Extracción de biomarcadores de sedimentos - acelerado de extracción por solvente
Fuente: Laboratorio de Jeff Salacup - Universidad de Massachusetts Amherst
La distribución de un grupo de biomarcadores orgánicos llamado thioureas gl…
1. recolección de los materiales necesarios
- Extraer muestras. Muestras (en este caso, sedimento) son congeladas, liofilizadas, trituradas, homogeneizadas antes de la extracción y extraídas en grupos para maximizar la eficiencia.
- Dependiendo del tamaño de la muestra, utilizar los frascos de colección volúmenes de 40 o 60 mL. Para este experimento, se utilizan frascos de vidrio de borosilicato (40 mL) y casquillos seguros solvente. Quema los frascos, pipetas de vidrio de borosilicato y pesaje latas a 550 ° C por 6 h antes de eliminar los posibles contaminantes orgánicos.
- Metanol y diclorometano (DCM) son comunes en los laboratorios de geoquímica orgánicos más. Utilizarlos individualmente, (metanol en primer lugar, seguida de DCM) para enjuagar los instrumentos de laboratorio y cristalería antes de su uso. Una mezcla de diclorometano metanol (MeOH; 9:1) se utiliza en muchos laboratorios para extraer eficientemente biomarcadores con un amplio rango de polaridades. Disolventes deben estar libres de contaminantes orgánicos.
- Obtener un Extractor solvente acelerado para este experimento.
2. preparación de muestra de las células
- Montar una célula de muestra para cada muestra que se extrae, además de un espacio en blanco.
- Para cada celda, atornille un tapón en un extremo del cuerpo celular.
- Coloque un filtro de fibra de vidrio quemado encima de cada celda usando pinzas solvente-aclaró. Luego, lentamente y suavemente presione el filtro en la célula utilizando el émbolo del filtro.
- Los cuerpos celulares por número (por ejemplo, 1-22) para cada muestra de la etiqueta, escriba "en blanco" en la celda en blanco.
- Llene el espacio en blanco con tierra de diatomeas (o arena) y la tapa con un segundo tapón. Apriete a mano.
3. preparación de muestras
- Coloque una combustión peso de lata en la escala de laboratorio y Tara.
- Enjuague el espátula de laboratorio con solvente, luego utilizar para transferir una masa adecuada de muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa.
- La masa de la muestra varía en función de su contenido de materia orgánica. Materia orgánica relativamente magro material (barro marino) puede requerir varios gramos, mientras que el material rico de materia orgánica (tejido foliar) puede requerir mucho menos.
- Transferir todo el material en la bandeja de pesaje en una celda preparada de ASE.
- Coloque otro filtro de fibra de vidrio en la parte superior de la celda, luego lentamente y suavemente presione hacia abajo hasta llegar a la parte superior de la muestra utilizando el émbolo del filtro.
- Añadir tierra de diatomeas (o arena) a la celda hasta que esté casi lleno. Tenga cuidado quitar cualquier residuo de la rosca del cuerpo de la célula.
- Tapa la parte superior de la celda con otra tapa.
- Repita los pasos 3.1-3.6 para cada muestra.
4. preparación de los frascos de colección de
- Etiqueta de cada frasco con el número de un celular correspondiente (por ejemplo, 1-22 o en blanco) y la tapa con tapa de frasco de colección de ASE.
5. extracción
- Coloque cada celda muestra una ranura numerada en la bandeja superior de la ASE.
- Coloque el frasco correspondiente en la misma ranura número de la bandeja inferior de ASE.
- Crear el método de extracción con el teclado en la ASE. Extracto a 100 ° C y 1.200 psi. Extracto de cada muestra x 3 con un control estático de 10 min y lave el cuerpo de la célula con el 50% de su volumen total entre sostiene estática.
- Asegúrese de que la botella de disolvente contiene suficiente solvente para extraer todas las muestras.
- Enjuague la ASE 3 x antes de iniciar la ejecución pulsando el botón "aclarar" en el cojín del control de ASE.
- Presione start.
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La extracción acelerada con disolventes es una técnica rápida, eficiente y de alto rendimiento que se utiliza para separar biomarcadores orgánicos de un gran número de muestras de sedimentos geológicos.
Tradicionalmente, se utilizan métodos de extracción como la sonicación o el Soxhlet, sin embargo, el inconveniente de estos protocolos es que son demasiado lentos para procesar suficiente material para una reconstrucción paleoclimática detallada. Una técnica más nueva, la extracción acelerada con solventes, o método ASE, se desarrolló teniendo en cuenta la eficiencia y el alto rendimiento.
El método ASE utiliza una combinación de altas temperaturas y alta presión para extraer muestras y puede llevar a cabo múltiples muestras en una sola ejecución de preparación relativamente rápida.
Este video es el tercero de una serie que detalla cómo extraer biomarcadores de los sedimentos. Cubrirá el procedimiento y proporcionará información sobre los méritos de ASE sobre la sonicación o la extracción Soxhlet.
