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Organic Chemistry

Cromatografía en columna

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Column Chromatography

2.1: Introduction to Catalysis

2.15: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy

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09:23 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Laboratorio del Dr. Jimmy Franco – Merrimack College

Cromatografía en columna es una de las técnicas más útiles para purificar compuestos. Esta técnica utiliza una fase estacionaria, que se embala en una columna, y una fase móvil que pasa a través de la columna. Esta técnica aprovecha las diferencias de polaridad entre compuestos, permitiendo que las moléculas suelen estar separado. ¹ las dos fases estacionarias más comunes para cromatografía en columna son gel de sílice (SiO₂) y alúmina (Al₂O₃), con más común utiliza fases móviles siendo solventes orgánicos. ² el solvent(s) para la fase móvil dependen de la polaridad de las moléculas de ser purificada. Más compuestos polares requieren típicamente más disolventes polares con el fin de facilitar el paso de las moléculas a través de la fase estacionaria. Una vez finalizado el proceso de purificación del solvente puede eliminarse de las fracciones recogidas utilizando un evaporador rotatorio para producir el material aislado.

Principles

La mezcla de muestra se coloca en la parte superior de la columna y absorbida en la parte superior de la fase estacionaria. Posteriormente, la fase móvil se aplica a la columna y utilizada a fin de eluir la mezcla a través de la fase estacionaria. Cromatografía de columna explota la polaridad de la molécula para separar los compuestos. La diferencia de polaridad conduce a variaciones en la tasa en la cual las moléculas viajan a través de la columna, que separa eficazmente los compuestos entre sí. La fase móvil se recoge en pequeñas fracciones en tubos de ensayo como elutes de la columna, permitiendo el aislamiento y purificación de los compuestos. Por último, el disolvente se elimina utilizando un evaporador rotatorio a la aislada, establecidos.

Versatilidad y comodidad de la cromatografía de columna ha hecho una de las técnicas más ampliamente utilizadas para purificar compuestos. A diferencia de la recristalización (otro había utilizado técnica de purificación) compuestos purificados con cromatografía de columna no debe ser sólida. Cromatografía de columna también es capaz de aislar a un número de compuestos de una mezcla. Otra de las ventajas de la cromatografía de columna es que muy poco se conoce acerca de las propiedades físicas del compuesto para poder utilizar este método de purificación, que esta técnica hace muy valioso al sintetizar o aislar compuestos novedosos, en la que poco se sabe sobre los establecidos.

Solvente

La tasa a la cual un compuesto atraviesa a través de la columna depende de la fase móvil se utiliza. Por lo general, el más polar el solvente más rápido los compuestos pasará a través de la columna. Solventes polares tienen una mayor afinidad por la fase sólida, limitando las interacciones entre los establecidos y la fase sólida, permitiendo que los compuestos a fin de eluir más rápidamente. Debe tenerse cuidado para asegurar que el sistema solvente elegido para la cromatografía de columna tiene la polaridad adecuada para crear separación entre los compuestos en la mezcla. La elección del disolvente es crucial para la exitosa separación mediante cromatografía en columna. Para identificar un óptimo sistema de solvente, se debe realizar una serie de experimentos de capa delgada cromatografía (TLC) antes de realizar el experimento de la cromatografía de columna. En algunos casos puede ser necesario utilizar un sistema binario de solvente.

Selección de un sistema de solventes

Identificar un sistema de solventes que produce un factor de retardo (R_f ) entre 0,2 – 0,3 para el compuesto deseado en una placa de TLC.
Empezar con acetato de etilo o diclorometano como fase móvil para el experimento de TLC.
1. Si la R_f es mayor que 0.3, probar con menos disolvente polar, como hexano. Si la R_f es menor que 0.2, intenta añadir una pequeña cantidad de un disolvente polar como el metanol.
2. El sistema solvente óptimo puede requerir una mezcla de dos solventes.
3. Ser cuidado de no usar más del 10% metanol como fase móvil para una columna de sílice.

