdos donantes y macacos receptores; (2) optimización del procedimiento quirúrgico para el xenotrasplante cardíaco heterotópico; y (3) manejo perioperatorio. Este estudio tiene como objetivo difundir estas técnicas de trasplante para facilitar la comparabilidad entre los equipos de investigación y mejorar la reproducibilidad y la relevancia traslacional de los estudios de xenotrasplante cardíaco.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital Fuwai (FWAEC-JL-010-1/0-2020). Se utilizaron macacos machos que pesaban >9 kg y tenían entre 10 y 15 años, y cerdos miniatura machos de Bama que pesaban 5-6 kg (~ 60 días de edad) para minimizar la compresión abdominal. Se priorizó a los macacos de cuerpo más grande para evitar la compresión abdominal por el corazón del donante y para acomodar el crecimiento posterior al trasplante. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Criterios de selección de donantes y receptores

1. Selección de macaco receptor
   1. Detección de anticuerpos preexistentes: utilice la citometría de flujo para evaluar el nivel de anticuerpos xenogénicos preformados, lo que permite la selección de receptores con bajo riesgo inmunológico.
      NOTA: En este ensayo, las células endoteliales porcinas GTKO de las aortas de cerdo GTKO se aíslan mediante digestión enzimática, como se describió anteriormente¹³.
      1. Incubar células endoteliales porcinas GTKO con plasma receptor.
      2. Cuantifique la unión de IgM e IgG de macaco a células porcinas utilizando anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia contra IgM e IgG de macaco. Seleccione receptores con niveles bajos de anticuerpos preformados.
   2. Evaluación de salud inicial: Realice pruebas de bioquímica sérica, hemograma completo y función de coagulación para confirmar la función orgánica inicial adecuada.
2. Criterios de selección de cerdos donantes
   1. Cribado ecocardiográfico: Seleccione cerdos donantes con función ventricular izquierda y derecha normal, sin anomalías estructurales o funcionales de las válvulas cardíacas, una fracción de eyección superior al 65% y sin evidencia de hipertensión pulmonar.
   2. Compatibilidad de sexo: Seleccione cerdos donantes con el mismo sexo que el receptor.
   3. Tipo de sangre: Seleccione cerdos donantes con tipo de sangre O.

2. Preparación preoperatoria

1. Anestesia y sedación
   1. Anestesia: Inducir macacos con ketamina (10 mg/kg) y midazolam (1 mg/kg) (siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente). Después de la inducción, mantener la anestesia con isoflurano (2%-3%) más dexmedetomidina (1 μg/kg/h) y propofol (1-2 mg/kg/h).
   2. Intubación: Intubar al cerdo donante con un tubo endotraqueal de 5,0 mm. Intubar al macaco receptor con un tubo endotraqueal de 5,5 mm.
   3. Inserción de catéter ureteral: Inserte un catéter urinario de doble luz 6-F en el macaco; omitir en cerdo donante.
2. Preparar y desinfectar campos quirúrgicos
   1. Preparación de la piel: Corta el vello del pecho, el cuello, el abdomen, la espalda y las extremidades.
   2. Desinfección: Frote las áreas afeitadas con povidona yodada, incluidas las pezuñas (cerdos) o las manos y los pies (monos).
3. Colocación de catéter venoso central en el receptor
   1. Posicionamiento: Coloque al macaco receptor en un decúbito lateral izquierdo parcial con elevación del hombro para optimizar la exposición de la región cervical derecha. Seleccione la vena yugular interna derecha como el sitio preferido para el acceso venoso central.
   2. Esterilización y drapeado: desinfecte y cubra el campo quirúrgico con povidona yodada siguiendo los procedimientos asépticos estándar.
   3. Incisión y exposición del vaso: Realice una incisión de 5 cm aproximadamente 1 cm medial al músculo esternocleidomastoideo, paralela a su borde interno. Realice una disección roma de la fascia y retraiga el músculo lateralmente.
      1. Identificar la vena yugular externa, que se encuentra superficial y fuera de la vaina carotídea. Lime con cuidado las pequeñas ramas comunicantes de la vena yugular interna. Abra la vaina carotídea para exponer la vena yugular interna, el nervio vago y la arteria carótida.
   4. Inserción del catéter: Inserte un catéter venoso central de triple luz 8-F utilizando una técnica de tunelización retrógrada. Conecte el extremo proximal del catéter a la aguja de tunelización en condiciones estériles y tire de él a través del túnel hacia la incisión del cuello.
      1. Exteriorizar el extremo distal en el punto medio de la escápula. Recorte el catéter a una longitud adecuada para asegurarse de que su punta llegue a la unión de la vena cava superior y la aurícula derecha.
   5. Cierre de la incisión: Cierre la herida en capas. Cierre la fascia y el tejido subcutáneo con suturas absorbibles 3-0 y cierre la piel con suturas de seda 1-0. Garantizar una cobertura completa y una fijación segura del catéter debajo de la capa fascial para minimizar el riesgo de infección.
      1. Utilice el catéter venoso central como una vía crítica de acceso a fluidos para la administración de medicamentos postoperatorios y la reanimación de volumen en macacos. Realice diariamente antisepsia con povidona yodada y vendaje de gasa estéril para preservar la integridad del catéter y prevenir infecciones.
      2. Mantenga el catéter venoso central in situ hasta el procedimiento de sacrificio final para garantizar un acceso vascular confiable.

