Desentrañando las complejidades de la xenofagia: lecciones de Legionella pneumophila

La prevalencia de cepas bacterianas resistentes a los medicamentos ha hecho imperativo buscar nuevos enfoques antibacterianos para combatir las enfermedades infecciosas. La autofagia, un proceso eucariota fundamental por el cual las células desarrollan vesículas fagocíticas que contienen proteínas u orgánulos celulares, juega un papel esencial en la regulación de la homeostasis celular y varios procesos metabólicos¹. A medida que se profundiza el conocimiento de la autofagia, los investigadores han descubierto que las vesículas autofágicas pueden dirigirse selectivamente a orgánulos, proteínas o^{patógenos específicos}. La xenofagia se refiere al proceso por el cual las células reconocen selectivamente patógenos intracelulares a través de la autofagia y los entregan a los lisosomas para su eliminación³. Este proceso es crítico para el mecanismo de defensa del sistema inmunológico innato en organismos eucariotas⁴. En consecuencia, dilucidar sus mecanismos y regulación es un área esencial de investigación, con implicaciones significativas para el desarrollo de nuevas estrategias antiinfecciosas.

Legionella pneumophila es un patógeno intracelular gramnegativo que generalmente infecta a protistas unicelulares acuáticos. Sin embargo, los humanos pueden desarrollar infecciones oportunistas por contacto con agua contaminada, lo que lleva a la enfermedad del legionario, una forma grave de neumonía⁵. Al ingresar a la célula huésped, Legionella emplea el sistema de secreción tipo IV (T4SS) para transportar aproximadamente 330 proteínas efectoras, lo que ayuda a evadir la respuesta inmune del huésped y garantiza la supervivencia bacteriana y la proliferación dentro de las células. La Legionella, al igual que la Salmonella, dificulta la xenofagia del huésped utilizando proteínas efectoras, aunque aún no se ha establecido el mecanismo molecular preciso⁶. Por ejemplo, Salmonella Typhimurium libera efectores de secreción tipo III (p. ej., SopF) que ADP-ribosilan la V-ATPasa vacuolar y bloquean el inicio de la autofagia⁷, mientras que L. pneumophila usa el T4SS y efectores como RavZ y SidE para interferir con las etapas posteriores de la xenofagia ^6,8. A pesar de estas diferentes tácticas, ambos patógenos finalmente evaden la eliminación xenófaga, lo que destaca las estrategias convergentes en la evasión de la autofagia. Por lo tanto, la investigación de estas proteínas de virulencia no solo contribuye al desarrollo de terapias antiinfecciosas específicas, sino que también tiene el potencial de arrojar luz sobre las complejidades moleculares de la xenofagia.

Mecanismos de la xenofagia en la eliminación de patógenos

En 1984, Rikihisa et al. hicieron un descubrimiento significativo de que los neutrófilos infectados por Rickettsia producen autofagosomas, marcando el primer caso de participación de la autofagia en infecciones bacterianas⁹. Un estudio posterior encontró que la inducción de autofagia en macrófagos a través de la rapamicina da como resultado la colocalización de las proteínas relacionadas con la autofagia LC-3 y Beclin-1 con vesículas que contienen Mycobacterium tuberculosis , evitando la proliferación bacteriana dentro de las células¹⁰. Además, se sabe que los patógenos intracelulares como Salmonella typhi, Listeria, Shigella flexneri y Burkholderia mallei inducen autofagia, que posteriormente controla su crecimiento dentro de las células huésped¹¹.