Procedure

1. mezcla de Gel de silicona de

Verter el gel de sílice en un matraz Erlenmeyer. El peso del material de embalaje debe ser de aproximadamente 50 x de la muestra están separada. Si los compuestos se separaron tienen valores muy similares de R_f , puede requerir usar una mayor cantidad de sílice por muestra, que es el caso de este ejemplo.
1. Lugar 10 g de sílice en el matraz de Erlenmeyer, ya que 50 mg de la muestra (45 mg de Fluorenona y 5 mg de tetraphenylporphyrin) están siendo aislados.
Añadir el sistema de solventes (hexano/diclorometano, 70%: 30%) en el erlenmeyer que contiene el gel de sílice. Agregue suficiente solvente para asegurarse de que todo el gel de sílice es bien solvatados. La silicona no se disolverá, pero la mezcla será visualmente perceptible cuando solvatados. Una vez que se ha añadido el disolvente agitar el matraz Erlenmeyer para asegurarse de que la sílice es bien solvatados.

2. preparación de la columna

Seleccione la columna de tamaño adecuado. Por lo general la columna se debe llenar a medio camino con mezcla de gel de silicona. Cuanto mayor sea la muestra ser purificado, el más grande la columna necesaria.
Conecte la parte inferior de la columna con un trozo de lana de vidrio. Con una varilla larga, asegúrese de que la lana se encuentra firmemente en la parte inferior de la columna justo por encima de la llave de paso.
Una vez que la lana esté firmemente en su lugar, aplicar una fina capa de arena sobre la lana de vidrio.
Nota: Si la columna está equipada con una frita de vidrio encima de la llave de paso, debe omitirse este paso.
Abrazadera de la columna en posición vertical en un soporte de anillo.
Suavemente utilizando un embudo, vierta la mezcla preparada de gel de sílice en la columna. Puede que necesite añadir más disolvente para transferir la mezcla del matraz Erlenmeyer a la columna. Usando una pipeta, lave cualquier gel de silicona que se adhiere a los lados de la columna.
1. Como el gel de sílice es colocar en la columna, golpee suavemente los lados de la columna para que el gel de sílice firmemente los paquetes y excluye cualquier burbuja de aire.
Abrir la llave de paso y deje que solvente drene en un erlenmeyer limpio hasta justo antes del gel de sílice y el solvente se reúnen frente. El gel de silicona nunca debe ir seco hasta que se complete el procedimiento.
Coloque una capa delgada de arena en la parte superior del gel de sílice (figura 1). Usando una pipeta, lave cualquier arena que puede haber pegado a los lados de la columna.
Drenar cualquier solvente adicional hasta que la arena está seca, pero no hasta la capa de gel de silicona.

Figura 1. La configuración adecuada para una cromatografía en columna el experimento antes de la adición de la muestra.

3. Añadir la muestra a la columna

Disolver la muestra en la menor cantidad de solvente (con el mismo disolvente que se utilizó para hacer la mezcla de gel de sílice).
Suavemente con una pipeta, añadir la muestra a la parte superior de la columna.
Una vez que la muestra se ha aplicado a la parte superior de la columna, abra la llave de paso y deje que el solvente drene a través de la capa de arena, pero no la capa de gel de silicona. Use una pequeña cantidad de solvente para lavar abajo cualquier muestra que puede haber se aferró a los lados de la columna. Este solvente adicional a través de la capa de la arena así como de drenaje.

4. liberador de la muestra a través de la columna

Muy suavemente con una pipeta, añadir 4 – 5 mL de disolvente de tal manera que no moleste a la capa de arena.
Colocar un embudo en la parte superior de la columna y muy despacio y suavemente llene el resto de la columna con el disolvente.
Abrir la llave de paso y deje que el solvente drene a través de la columna.
Comenzar a colectar la fase móvil como drena de la columna de tubos de ensayo.
1. Tubos de ensayo deben colocarse en un bastidor de tubo de ensayo en una manera secuencial.
Agregar más solvente a la parte superior de la columna como sea necesario hasta que todos los compuestos deseados han eluida de la columna.

5. recuperación de los componentes

Si los compuestos son coloreados, entonces pueden ser visualmente identificados. Sin embargo, si los compuestos son incoloros, tendrán que identificarse mediante luz ulta-visible (UV) (si los compuestos contienen verbal) o con la tinción apropiada. La pureza de los compuestos puede ser verificada mediante cromatografía en capa fina.
Identificar los tubos de ensayo que contienen, establecidos de la deseada.
Combinar todas las fracciones que contienen el deseado aislado, establecidos en un matraz previamente tarado de (RB) de fondo redondo. Hacer esto para cada compuesto se aisló.
Evaporar el solvente colocando el frasco de RB en el rotavapor.
Una vez que se ha eliminado todo el disolvente, pesan el RB con el producto seco y restar el peso inicial del RB para obtener un rendimiento.