3. Cirugía del receptor (fase preimplantacional)

1. Incisión abdominal en la línea media
   1. Selección de la incisión: Haga una incisión abdominal en la línea media de aproximadamente 12-15 cm de longitud (Figura 1A).
   2. Detalles de la incisión: Incidir secuencialmente a través de la piel, la fascia superficial, la línea alba, la fascia transversal y la fascia subperitoneal (incluida la grasa extraperitoneal), luego hacer una incisión en el peritoneo parietal para acceder a la cavidad abdominal. Use una cuchilla quirúrgica # 23 para la incisión en la piel y electrocauterio para una disección de tejido más profunda para lograr un corte y una hemostasia simultáneos.
2. Exploración abdominal y manejo intestinal
   1. Adhesiolisis: Explorar la cavidad abdominal para evaluar las adherencias, centrándose en la presencia de adherencias entre los intestinos y la pared abdominal. Si está presente, diseccione cuidadosamente las adherencias con electrocauterio para minimizar la lesión tisular y reducir el riesgo de obstrucción intestinal mecánica postoperatoria.
   2. Protección intestinal: exteriorice suavemente el intestino delgado y colóquelo sobre una gasa húmeda estéril para protegerlo y exponer la aorta abdominal y la vena cava inferior.
3. Exposición de la aorta abdominal y vena cava inferior
   1. Movilizar la aorta abdominal y la vena cava inferior: Diseccionar cuidadosamente los tejidos circundantes de la aorta abdominal y la vena cava inferior, minimizando el riesgo de lesión vascular y sangrado. Exponga la aorta abdominal y la vena cava inferior entre los orígenes de las arterias renales y la bifurcación de las arterias ilíacas lo más completamente posible.
   2. Manejar las ramas vasculares: Preservar la arteria mesentérica inferior y la vena que la acompaña durante la disección. Conserve meticulosamente todas las ramas lumbares.

