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La espectroscopia ultravioleta-visible, o UV-Vis, es una de las técnicas analíticas más populares en el laboratorio.
En la espectroscopia UV-Vis, la luz pasa a través de una muestra a una longitud de onda específica en el espectro UV o visible. Si la muestra absorbe parte de la luz, no toda la luz pasará a través de ella ni se transmitirá. La transmisión es la relación entre la intensidad de la luz transmitida y la luz incidente y está correlacionada con la absorbancia. La absorbancia se puede utilizar de manera cuantitativa, para obtener la concentración de una muestra. También se puede utilizar de manera cualitativa, para identificar un compuesto haciendo coincidir la absorbancia medida en un rango de longitudes de onda, llamado espectro de absorbancia, con los datos publicados. Este video presentará la espectroscopia UV-Vis y demostrará su uso en el laboratorio para determinar la concentración de muestras y la cinética de reacción.
Cuando un fotón golpea una molécula y es absorbido, la molécula es promovida de su estado fundamental a un estado de energía más alto. La diferencia de energía entre los dos es la banda prohibida. La energía del fotón debe coincidir exactamente con la banda prohibida para que el fotón sea absorbido. La estructura química determina la banda prohibida; Por lo tanto, cada molécula tiene espectros de absorbancia únicos.
La absorbancia sigue la Ley de Beer, que establece que la absorbancia es igual al coeficiente de atenuación molar multiplicado por la longitud del camino y la concentración. El coeficiente de atenuación molar está relacionado con la capacidad del compuesto individual para absorber luz de una longitud de onda específica. La longitud del camino se refiere a la distancia recorrida por la luz a través de la muestra, que suele ser de 1 cm para las cubetas estándar. La ley de Beer se puede utilizar para calcular la concentración de la muestra, si se conoce la absorción, o se puede utilizar una curva de calibración.
La UV-Vis a menudo se denomina una técnica general, ya que la mayoría de las moléculas absorben luz en el rango de longitud de onda UV-visible. El rango UV se extiende de 100 a 400 nm y el espectro visible varía de 400 a 700 nm. Sin embargo, la mayoría de los espectrofotómetros no funcionan en el rango de UV profundo de 100 a 200 nm, ya que las fuentes de luz en este rango son caras. La mayoría de los espectrofotómetros UV-Vis utilizan una lámpara de deuterio para el rango UV, que produce luz de 170 a 375 nm, y una lámpara de filamento de tungsteno para el rango visible, que produce luz de 350 a 2.500 nm.
Dado que la fuente de luz suele ser una lámpara con amplios rangos de longitud de onda, la longitud de onda de absorbancia específica se selecciona mediante filtros o un monocromador. Un monocromador es un dispositivo que separa espacialmente las longitudes de onda de la luz y luego coloca una rendija de salida donde está la longitud de onda de luz deseada. El monocromador se puede escanear en un rango de longitud de onda para proporcionar un espectro de absorbancia completo. Esto hace que la técnica sea útil para cuantificar e identificar una amplia gama de moléculas.
Ahora que se han esbozado los conceptos básicos de la espectroscopia UV-Vis, echemos un vistazo a un simple experimento UV-Vis en el laboratorio.
Antes de comenzar la medición, encienda el espectrofotómetro y deje que las lámparas se calienten durante un período de tiempo adecuado para estabilizarlas.
Prepare un espacio en blanco llenando una cubeta limpia con el solvente de muestra y luego limpie el exterior con papel sin pelusa para eliminar las huellas dactilares.
Asegúrese de que la cubeta esté alineada correctamente con los lados ranurados fuera de la trayectoria del haz e insértela en el espectrofotómetro. Asegure la tapa para evitar que la luz ambiental entre en el sistema.
Mida la absorbancia del blanco en una longitud de onda o en un rango de longitud de onda. Registre o guarde la absorbancia, ya que debe restarse de la absorbancia de la muestra.
A continuación, deseche la pieza en bruto y enjuague la cubeta dos veces con la muestra. Luego, llene la cubeta alrededor de ? Completo con muestra. Vuelva a limpiar el exterior de la cubeta para asegurarse de que esté limpia y libre de huellas dactilares.