Cromatografía en columna es un método de purificación versátil que se utiliza para separar los compuestos en una solución. Una mezcla de solución es llevada por un disolvente a través de una columna que contiene un adsorbente sólido, llamado la fase estacionaria. La mezcla de solvente y la muestra se llama la fase móvil.

Moléculas en la fase móvil viajan a través de la columna a diferentes ritmos, basado en sus propiedades químicas y su afinidad por la fase estacionaria. Así, cada uno de ellos sale la columna a la vez diferentes. Una vez que los compuestos han sido separados y purificados pueden ser procesados o están listos para su distribución. Este video será introducir los fundamentos de la cromatografía de columna, luego Mostrar la técnica con la purificación de compuestos orgánicos.

En cromatografía en columna, las moléculas de absorber reversible a la fase estacionaria como fluyen a través de la columna, de tal modo retardando su progreso. Compuestos que interaccionan débilmente con la fase estacionaria son más rápidos salir de la columna, o eluir. Compuestos que interactúan fuertemente con la fase estacionaria son más lentos a fin de eluir. La fase estacionaria es un adsorbente en polvo o gel como gel de sílice o alúmina. Gel de sílice y alúmina son altamente polares por lo que interactúan fuertemente con disolventes y compuestos polares y débilmente con las moléculas no polares. La fase estacionaria es cargada a la columna como una mezcla con el solvente y luego es embalada por el flujo solvente a través de la fase estacionaria. Cuando está correctamente embalado, la fase estacionaria es homogénea de arriba a abajo y sin burbujas de aire o parches secos, como flujo irregular causado por estas irregularidades interfiere con la separación de compuestos. El disolvente o eluyente, es normalmente un disolvente orgánico de un embalse. En general, solventes no polares sólo elución los compuestos no polares, mientras que los solventes polares elución compuestos polares y no polares. Si una mezcla contiene compuestos de polaridad significativamente diferentes, puede utilizarse una serie de solventes polares cada vez más a fin de eluir todos los compuestos de interés. La tasa de flujo de fase móvil es generalmente controlada por una válvula de cierre en la parte inferior de la columna. Pausas en el flujo se mantienen al mínimo para evitar la difusión de los compuestos. La fase móvil, dejando la columna, el efluente se recoge en fracciones para preservar la separación de compuestos. Ahora que usted entiende los principios de la cromatografía en columna, vamos a ir a través de un procedimiento para la purificación de una mezcla de compuestos orgánicos.

Para comenzar el procedimiento, obtener el equipo como se indica en el texto. Pesar un matraz de fondo redondo para cada compuesto para aislarse y registrar la masa. A continuación, pesar la muestra y disolver en el mínimo volumen de disolvente necesitada. El disolvente apropiado debe predeterminado utilizando cromatografía en capa fina. El valor de R_f debe estar entre 0.2-0.3. Luego, determinar la cantidad de gel de sílice necesaria para la fase estacionaria, basada en el peso seco de la muestra y la diferencia en la distancia de migración de los compuestos de interés basándose en la proyección previa del TLC. Vierta la cantidad adecuada de gel de sílice en un matraz Erlenmeyer. Agregar el solvente al gel de silicona hasta que la mezcla es translúcida y se mueve libremente cuando se remolina el frasco. A continuación, seleccione una columna lo suficientemente grande como para que el gel de sílice se llenará hasta la mitad. Si la columna no tiene una frita de vidrio, colocar lana de vidrio en la columna y presione firmemente hacia abajo con una varilla larga. Cubrir la lana de vidrio con unos 2 cm de arena para impedir la pasando por la lana de vidrio de sílice. En una campana extractora abrazadera de la columna a un soporte de anillo, dejando espacio suficiente para alojar los tubos de ensayo.

Colocar un embudo en la columna y asegurar que la llave de paso esté cerrada. Vierta la mezcla en la columna, golpeando suavemente los lados como la mezcla se instala para excluir las burbujas de aire. Enjuagar el embudo, matraz y las paredes de la columna con el disolvente para transferir todo el gel en la columna.