4. Obtención de corazón de donante

1. Esternotomía mediana y movilización de vasos
   1. Esternotomía mediana: Realice una esternotomía de línea media para acceder a la cavidad torácica (Figura 1B). Divida cuidadosamente el esternón donante con un cuchillo de esternón Lebsche.
   2. Movilización de vasos: Después de exponer la cavidad torácica, haga una incisión en el pericardio y diseccione meticulosamente para separar la aorta ascendente y la arteria pulmonar principal.
2. Pinzamiento de vasos y enfriamiento cardíaco
   1. Pinzamiento de vasos: Coloque una sutura de cuerda de bolsa 4-0 en la raíz aórtica, luego inserte una cánula de cardioplejía anterógrada de un solo uso para cardioplejia (Figura 1C). Pinzar secuencialmente la vena cava superior e inferior, seguido de pinzar transversalmente la aorta ascendente.
      1. Inmediatamente después del pinzamiento cruzado aórtico, haga una incisión en las venas pulmonares y la vena cava inferior para descomprimirlas, asegurándose de que las incisiones sean lo suficientemente grandes para un drenaje suficiente.
   2. Enfriamiento cardíaco: Succionar la cavidad pericárdica para evacuar la sangre residual, luego sumergir inmediatamente el corazón en solución salina estéril helada para lograr un ambiente hipotérmico (0-4 °C).
3. Monitorización de cardioplejia y perfusión
   1. Cardioplejia: Mantenga la presión de perfusión a 150 mmHg usando una bolsa de presión. Perfundir el corazón del donante con 30 ml/kg de peso corporal de solución HTK (p. ej., 150 ml para un cerdo de 5 kg).
   2. Monitorización de la perfusión: palpar simultáneamente la raíz aórtica y el ventrículo izquierdo para verificar la presión adecuada de administración de la cardioplejía y prevenir la distensión ventricular. Después de completar la infusión de cardioplejia, confirmar el paro cardíaco mediante palpación e inspección visual. Asegúrese de la ausencia de fibrilación miocárdica, luego proceda con la escisión del corazón del donante.
4. Resección y preservación cardíaca
   1. Resección cardíaca: Después de la cardioplejia, aplique hielo adicional en la cavidad pericárdica (Figura 1D). Eleve suavemente el corazón y seccione secuencialmente la vena cava inferior y las venas pulmonares con unas tijeras quirúrgicas. Tenga especial cuidado para evitar lesiones en la vena cava superior y la aurícula derecha al dividir la vena pulmonar superior derecha.
      1. Proteja la tráquea mientras disocia la pared posterior de la aurícula izquierda. Una vez que la disección alcanza el nivel del techo auricular izquierdo y las arterias pulmonares, vuelva a colocar temporalmente el corazón en la cavidad pericárdica.
      2. Disociar y seccionar el arco aórtico proximal y la vena cava superior para exponer el tronco pulmonar. Continúe la disección a lo largo de los planos de tejido hacia el techo auricular izquierdo, lo que permite la extirpación del corazón y sus grandes vasos.
         NOTA: Lime firmemente el muñón de la vena ácigos después de la resección cardíaca para evitar el sangrado.
   2. Preservación cardíaca: sumerja inmediatamente el corazón explantado en solución salina helada para su preservación. Además, perfunda el corazón del donante con otra solución de la Universidad de Wisconsin (UW) a un volumen de 30 ml / kg, ya que la solución de UW proporciona una protección miocárdica superior (Figura 1E).
5. Diferencias clave con la obtención de corazón de donante humano
   1. Ajustes de presión de infusión: Ajuste la presión de perfusión en la bolsa de presión a 150 mmHg, que se considera óptima para la perfusión miocárdica.
   2. Posición de pinza cruzada aórtica: Dado que los cerdos tienen solo dos ramas principales del arco aórtico, los troncos braquiocefálicos izquierdo y derecho, coloque la pinza cruzada entre estas ramas. Lite el tronco braquiocefálico derecho con suturas de seda antes del pinzamiento cruzado para preservar una mayor longitud de la aorta donante.
   3. Estrategia de descompresión ventricular: Para minimizar la sobredistensión ventricular y limitar el tiempo isquémico, descomprima solo el ventrículo izquierdo de forma rutinaria. Si el ventrículo derecho comienza a hincharse, abra la vena cava superior por encima de la vena ácigos. Si el ventrículo izquierdo se hincha, haga una incisión en la vena pulmonar derecha y extienda la incisión hacia el hilio pulmonar derecho.