La xenofragia, una forma de autofagia selectiva, comprende tres procesos distintos: reconocimiento de carga, reclutamiento de receptores de autofagia y degradación mediada por lisosomas (como se muestra en la Figura 1). Sin embargo, el mecanismo por el cual las células reconocen a los patógenos invasores (reconocimiento de carga) e inician la autofagia sigue sin estar claro. Los estudios sugieren que cuando las bacterias se infiltran en el citoplasma, la ubiquitina ligasa une la ubiquitina a las vacuolas infectadas por patógenos o a las proteínas presentes en la superficie de los patógenos 12,13,14. Estas proteínas marcadas luego se ensamblan en una capa de ubiquitina, encerrando el patógeno y actuando como una plataforma de señalización para el reclutamiento de adaptadores de autofagia, que incluyen principalmente p62 / SQSTM1, NDP52, NBR1 y optineurina. Los adaptadores de autofagia facilitan la xenofagia al interactuar con proteínas a través del dominio que interactúa con LC3 (LIR), además del dominio de unión a ubiquitina (UBD) que media la unión de proteínas ubiquitinadas¹⁵. Por ejemplo, las ligasas E3 del huésped como LRSAM1 y Parkin unen ubiquitina a las bacterias invasoras, generando así la señal de recubrimiento de ubiquitina que las marca para la eliminación xenofágica^16,17. Además, los receptores de xenofagia también pueden iniciar la xenofagia uniéndose a la galectina en la superficie del fagosoma bacteriano o interactuando directamente con las proteínas de la superficie bacteriana^18,19. Otra perspectiva propone que las bacterias dentro del fagosoma pueden alterar los gradientes iónicos de la vesícula dañando la membrana, lo que lleva a cambios conformacionales en las V-ATPasas en la membrana fagosomal, que reclutan el complejo Atg5-Atg12-Atg16L1 a través de la unión al dominio WD40 de ATG16L1 ^7,20. ATG16L1 también puede unirse al complemento C3 que recubre las bacterias engullidas a través de su dominio WD40, reclutando el complejo Atg5-Atg12-Atg16L1 al fagosoma bacteriano²¹. No está claro si estos diferentes mecanismos de reconocimiento se dirigen a distintas especies bacterianas o si ocurren en diferentes etapas de la infección. Se necesita más investigación y exploración para comprender completamente estos mecanismos.

Estrategias de los patógenos para evadir la xenofagia

Durante la coevolución con su huésped, los patógenos intracelulares han desarrollado diversos mecanismos para inhibir la xenofagia 22,23,24. Esto da como resultado una respuesta xenófaga débil durante las infecciones, lo que dificulta su^{observación25}. Por ejemplo, el estreptococo beta-hemolítico secreta una cisteína proteasa llamada SpeB que se dirige a p62, NDP52 y NBR1 para su degradación. Los mutantes con deleción de SpeB no pudieron resistir la autofagia y se suprimió su crecimiento dentro de las células. Estos hallazgos confirman el papel esencial de estos adaptadores de autofagia en la xenofagia. Se ha descubierto que la proteína de virulencia VirG de Shigella flexneri induce la xenofagia al reclutar Atg5 en la superficie bacteriana¹⁹. Sin embargo, la bacteria también emplea el sistema de secreción tipo III para transportar la proteína efectora IcsB, que inhibe la unión de ATG5 a VirG¹⁹. En consecuencia, se evita que ocurra la autofagia¹⁹. Esta competencia entre las proteínas bacterianas y la maquinaria de autofagia sugiere que las proteínas Atg pueden reconocer directamente las proteínas de la superficie bacteriana para iniciar la xenofagia. De manera similar, la proteína de virulencia CpbC de Streptococcus pneumoniae induce la degradación autofágica de Atg14 al formar un complejo p62-CpbC-Atg14, que a su vez disminuye el nivel de Atg14. Esto afecta al complejo Atg14-STX17, que media la interacción de los lisosomas, inhibiendo así la xenofagia²⁶.

En un estudio que utilizó Salmonella como bacteria modelo, Xu et al. descubrieron que el daño de la vesícula de la membrana causado por la infección es detectado por la V-ATPasa, lo que conduce a la activación de la xenofagia a través de la unión al dominio WD40 del ATG16L1⁷. Esta activación no forma parte de la vía típica de la autofagia. Además, la proteína de virulencia SopF tiene la capacidad de mediar la ADP-ribosilación (ADPRilación) de las V-ATPasas e inhibir su capacidad para iniciar la xenofagia⁷. Esto ilustra cómo las bacterias y sus proteínas de virulencia secretadas pueden usarse como herramientas valiosas para investigar y comprender el complejo fenómeno y los mecanismos de la autofagia, que a menudo son difíciles de explorar en condiciones fisiológicas normales.