En la extracción acelerada con disolventes, las muestras se cargan en celdas de acero que luego se cargan en un carrusel. Los viales de recolección para cada celda de muestra también se cargan en un carrusel separado. El instrumento carga una celda de muestra en un horno interno. El disolvente se bombea desde una botella de disolvente a través de una serie de válvulas hasta que se alcanza una presión suficiente.
Esta presión se mantiene durante un período de tiempo dictado por la muestra y el analito. A continuación, el disolvente se lava de la celda de muestra a través de una línea de acero hasta el vial de recogida correspondiente. El proceso se puede repetir varias veces. La temperatura, la presión y la duración se pueden personalizar para la muestra.
La alta temperatura utilizada aumenta la cinética de la extracción, mientras que la alta presión evita que el solvente se volatilice. El frasco de recolección ahora contiene un extracto lipídico total, y lo que queda en la celda de muestra se llama residuo. Comprende material no orgánico, así como material orgánico que no es extraíble con solventes, llamado kerógeno.
Ahora que estamos familiarizados con los principios detrás de la extracción acelerada con solventes, echemos un vistazo a cómo se lleva a cabo esto en el laboratorio.
Después de recolectar muestras de interés; Liofilizar, homogeneizar y descontaminar como se demuestra en otro video de esta serie.
Una vez que se hayan preparado todas las muestras, ensamble una celda para cada una de las que se van a extraer, y una extra para una en blanco. Para hacer esto, atornille una tapa de extremo en el cuerpo de la celda. Con pinzas enjuagadas con solvente, coloque un filtro de fibra de vidrio quemado encima de cada uno. Presione lenta y suavemente el filtro hacia abajo con el émbolo.
Etiquete los cuerpos celulares por número para cada muestra y etiquete el blanco por separado. Coloque una lata de pesaje quemada en una báscula de laboratorio y tara. Enjuague una espátula con solvente, luego utilícela para transferir de 5 a 10 g de muestra a la lata de pesaje y registre la masa.
Transfiera todo el material de la bandeja de pesaje a su celda correspondiente. Coloque otro filtro de fibra de vidrio encima y apisone suavemente hasta que llegue a la parte superior de la muestra.
Agregue un dispersante, como tierra de diatomeas o arena, hasta que esté casi lleno, teniendo cuidado de evitar que entren residuos en las roscas del cuerpo celular. Cubra la parte superior de la celda con otra tapa de extremo. Repita estos pasos para cada muestra y para la pieza en bruto.
Etiquete cada vial de recolección con el número de una celda de muestra o en blanco correspondiente, y tape con una tapa de vial. Coloque cada celda en una ranura numerada en la bandeja ASE superior. Establezca los parámetros para el método de extracción mediante el teclado del ASE para extraer a 100 ? C?y 1.200 psi. Extraiga cada muestra 3 veces con una retención estática de 10 minutos y enjuague el cuerpo celular con el 50% de su volumen total entre retenciones estáticas.
A continuación, asegúrese de que el frasco de disolvente contenga suficiente para extraer todas las muestras. Enjuague las líneas de instrumentos 3 veces antes de comenzar la carrera. Finalmente, presione inicio.
Retire el vial del ASE. Ahora que se han extraído los biomarcadores, deben purificarse antes del análisis.
La extracción acelerada con solventes es una técnica versátil, que se puede utilizar para una variedad de aplicaciones, algunas de las cuales se exploran aquí.
La extracción acelerada con disolventes también se puede utilizar en otros tipos de muestras, incluidos los alimentos. El análisis de residuos para detectar la contaminación por plaguicidas se lleva a cabo con frecuencia en instalaciones reguladoras e industriales para determinar la seguridad y la calidad de los productos alimenticios como frutas o verduras. El ASE se puede utilizar para extraer plaguicidas organoclorados de muestras de alimentos y determinar los tipos o niveles de residuos presentes en el producto. Esta información se puede utilizar para determinar si los productos son aptos para el consumo humano o animal. Por ejemplo, el dieldrín debe encontrarse entre 0 y 0,1 partes por millón en los alimentos, dependiendo del producto.
Los componentes nutricionales de los alimentos también se pueden extraer mediante ASE. Por ejemplo, se pueden extraer productos como el chocolate, que puede tener un alto contenido gravimétrico de grasa. Utilizando ASE con éter de petróleo como disolvente, la grasa puede separarse de las muestras de chocolate y someterse a un análisis cuantitativo para determinar un porcentaje preciso de contenido de grasa por cantidad conocida de chocolate. Con esta información, los organismos reguladores pueden verificar las afirmaciones hechas por los fabricantes de chocolate, o los fabricantes pueden obtener información para crear etiquetas de alimentos precisas.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la extracción de biomarcadores lipídicos mediante la extracción acelerada con disolventes, o ASE. Los métodos para el procesamiento y análisis posteriores se pueden encontrar en los videos siguientes.
¡Gracias por mirar!
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Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.