5. Implantación de corazón de donante

1. Preparación del corazón del donante
   1. Preparación del corazón del donante: Cierre de forma segura la vena cava superior, la vena cava inferior y los orificios de la vena pulmonar del donante de la aurícula izquierda con suturas de prolene 4-0.
   2. Preservación del nódulo sinoauricular: Preservar la vena cava superior donante y el nódulo sinoauricular ubicado cerca del apéndice auricular derecho.
2. Anastomosis de extremo a lado de la arteria pulmonar a la vena cava inferior
   1. Heparinización: Administrar 5,000 unidades de heparina sódica por vía intravenosa al macaco receptor antes de la anastomosis del corazón del donante para prevenir la formación de trombos.
   2. Anastomosis de la arteria pulmonar: Coloque una pinza tangencial atraumática DeBakey en la vena cava inferior receptora. Cree una incisión longitudinal ligeramente más grande que la arteria pulmonar donante para minimizar la estenosis postoperatoria.
      1. Con una sutura de prolene 5-0 de doble brazo, comience la anastomosis en la posición de las 12 en punto insertando una aguja desde el interior (lado luminal) del vaso receptor hacia afuera. Introducir la otra aguja desde el lado de la arteria pulmonar donante, pasando de la luz hacia el exterior en la posición correspondiente de las 12 horas.
      2. Haga el nudo inicial en la pared externa del recipiente. Invierta la dirección de la aguja, pasando desde el exterior hacia la luz de la arteria pulmonar donante. Continúe suturando continuamente en el sentido de las agujas del reloj hacia la posición de las 6 en punto, usando un gancho nervioso para mantener la tensión de la sutura.
      3. Gire el corazón para exponer el lado opuesto, cambie a la otra aguja y suture la pared contralateral de 12 a 6 en punto con un patrón de entrada de aguja de afuera hacia adentro en el vaso receptor y de adentro hacia afuera en el vaso donante, completando la anastomosis de extremo a lado.
   3. Evacuación de aire: Antes de asegurar el nudo final, inyecte solución salina en el sitio anastomótico para garantizar una evacuación completa del aire. Ocluya la arteria pulmonar donante con una pinza vascular atraumática, luego libere secuencialmente la pinza vascular de la vena cava inferior (Figura 1F).
3. Anastomosis de extremo a lado de la aorta del donante a la aorta abdominal del receptor
   1. Anastomosis aórtica: pinzar parcialmente la aorta abdominal receptora con una pinza tangencial atraumática DeBakey. Hacer una incisión longitudinal ligeramente más grande que el diámetro de la aorta donante para prevenir la estenosis postoperatoria.
      1. Con una sutura de prolene 5-0 de doble brazo, comience la anastomosis insertando la aguja en la posición de las 12 en punto desde el interior (lado luminal) de la aorta receptora hacia afuera. Inserte la otra aguja de la aorta donante en la posición de las 12 en punto, también de adentro hacia afuera, y ate la primera puntada en la pared externa del vaso.
      2. Invierta la dirección de la aguja, pasando de afuera hacia adentro en el vaso donante, y suture continuamente en el sentido de las agujas del reloj hasta la posición de las 6 en punto, manteniendo la tensión de la sutura con un gancho nervioso. Voltee el corazón para exponer el lado opuesto, invierta la dirección de la aguja en consecuencia (de afuera hacia adentro en el vaso donante, de adentro hacia afuera en el vaso receptor) y suture continuamente de 12 a 6 en punto, completando la anastomosis de extremo a lado.
   2. Evacuación de aire: Antes de hacer el nudo final, inyecte solución salina en la anastomosis para eliminar el aire. Libere secuencialmente el pinzamiento vascular aórtico abdominal para restaurar la circulación (Figura 1G).
4. Reperfusión y desfibrilación
   1. Prevención de la fibrilación ventricular: Administrar 3 mg/kg de lidocaína por vía intravenosa antes de la reperfusión para prevenir la fibrilación ventricular. Observe el corazón del donante para detectar contracciones espontáneas en 2 minutos.
   2. Desfibrilación: Si se produce fibrilación ventricular, aplique la desfibrilación directa colocando las paletas en contacto directo con ambas superficies ventriculares (izquierda y derecha) y administre una descarga bifásica de 5 julios. El tiempo isquémico total del corazón donante fue de aproximadamente 57,5 min ± 6,1 min (Tabla 1).
5. Colocación de drenajes
   1. Drenaje con presión negativa: Coloque un tubo de drenaje con presión negativa en la cavidad abdominal para evitar la acumulación de líquido postoperatorio y controle la hemorragia activa.
   2. Indicación para la extracción del drenaje: Controlar el volumen de drenaje postoperatorio y retirar el drenaje abdominal cuando la producción de 24 h caiga por debajo de 25 ml.
6. Cierre abdominal
   1. Cierre abdominal y examen ecográfico: Cerrar la pared abdominal por capas, aproximando la fascia y el tejido subcutáneo con suturas absorbibles 3-0, y cerrar la piel con suturas de seda 1-0. Realizar ecografía abdominal postoperatoria para valorar la actividad cardíaca (Figura 1H).