Legionella y xenofagia

L. pneumophila establece un nicho replicativo llamado vacuola que contiene Legionella (LCV) mediante la manipulación de actividades biológicas esenciales como la ubiquitinación del huésped²⁷, el transporte de vesículas²⁸, el metabolismo energético²⁹ y la motilidad celular³⁰. A pesar de la presencia de numerosas proteínas ubiquitinadas dentro de las bacterias intracelulares³¹Legionella ha desarrollado diversos mecanismos para contrarrestar la autofagia, evitando la fusión de LCV con lisosomas ^6,8.

RavZ inhibe la autofagia al escindir LC3-II

La primera proteína efectora de Legionella que se encuentra para regular la autofagia es RavZ (Lpg1683). Como cisteína proteasa, RavZ escinde el enlace amida entre la glicina terminal de carbono y el residuo de aminoácido anterior de LC3, lo que lleva a un deterioro irreversible de la lipidación de LC3⁸. En comparación con la Legionella de tipo salvaje, la cepa mutante con deleción RavZ (ΔravZ) mostró un aumento significativo en los niveles de LC3-II y el número de puntos LC3 en las células huésped después de la infección⁸. Una cepa de Listeria modificada genéticamente (ΔhlyΔprfAcLLO) puede desencadenar una fuerte respuesta xenófaga al ingresar a las células. Cuando se coinfectan las células, la Legionella de tipo salvaje puede suprimir la acumulación de LC3 alrededor de la cepa ΔhlyΔprfAcLLO, pero ΔravZ pierde su capacidad de inhibir la inducción de la xenofagia⁶ de la cepa. Además, la expresión transitoria de RavZ en las células huésped inhibe la autofagia inducida por inanición⁸. Estos resultados sugieren que RavZ ejerce un amplio efecto de acción trans (es decir, actúa de forma difusa en el citosol) para antagonizar la autofagia. Sorprendentemente, la replicación del mutante ΔravZ no se vio afectada en las células huésped, y no hubo reclutamiento aparente de LC3 en la membrana LCV que contiene el mutante ΔravZ ^6,8. Estos hallazgos sugieren que Legionella puede utilizar otras proteínas efectoras, además de RavZ, para evadir la xenofagia del huésped.

Familia SidE y xenofagia

La familia SidE consta de cuatro proteínas homólogas de más de 170 kDa de tamaño, denominadas SdeA, SdeB, SdeC y SidE³². Estas proteínas de virulencia son estructuralmente similares con redundancia funcional, todas las cuales contienen un dominio mono ADP-ribosiltransferasa (mART) y un dominio fosfodiesterasa (PDE). Los estudios han encontrado que en ausencia de la enzima activadora de ubiquitina (E1) y la enzima conjugadora de ubiquitina (E2), la familia SidE funciona como una ubiquitina ligasa independiente (E3), catalizando la modificación única de la ubiquitinación fosforribosil (PR-Ub) de los sustratos 33,34,35. Este proceso ocurre en dos pasos. Tomando como ejemplo la SdeA, en primer lugar, la SdeA modifica el residuo Arg42 de la ubiquitina (Ub) con el grupo adenosina difosfato ribosa (ADPR) derivado de NAD+ utilizando su dominio mART, generando un producto intermedio de ADPR-Ub^33,36. Luego, el enlace fosfodiéster de ADPR-Ub es escindido por el dominio funcional PDE de SdeA, lo que resulta en la liberación de AMP y la conexión de PR-Ub con el residuo de serina de la proteína sustrato³⁶.