Coloque un matraz Erlenmeyer debajo de la columna. Abrir la llave de paso permite el solvente drenar en el matraz hasta que el nivel de disolvente es justo sobre el gel de sílice y luego cierre la llave de paso. Verter unos 2 cm de arena sobre el gel. Enjuagar suavemente cualquier arena pegada a los lados de la columna con el disolvente. Drene el disolvente según sea necesario para que la arena es sobre todo seco, pero sigue siendo la silicona completamente cubierto.

Para iniciar la separación, añada la muestra a la columna sin molestar a la arena. Utilizar pequeñas porciones de disolvente para enjuagar cualquier muestra adhiriéndose a las paredes de la columna y enjuagar el recipiente de la muestra. Con cuidado drene el disolvente hasta que el nivel justo encima de la silicona. Luego, con una pipeta, añadir suavemente 4 – 5 mL de disolvente sin alterar la capa de arena. Colocar un embudo en la columna y llene lentamente con el solvente. Retirar el matraz y reemplácelo con un tubo de ensayo rotulado. Con el primer tubo en su lugar, abra la llave de paso y recoger el eluído hasta que el tubo está casi lleno.

Continuar recogiendo fracciones hasta que se eluyen todos los compuestos deseados, proceder secuencialmente a través de los tubos de ensayo etiquetados. Cuando haya terminado, cierre la llave de paso.

Para cada compuesto aislado, combinar las fracciones puras en un matraz de fondo redondo previamente pesado. Eliminar el solvente del frasco en un evaporador rotatorio y luego pesar el matraz de fondo redondo que contiene el compuesto seco. Para obtener más información, vea el vídeo de la colección en evaporación rotatoria.

Esta muestra contiene una mezcla de tetraphenylporphyrin, o TPP y Fluorenona. El TPP rojo púrpura oscuro eluyó en primer lugar, seguido por el amarillo Fluorenona. La pureza de cada compuesto aislado fue confirmada por espectroscopia de RMN.

Cromatografía en columna se utiliza en la purificación y análisis en una variedad de campos científicos.

Cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC, es una forma de cromatografía en columna que proporciona excelente separación entre compuestos y puede incorporar detectores especializados como un detector de radiación radiactiva moléculas. Utilizando HPLC, un fosfolípido radiactivo puede fácilmente aislado de una mezcla de muchos otros aunque lo constituye un pequeño porcentaje de la mezcla. Esta información puede ayudar a aclarar la producción, regulación y funciones de muchas biomoléculas importantes.

La cromatografía flash es una variante de la cromatografía en columna en la que la fase móvil se mueve a través de la columna bajo la presión de aire o gas en lugar de flujo por gravedad solamente.

Esto crea un flujo más rápido, minimiza la difusión para una mejor separación. El compuesto deseado se recoge en unas fracciones puros, concentrados, como se muestra con cromatografía en capa fina, resultando en pureza y excelente rendimiento de la purificación.

El aparato de columna generalmente no es apropiado para la separación de pequeños volúmenes, pero algunas mezclas no son compatibles con técnicas especializadas como la HPLC. Purificación en pequeña escala se realiza con columnas de pipeta de vidrio, con un bulbo de pipeta usado para cromatografía flash en pequeña escala. Esto es particularmente útil al preparar una muestra para las técnicas de purificación especializada o como paso final después de la purificación a gran escala.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para cromatografía en columna. Ahora debe estar familiarizado con los principios de la cromatografía de columna, un procedimiento para la cromatografía de columna de gel de silicona y algunas aplicaciones de la técnica.

¡Gracias por ver!

Results

La muestra que contiene una mezcla de tetraphenylporphyrin (ATP, 5 mg) y Fluorenona (45 mg) se ha separado con éxito y cada compuesto ha sido aislado. El TPP primero eluida de la columna como una banda de púrpura-rojizo oscurezca y la Fluorenona posteriormente eluida de la columna como una banda amarillo ()figura 2). Las fracciones eluídas se recolectaron en tubos de ensayo e identificaron por sus colores característicos (figura 3). Las fracciones que contienen los compuestos aislados se fusionaron en RBs separados y el disolvente se eliminó usando un evaporador rotatorio para producir ATP altamente puro y Fluorenona. La pureza de los compuestos chromatographed se validó por la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Compuestos se pueden además verificar punto de fusión, pero solamente si el punto de fusión para el deseado, establecidos se ha determinado previamente.

