3.10: Extracción de sonicación de biomarcadores lípidos de sedimento

1. recoger el material necesario

1. Muestras (hojas, suciedad, hongos, corteza, tejido), generalmente congelado, liofilizado, aplastado y homogeneizada antes de la extracción, extraída en grupos para maximizar la eficiencia. Extraer tres muestras.
2. Dependiendo del tamaño de la muestra, deben utilizarse frascos con volúmenes que van de 4-60 mL. Para este experimento, se utilizan frascos de vidrio de borosilicato (40 mL) y casquillos seguros solvente. Viales, pipetas de vidrio de borosilicato y latas de pesaje deben ser quemado a 550 ° C antes de 6 h asegurar el retiro de posibles contaminantes orgánicos.
3. Diclorometano y metanol son comunes en los laboratorios de geoquímica orgánicos más. Se utilizan individualmente para limpiar instrumentos de laboratorio y cristalería antes de usar. Una mezcla de diclorometano (DCM) en metanol (MeOH; 9:1) se utiliza en muchos laboratorios para extraer eficientemente biomarcadores con un amplio rango de polaridades. Disolventes deben estar libres de contaminantes orgánicos.
4. Utilizar un baño de sonicación a temperatura ambiente. Una gama de tamaños de sonicador y sonicación con o sin calor están disponibles en tiendas de equipamiento científico mayor.
5. Estantes de vial, que deben ser resistente al agua, se colocará en el baño de sonicación.
6. Solvente había aprobado Campana química.

2. preparación de muestra

1. Coloque una combustión peso de lata en la escala de laboratorio y Tara.
2. Enjuague el espátula de laboratorio con solvente, luego utilizar para transferir una masa adecuada de muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa.
   1. La masa de la muestra varía en función de su contenido de materia orgánica. Materia orgánica relativamente magro material (barro marino) puede requerir varios gramos, mientras que el material rico de materia orgánica (tejido foliar) puede requerir mucho menos.
3. Transferir todo el material en la bandeja de pesaje en una combustión, vial previamente pesado y etiquetado. Tapa el frasco y luego tire de la bandeja de pesaje.
4. Realice los pasos 2.1-2.3 para cada muestra que se extrae.

3. extracción

1. Utilizando una pipeta de pre-combustión y bulbo, transferir 20 mL de la mezcla de DCM:MeOH (9:1) en cada frasco (vial debe ser aproximadamente medio lleno). Tapar los frascos antes de pasar a la siguiente muestra, para no evaporar los solventes volátiles.
   1. Las volatilidades de DCM y MeOH son diferentes. Evaporación del disolvente de extracción por cubetas destapado tiene la habilidad de cambiar su polaridad y así la extracción.
2. Coloque los frascos de muestra en un rack de frasco resistente al agua.
3. Compruebe que el nivel de agua en el baño de sonicación es sólo lo suficientemente profundo como para sumergir los frascos de muestra hasta la parte superior del solvente de extracción. Demasiada agua puede causar los frascos flotar; muy poca agua puede dejar las muestras de ser bien agitado.
4. Coloque la rejilla del frasco con las muestras en él directamente en el baño de sonicación.
5. Someter a ultrasonidos durante 30 min a temperatura ambiente.
6. Quitar el estante de la muestra del sonicador. Si la extracción de sedimentos, que establece por 30 min permitir colocar a ocurrir. Si otro grupo de muestras de extracción, poner en sonicador en este momento.
7. Retire la mezcla de DCM:MeOH del frasco de extracción, utilizando un pre combustión pipeta y bulbo, e inserto en otro previamente había pesado, pre-quemado y había etiquetado frasco 40 mL.
8. Repita 3 3.1-3.7 x para todas las muestras.
9. Permite muestras extraídas secar en sus frascos, tapas y en la capilla, cubierto ligeramente con un trozo de papel de aluminio. La etiqueta como 'residuo extraído' y almacenar.
10. Los extractos combinados para cada muestra de la etiqueta como 'TLE'.

El primer paso en paleoclimatología es recolectar o extraer los biomarcadores del sedimento en el que se encuentran. Las muestras ambientales están compuestas por componentes no orgánicos, como minerales, agua y metales, y componentes orgánicos creados por organismos vivos de la zona. Antes de que estos componentes orgánicos puedan ser utilizados por los científicos para dilucidar información sobre el pasado, deben ser eliminados de su entorno. La sonicación, que utiliza ondas ultrasónicas, es la más simple y menos costosa de estas técnicas.

Este video es parte de una serie sobre extracción, purificación y análisis de lípidos a partir de sedimentos. Se ilustrará la extracción de lípidos por ultrasonido y se presentarán algunas aplicaciones del método.

Debido a la amplia gama de biomarcadores, no existe un único disolvente optimizado para extraerlos todos. Esto se resume en la llamada regla de "lo similar se disuelve lo similar", según la cual las moléculas relativamente apolares se disuelven en disolventes apolares como el diclorometano, y las moléculas más polares se disuelven en disolventes más polares como el metanol. Las mezclas de disolventes para la extracción de lípidos específicos o grupos de lípidos generalmente se optimizan empíricamente.