Coloque la cubeta en el espectrofotómetro en la orientación correcta y asegure la tapa.
Recopile una medida de absorbancia o un espectro en la misma longitud de onda o rango de longitud de onda que el blanco. Reste el espectro en blanco o la medición, si el instrumento no lo hace automáticamente.
A partir del espectro de absorbancia recogido, determine la absorbancia máxima o ?max.
Para cuantificar la cantidad de analito en la muestra, cree una curva de calibración utilizando un rango de concentraciones de analito conocidas. Para obtener más información sobre cómo construir y utilizar una curva de calibración, vea el vídeo de esta colección "Curvas de calibración".
La medición de la absorbancia también se puede utilizar para calcular la cinética de la reacción midiendo el aumento o la disminución de la concentración de un compuesto a lo largo de la reacción. Comience tomando una lectura inicial de la muestra, colorante azul en este caso, al máximo de absorbancia antes de la reacción.
A continuación, agregue rápidamente el reactivo, lejía en este caso, para iniciar la reacción química. Remueve bien, para que se mezcle con la muestra.
Mida la absorbancia en el máximo de absorbancia a lo largo del tiempo.
Se muestra el espectro de absorbancia inicial de la muestra de colorante azul. Los colores de fondo muestran los colores de la luz en el espectro visible. El tinte azul tiene una absorbancia máxima de unos 630 nm.
La cinética de la reacción entre el tinte azul y la lejía se midió a lo largo del tiempo. La absorbancia del tinte azul disminuye con el tiempo, ya que reacciona con el blanqueador. La absorbancia alcanza casi cero después de 300 s, lo que indica que la reacción está a punto de completarse. Para obtener más información sobre la cinética y las reacciones, vea el video de JoVE Science Education "Leyes de velocidad de reacción".
La espectroscopia UV-Vis se utiliza mucho en muchas áreas de investigación diferentes para identificar o cuantificar una muestra.
Por ejemplo, la espectroscopia UV-Vis se utiliza mucho en los campos biológicos para cuantificar la cantidad de proteína en una muestra. Un ensayo de Bradford se utiliza a menudo para cuantificar proteínas, con la ayuda de un colorante. En primer lugar, se prepara una curva de calibración de las concentraciones de proteínas conocidas, normalmente utilizando albúmina sérica bovina, o BSA. A continuación, se añade la tinción azul de Coomassie a cada uno de los patrones y a la muestra. A continuación, se mide la absorbancia del complejo proteína-colorante a 595 nm.
Alternativamente, las proteínas se pueden medir directamente por su absorbancia a 280 nm. En este ejemplo, la concentración de proteínas se cuantifica utilizando un espectrofotómetro de volumen ultra bajo. Para muchas proteínas, una absorbancia de 1 se correlaciona con una concentración de 1 mg/mL.
La espectroscopia UV-Vis también se utiliza para cuantificar la cantidad de células bacterianas en un cultivo celular. Para esta medición, la absorbancia, o densidad óptica, se mide a 600 nm. Normalmente, una medición de OD600 de 1 indica la presencia de 8 x 108 células bacterianas por ml. La medición de la densidad celular a lo largo del crecimiento del cultivo permite determinar la curva de crecimiento bacteriano y puede ayudar a identificar cuándo un cultivo se encuentra en su fase de crecimiento exponencial.
El óxido de nitrógeno y el dióxido de nitrógeno, o NOx, son un subproducto de los gases de escape de los automóviles y pueden ser perjudiciales para el medio ambiente porque forman ozono troposférico dañino. El NOx se puede medir haciéndolo reaccionar con una solución de ácido sulfanílico y natiletilendiamina. La solución resultante es una molécula de colorante azoico de color rosa, cuya intensidad se correlaciona directamente con la concentración de NOx. Esta concentración se puede determinar utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la espectroscopia UV-visible. Ahora debe comprender los conceptos básicos del funcionamiento de UV-Vis, cómo medir una muestra utilizando un UV-Vis y cómo correlacionar la absorbancia con la concentración de la muestra.
¡Gracias por mirar!