6. Manejo postoperatorio y monitoreo del injerto

1. Pautas de seguimiento y cuidados generales
   1. Monitoreo conductual y de síntomas: Monitoree continuamente el estado del receptor durante las dos primeras semanas postoperatorias mediante videovigilancia. Realizar evaluaciones diarias del comportamiento, el apetito, la distensión abdominal, la disnea, el edema y la defecación y micción normales.
      1. Controle el peso corporal, la condición física general, la cicatrización de la incisión quirúrgica, la posible infección del catéter venoso central, la apariencia de la mucosa y la acumulación de líquido intraabdominal.
   2. Evaluación por ultrasonido: use ultrasonido para evaluar la función del corazón trasplantado heterotópicamente y detectar cualquier derrame circundante si hay anomalías. La Figura 2 presenta imágenes ecocardiográficas del xenoinjerto durante la diástole y la sístole en el día postoperatorio (POD) 1, junto con la falla del injerto observada en el Experimento M3. La línea roja indica una marcada hipertrofia de la pared ventricular izquierda en el xenoinjerto fallido.

Con base en los pasos de procedimiento ilustrados en la Figura 1, se estableció con éxito un modelo de xenotrasplante cardíaco heterotópico reproducible de cerdo a macaco. El proceso quirúrgico incluyó una laparotomía de la línea media en el macaco receptor para acceder a la cavidad abdominal y una esternotomía mediana en el cerdo donante para la obtención de corazón. Después de la pericardiotomía, el corazón del donante se detuvo con una solución de HTK y se conservó con una solución de UW bajo hipotermia tópica. Las anastomosis vasculares se realizaron de manera de extremo a lado entre la arteria pulmonar donante y la vena cava inferior receptora, y entre la aorta donante y la aorta abdominal receptora. La evaluación ecocardiográfica postoperatoria confirmó que el corazón donante reanudó la actividad contráctil con función sistólica y diastólica preservada, lo que indica una reperfusión exitosa y viabilidad del injerto. Estos resultados demuestran la viabilidad técnica del modelo y su potencial para el monitoreo funcional a largo plazo de xenoinjertos en primates no humanos.

Figura 1: Trasplante cardíaco heterotópico de cerdo a macaco: pasos quirúrgicos y ultrasonido postoperatorio. (A) Se ingresó a la cavidad abdominal del macaco a través de una laparotomía de la línea media con disección en capas. (B) Se realizó una esternotomía mediana para acceder a la cavidad torácica del donante porcino, seguida de pericardiotomía. (C) Se insertó una cánula de perfusión en la raíz aórtica del corazón del donante. (D) Después de un paro cardíaco inducido por la perfusión de la solución HTK, el corazón del donante se enfrió tópicamente con aguanieve salina. (E) Se realizó una perfusión posterior con la solución de preservación de la Universidad de Wisconsin (UW). (F) Se creó una anastomosis de extremo a lado entre la arteria pulmonar porcina y la vena cava inferior del receptor. (G) Se construyó una anastomosis de extremo a lado entre la aorta porcina y la aorta abdominal del receptor. (H) Se realizó una ecocardiografía postoperatoria para evaluar la función sistólica y diastólica del corazón del donante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes ecocardiográficas de series temporales de M3. (A) Imágenes ecocardiográficas del xenoinjerto durante la diástole y la sístole en el día postoperatorio (POD) 1. (B) Imágenes ecocardiográficas del xenoinjerto durante la diástole y sístole en el POD 3. (C) Imágenes ecocardiográficas del xenoinjerto durante la diástole y sístole en el POD 10. (D) Imágenes ecocardiográficas del xenoinjerto durante la diástole y la sístole en el fracaso del injerto. La línea roja indica un aumento significativo en el grosor de la pared ventricular izquierda durante la diástole. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Tiempo isquémico total del corazón del donante.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.