Para acelerar la extracción y aumentar el rendimiento, se utiliza un sistema de sonicación para aplicar ultrasonidos, es decir, ondas con frecuencias superiores a 20 kHz, junto con la mezcla de disolventes. Cuando estas ondas entran en contacto con la fase orgánica líquida, provocan la formación de microburbujas de vapores de disolvente de corta duración que crecen y colapsan rápidamente. Al colapsar, estas burbujas liberan una enorme cantidad de energía en forma de cizallamiento mecánico, lo que facilita la solubilización de lípidos y aumenta drásticamente la eficiencia de la extracción.

Después del proceso de extracción con solvente asistido por ultrasonidos, el resultado es una preparación de extracto crudo, llamado extracto lipídico total, que se somete a una purificación adicional para permitir el examen cualitativo y cuantitativo de las firmas lipídicas. Ahora que ya conoces algunos de los principios fundamentales de la extracción de lípidos por sonicación, vamos a echar un vistazo a un protocolo sobre cómo se realiza el procedimiento.

Recoja los materiales de muestra necesarios en un lugar elegido. Algunos ejemplos son los sedimentos lacustres y marinos, los suelos terrestres, los cultivos microbianos o las hojas de las plantas. El material recolectado se congela durante la noche. Después de esto, se liofiliza en un secador durante 2 a 3 días. Triturar y homogeneizar las muestras liofilizadas antes de la extracción con un mortero enjuagado con disolvente. Para eliminar los contaminantes orgánicos, queme las pipetas, los viales y las latas de pesaje de vidrio de borosilicato necesarios en un horno. Después de dejar que la cristalería se enfríe en el horno, enjuague las herramientas de metal con una mezcla de diclorometano y metanol. Una vez que la muestra y la cristalería están preparadas, puede comenzar el procedimiento de sonicación.

A partir de este paso, todos los recipientes y cristalería deben quemarse antes de su uso. Coloque la lata de pesaje en una balanza y tara. Enjuague la espátula de laboratorio con la mezcla de solvente y, a continuación, utilícela para transferir una masa adecuada de muestra liofilizada y homogeneizada a la bandeja de pesaje y registre la masa. Transfiera con cuidado la muestra pesada a un vial etiquetado. Con el frasco rociador de DCM:MeOH, agregue lo suficiente como para que la muestra quede cubierta por 1 a 2 cm de solvente y tape el vial. Coloque el vial en una rejilla impermeable, ahora listo para la sonicación. Coloque la rejilla directamente en el baño de sonicación. Compruebe que el nivel del agua en el baño de sonicación es lo suficientemente profundo como para sumergir los viales de muestra hasta la parte superior del disolvente de extracción. Sonicar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la sonicación, retire el bastidor del sonicador. Deje reposar los viales para permitir que se asienten los sedimentos.

Retire la fase superior de diclorometano-metanol del vial de extracción con una pipeta y una perilla, y transfiérala a otro vial previamente pesado y etiquetado. Repita el proceso de sonicación un total de tres veces para cada muestra. Recoja los extractos en un vial. Deje que las muestras extraídas se sequen en sus viales, sin tapas, y en la capucha, cubiertas sin apretar con un trozo de papel de aluminio. Etiquételo como "residuo extraído" y guárdelo en el disolvente de extracción. Ahora que se han extraído los biomarcadores, deben purificarse antes de que se pueda realizar el análisis.

La sonicación acelera varios procesos de extracción con solventes y es ampliamente utilizada en estudios geoquímicos. Muchos arqueólogos trabajan con geoquímicos para reconstruir las circunstancias ambientales y culturales en las que vivieron las primeras civilizaciones humanas. La cerámica, uno de los inventos humanos más antiguos, cuando se desentierra, se puede encontrar que contiene fósiles moleculares residuales de vino, arroz u otros contenidos que alguna vez se almacenaron en su interior.

Para desenterrar pruebas químicas de las sustancias absorbidas en las superficies, se sonican pequeñas muestras de cerámica en presencia de disolventes orgánicos y los compuestos extraídos pueden identificarse posteriormente aguas abajo mediante métodos espectroscópicos. Este tipo de análisis ayuda a los arqueólogos a detectar los tipos de recursos que estaban disponibles para las poblaciones antiguas y reconstruir las condiciones de su hábitat.

Las microalgas fotosintéticas se encuentran en ecosistemas marinos y de agua dulce. Debido a que crecen en medios a base de agua de mar y su cultivo ocupa áreas significativamente más pequeñas, ahora están siendo ampliamente estudiados como una alternativa prometedora a las plantas terrestres para la producción de biocombustibles.

Para extraer lípidos de una biomasa de microalgas, estos investigadores describen una extracción con disolventes asistida por sonicación. La cavitación acústica durante la sonicación altera eficazmente las paredes celulares rígidas de las microalgas para liberar lípidos. Dichas técnicas ayudan a la caracterización de nuevas microalgas del medio ambiente para la producción de fuentes de energía no petroleras.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la extracción asistida por sonicación de biomarcadores de sedimentos. Los siguientes videos explicarán cómo se purifica aún más el extracto para su análisis.

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