Figura 2. Como los compuestos de recorrer a través de la fase estacionaria empiezan a separar. En este experimento el TPP (banda de púrpura-rojizo oscuro) viaja a través de la columna un poco más rápido que la Fluorenona (banda amarilla).

Figura 3. Los compuestos responsables de la columna se recogen en tubos de ensayo. Los compuestos se separan en este experimento son coloreados, por lo que pueden ser identificados visualmente.

Applications and Summary

Resumen

Cromatografía en columna es un método conveniente y versátil para purificar compuestos. Este método separa compuestos basados en polaridad. Explotando las diferencias en la polaridad de las moléculas, cromatografía de columna suelen puede separar compuestos por la tasa a la cual los compuestos recorrer a través de la fase estacionaria de la columna. Una de las ventajas de la cromatografía en columna (especialmente en comparación con recristalización) es decir muy poco acerca de los compuestos deben ser conocidos antes del proceso de purificación. La otra ventaja al uso de cromatografía en columna es que puede utilizarse para purificar sólidos y aceites, mientras que la recristalización puede utilizarse para purificar sólidos. Esta técnica puede utilizarse también para aislar a varios compuestos de una mezcla.

Aplicaciones

Cromatografía en columna es uno de los métodos más convenientes y utilizados para purificar compuestos. Con frecuencia, reacciones sintéticas producen varios productos y cromatografía de columna puede utilizarse para aislar cada uno de los compuestos para la examinación adicional. Cromatografía de columna es sumamente valioso cuando sintetizando o aislar compuestos novedosos, ya que muy poco debe conocerse acerca de un compuesto y sus ‘ propiedades físicas antes del proceso de purificación.

La industria farmacéutica utiliza rutinariamente cromatografía en columna para purificar compuestos como parte de su proceso de desarrollo de drogas de etapa temprana. ³ a menudo en los investigadores de estas etapas preliminares se construir bibliotecas de compuestos alrededor de un compuesto de plomo y posteriormente utilizar la cromatografía en columna para purificar los compuestos recientemente sintetizados. ⁴ el uso y la versatilidad de esta técnica de purificación ha llevado a educadores a incorporar la técnica en el plan de estudios de pregrado. ^5,6

References

Mayo, D. W.; Pike, R. M.; Forbes, D. C., Microscale organic laboratory : with multistep and multiscale syntheses. 5th ed.; J. Wiley & Sons: Hoboken, NJ; p xxi, 681 p (2011).
Armarego, W. L. F.; Chai, C. L. L., Purification of laboratory chemicals. 5th ed.; Butterworth-Heinemann: Amsterdam; Boston; p xv, 609 p (2003).
Silverman, R. B.; Holladay, M. W., The organic chemistry of drug design and drug action. Third edition / ed.; Elsevier/AP, Academic Press, is an imprint of Elsevier: Amsterdam ; Boston; p xviii, 517 pages (2014).
Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield, B. et. al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry (2015).
Davies, D. R.; Johnson, T. M., Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer Chromatography. Journal of Chemical Education,84 (2), 318 (2007).
Taber, D. F.; Hoerrner, R. S., Column chromatography: Isolation of caffeine. Journal of Chemical Education, 68 (1), 73 (1991).

Transcript

Column chromatography is a versatile purification method used to separate compounds in a solution. A solution mixture is carried by a solvent through a column containing an adsorbent solid, called the stationary phase. The combined solvent and sample mixture is called the mobile phase.

Molecules in the mobile phase travel through the column at different rates based on their chemical properties and their affinity for the stationary phase. Thus, each compound exits the column at a different time. Once the compounds have been separated and purified they can be further processed or are ready for distribution. This video will introduce the basics of column chromatography, then demonstrate the technique with the purification of organic compounds.

In column chromatography, molecules reversibly adsorb to the stationary phase as they flow through the column, thereby slowing their progress. Compounds that interact weakly with the stationary phase are faster to exit the column, or elute. Compounds that interact strongly with the stationary phase are slower to elute. The stationary phase is an adsorbent powder or gel such as silica gel or alumina. Silica gel and alumina are highly polar so they interact strongly with polar compounds and solvents, and weakly with nonpolar molecules. The stationary phase is loaded into the column as a slurry with the solvent and is then packed by flowing solvent through the stationary phase. When properly packed, the stationary phase is homogeneous from top to bottom and contains no air bubbles or dry patches, as uneven flow caused by these irregularities interferes with the separation of compounds. The solvent, or eluent, is typically an organic solvent supplied from a reservoir. In general, nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, whereas polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. If a mixture contains compounds of significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used to elute all of the compounds of interest. The mobile phase flow rate is usually controlled by a stopcock at the bottom of the column. Pauses in flow are kept to a minimum to avoid diffusion of the compounds. The mobile phase leaving the column, called the eluate, is collected in fractions to preserve the separation of compounds. Now that you understand the principles of column chromatography, let’s go through a procedure for the purification of a mixture of organic compounds.