La familia SidE tiene numerosos sustratos de proteínas eucariotas. Además de mediar la ubiquitinación fosforribosil de GTPasas como Rab1A, Rab6A y Rab33B para interferir con el transporte vesicular^33,37, estudios recientes han encontrado que la familia SidE también tiene funciones antagónicas contra la xenofagia ^6,38,39,40. En comparación con la Legionella de tipo salvaje, las cepas mutantes que carecen de los genes codificantes de la familia SidE (ΔsidEs) muestran un aumento significativo en el reclutamiento de p62 en el LCV⁶. A diferencia de RavZ, que actúa en trans, la familia SidE trabaja en cis (actuando localmente en el LCV) para proteger la propia vacuola de Legionella de la xenofagia. Las proteínas de la familia Legionella que transportan SidE no pueden suprimir el reclutamiento de p62 alrededor de cepas de Listeria ΔhlyΔprfAcLLO coinfectadas⁶. Al igual que la cepa ΔravZ, el mutante ΔsidEs también puede evadir la xenofagia del huésped. El mecanismo por el cual SidE antagoniza la xenofagia no está claro y puede estar relacionado con su interferencia con el sistema de ubiquitinación del huésped mediada por la ubiquitinación fosforribosilo. Por ejemplo, la fosforribosilación de la ubiquitina por SidE podría impedir el reconocimiento del LCV por parte de los receptores de unión a la ubiquitina, bloqueando así el reclutamiento de adaptadores como NDP52 u optineurina a la vacuola.

Otros efectores involucrados en la xenofagia

Además de RavZ y SidE, L. pneumophila codifica otros efectores, incluidos LpSpl, Lpg1137 y Lpg2936, que se dirigen a varias etapas de la vía de la autofagia. LpSpl es una enzima secretada que imita la esfingosina-1-fosfato liasa, escindiendo la esfingosina-1-fosfato (S1P) en metabolitos⁴¹. Este agotamiento de S1P por LpSpl previene la acumulación de esfingosina y da como resultado la activación de mTORC1, inhibiendo así el inicio de la autofagia⁴¹. Lpg1137 es una proteasa que escinde la proteína SNARE Syntaxin 17 (Stx17), que es necesaria para la fusión autofagosoma-lisosoma⁴². Al degradar Stx17, Lpg1137 interfiere con la maduración del autofagosoma y bloquea el paso final de fusión de la xenofagia⁴². Lpg2936 es un efector nuclear que causa modificaciones epigenéticas de genes relacionados con la autofagia (como ATG7 y LC3B), lo que conduce a su expresión reducida⁴³. Esta regulación a la baja de los componentes centrales de la autofagia inhibe la biogénesis de los autofagosomas a nivel transcripcional⁴³. Sin embargo, se sabe poco sobre las funciones de LpSpl, Lpg1137 y Lpg2936 en la infección por Legionella ; sus contribuciones a la evasión de la xenofagia in vivo aún no se han dilucidado por completo.

La Tabla 1 resume los efectores clave de L. pneumophila involucrados en la supresión de la xenofagia, sus objetivos y funciones, y las etapas de la xenofagia a las que afectan.