To begin the procedure, obtain the equipment as noted in the text. Weigh a round-bottomed flask for each compound to be isolated and record the mass. Next, weigh the sample and dissolve it in the minimum volume of solvent needed. The appropriate solvent should be predetermined using thin layer chromatography. The Rf value should be between 0.2–0.3. Then, determine the amount of silica gel required for the stationary phase based on the dry weight of the sample and the difference in migration distance of the compounds of interest based on the TLC pre-screening. Pour the appropriate amount of silica gel into an Erlenmeyer flask. Add the solvent to the silica gel until the slurry is translucent and moves freely when the flask is swirled. Next, select a column large enough that the silica gel will fill it halfway. If the column does not have a glass frit, place glass wool into the column and firmly press it to the bottom with a long rod. Cover the glass wool with about 2 cm of sand to prevent silica from passing through the glass wool. In a fume hood clamp the column to a ring stand, allowing sufficient space below to accommodate the test tubes.

Place a funnel into the column and ensure that the stopcock is closed. Pour the slurry into the column, gently tapping the sides as the slurry settles to exclude air bubbles. Rinse the funnel, flask, and walls of the column with solvent to transfer all of the gel into the column.

Place an Erlenmeyer flask under the column. Open the stopcock and allow the solvent to drain into the flask until the solvent level is just above the silica gel, and then close the stopcock. Pour about 2 cm of sand onto the gel. Gently rinse down any sand stuck to the sides of the column with solvent. Drain the solvent as needed so the sand is mostly dry, but the silica remains completely covered.

To start the separation, add the sample to the column without disturbing the sand. Use small portions of solvent to rinse down any sample adhering to the column walls and to rinse out the sample container. Carefully drain the solvent until the level is just above the silica. Then, with a pipette, gently add 4–5 mL of solvent without disturbing the sand layer. Place a funnel into the column and slowly fill with solvent. Remove the flask and replace with a labeled test tube. With the first test tube in place, open the stopcock and collect the eluate until the test tube is nearly full.

Continue collecting fractions until all desired compounds have been eluted, proceeding sequentially through the labeled test tubes. When finished, close the stopcock.

For each compound isolated, combine the pure fractions in a pre-weighed round-bottomed flask. Remove the solvent from the flask on a rotary evaporator and then weigh the round-bottomed flask containing the dry compound. For more information, see this collection’s video on rotary evaporation.

This sample contained a mixture of tetraphenylporphyrin, or TPP, and fluorenone. The dark reddish-purple TPP was eluted first, followed by the yellow fluorenone. The purity of each isolated compound was confirmed by NMR spectroscopy.

Column chromatography is used in purification and analysis in a variety of scientific fields.

High performance liquid chromatography, or HPLC, is a form of column chromatography that provides excellent separation between compounds and can incorporate specialized detectors such as a radiation detector for radiolabeled molecules. Using HPLC, a radiolabeled phospholipid can easily be isolated from a mixture of many others even if it makes up a small percent of the mixture. This information can help elucidate the production, regulation, and functions of many important biomolecules.

Flash chromatography is a variant of column chromatography in which the mobile phase moves through the column under air or gas pressure rather than by gravity flow alone.

This creates a faster flow rate, minimizing diffusion for better separation. The desired compound is collected in a few pure, concentrated fractions, as shown with thin layer chromatography, resulting in excellent post-purification yield and purity.

The usual column apparatus is not appropriate for separating small volumes, but some mixtures are not compatible with specialized techniques such as HPLC. Small-scale purification is performed with glass pipette columns, with a pipette bulb used for small-scale flash chromatography. This is particularly useful when preparing a sample for specialized purification techniques or as a final step following large-scale purification.

You’ve just watched JoVE’s introduction to column chromatography. You should now be familiar with the principles of column chromatography, a procedure for silica gel column chromatography, and some applications of the technique.

Thanks for watching!