Perspectiva de futuro

Persisten incertidumbres clave que sugieren próximos pasos concretos. En primer lugar, la jerarquía temporal de los efectores de Legionella que actúan sobre la xenofagia no está resuelta (LpSpl/mTORC1 temprano versus RavZ medio/tardío, SidE); en segundo lugar, varios efectores moduladores de la autofagia (por ejemplo, LpSpl, Lpg2936) carecen de validación in vivo ; En tercer lugar, la heterogeneidad del tipo celular de las respuestas xenófagas en los subconjuntos de macrófagos, el epitelio y los neutrófilos está mal mapeada. Proponemos atlas de infección resueltos en el tiempo (persecución de pulsos, lipidómica de LC3, proteómica de PR-ubiquitina, reporteros en vivo) para ordenar acciones efectoras; cepas de deleción efectora emparejadas (ΔravZ/ΔsidE/ΔlpSpl/Δlpg2936) en modelos de ratón específicos del tipo de célula para establecer la causalidad; y multiómica unicelular / espacial más CRISPR / perturb-seq que se centra en el eje V-ATPasa-ATG16L1, el etiquetado LRSAM1 / Parkin y los módulos adaptadores (OPTN / NDP52 / p62). Traslacionalmente, prevemos inhibidores dirigidos por efectores que bloquean RavZ (sitio activo de la cisteína proteasa) o SidE (ubiquitinación de PR-mART / PDE) para restaurar las reservas de LC3-II y el reclutamiento de adaptadores en el LCV, junto con impulsores dirigidos al huésped que mejoran el etiquetado de carga (activan LRSAM1 / Parkin), estabilizan el compromiso del adaptador-LC3 y sintonizan transitoriamente el flujo (activación de TFEB, mTORC1 moderado). La administración dirigida a los pulmones (p. ej., nanopartículas inhaladas que combinan un agente anti-RavZ/SidE con un agonista de TFEB) debe compararse mediante lecturas resueltas por tipo de célula con marca de tiempo (flujo de LC3, ocupación de PR-Ub, reclutamiento de adaptadores, métricas de fusión) y eficacia in vivo (carga bacteriana, patología, supervivencia).

L. pneumophila ha desarrollado una impresionante variedad de estrategias para evadir la xenofagia, principalmente a través de sus diversas proteínas efectoras que interfieren con el reconocimiento de la carga, la ubiquitinación, la maduración de los autofagosomas y la fusión lisosomal. Estos mecanismos no solo permiten que el patógeno sobreviva y se replique dentro de las células huésped, sino que también revelan aspectos novedosos de la regulación de la autofagia. Comprender estas tácticas de evasión proporciona información valiosa sobre la compleja interacción entre la defensa del huésped y la adaptación microbiana. La investigación futura debe centrarse en identificar efectores adicionales, dilucidar sus objetivos moleculares y aclarar su regulación temporal durante la infección. Además, aprovechar estos conocimientos mecanicistas podría guiar el desarrollo de terapias dirigidas al huésped o nuevos agentes antimicrobianos que restauren la función de la xenofagia. La integración continua de imágenes avanzadas, biología estructural y enfoques ómicos será crucial para diseccionar las interacciones dinámicas entre L. pneumophila y la maquinaria de autofagia, lo que podría conducir a estrategias innovadoras para combatir los patógenos intracelulares.

Finalmente, muchos efectores de Legionella son multifuncionales y afectan múltiples procesos del huésped más allá de la autofagia. Los mismos efectores que ayudan a L. pneumophila a evadir la xenofagia también pueden modular la muerte de las células huésped (apoptosis) y las vías de señalización inmune, promoviendo aún más la supervivencia bacteriana 23,30,35,44,45. Esta diafonía entre la evasión de la autofagia y otros mecanismos de defensa del huésped subraya la necesidad de estudiar las tácticas de virulencia de Legionella de manera integral. Explorar cómo los efectores dirigidos a la autofagia influyen simultáneamente en la apoptosis y la inflamación proporcionará una comprensión más completa de las interacciones huésped-patógeno y puede revelar nuevos objetivos para la intervención terapéutica.

Figura 1: Representación esquemática del mecanismo de la xenofagia. Cuando las bacterias invaden el citoplasma, la ubiquitina se conjuga con las proteínas presentes en la superficie del patógeno o en las vacuolas infectadas por el patógeno, seguidas de la formación de una capa de ubiquitina que encierra al patógeno. Esta capa de ubiquitina actúa como una plataforma de señalización para el reclutamiento de adaptadores de autofagia. Además, los receptores de autofagia pueden iniciar la xenofagia uniéndose a la galectina de la superficie del fagosoma bacteriano o interactuando directamente con las proteínas de la superficie bacteriana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Estrategias de evasión de la xenofagia de los efectores de L. pneumophila. Esta tabla enumera las proteínas efectoras seleccionadas de L. pneumophila, sus objetivos moleculares o actividades, y la etapa de la vía de la xenofagia que interrumpen.