Cromatografía en columna
Fuente: Laboratorio del Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Cromatografía en columna es una de las técnicas más útiles para purificar compuestos. Est…
1. mezcla de Gel de silicona de
- Verter el gel de sílice en un matraz Erlenmeyer. El peso del material de embalaje debe ser de aproximadamente 50 x de la muestra están separada. Si los compuestos se separaron tienen valores muy similares de Rf , puede requerir usar una mayor cantidad de sílice por muestra, que es el caso de este ejemplo.
- Lugar 10 g de sílice en el matraz de Erlenmeyer, ya que 50 mg de la muestra (45 mg de Fluorenona y 5 mg de tetraphenylporphyrin) están siendo aislados.
- Añadir el sistema de solventes (hexano/diclorometano, 70%: 30%) en el erlenmeyer que contiene el gel de sílice. Agregue suficiente solvente para asegurarse de que todo el gel de sílice es bien solvatados. La silicona no se disolverá, pero la mezcla será visualmente perceptible cuando solvatados. Una vez que se ha añadido el disolvente agitar el matraz Erlenmeyer para asegurarse de que la sílice es bien solvatados.
2. preparación de la columna
- Seleccione la columna de tamaño adecuado. Por lo general la columna se debe llenar a medio camino con mezcla de gel de silicona. Cuanto mayor sea la muestra ser purificado, el más grande la columna necesaria.
- Conecte la parte inferior de la columna con un trozo de lana de vidrio. Con una varilla larga, asegúrese de que la lana se encuentra firmemente en la parte inferior de la columna justo por encima de la llave de paso.
- Una vez que la lana esté firmemente en su lugar, aplicar una fina capa de arena sobre la lana de vidrio.
Nota: Si la columna está equipada con una frita de vidrio encima de la llave de paso, debe omitirse este paso. - Abrazadera de la columna en posición vertical en un soporte de anillo.
- Suavemente utilizando un embudo, vierta la mezcla preparada de gel de sílice en la columna. Puede que necesite añadir más disolvente para transferir la mezcla del matraz Erlenmeyer a la columna. Usando una pipeta, lave cualquier gel de silicona que se adhiere a los lados de la columna.
- Como el gel de sílice es colocar en la columna, golpee suavemente los lados de la columna para que el gel de sílice firmemente los paquetes y excluye cualquier burbuja de aire.
- Abrir la llave de paso y deje que solvente drene en un erlenmeyer limpio hasta justo antes del gel de sílice y el solvente se reúnen frente. El gel de silicona nunca debe ir seco hasta que se complete el procedimiento.
- Coloque una capa delgada de arena en la parte superior del gel de sílice (figura 1). Usando una pipeta, lave cualquier arena que puede haber pegado a los lados de la columna.
- Drenar cualquier solvente adicional hasta que la arena está seca, pero no hasta la capa de gel de silicona.
Figura 1. La configuración adecuada para una cromatografía en columna el experimento antes de la adición de la muestra.
3. Añadir la muestra a la columna
- Disolver la muestra en la menor cantidad de solvente (con el mismo disolvente que se utilizó para hacer la mezcla de gel de sílice).
- Suavemente con una pipeta, añadir la muestra a la parte superior de la columna.
- Una vez que la muestra se ha aplicado a la parte superior de la columna, abra la llave de paso y deje que el solvente drene a través de la capa de arena, pero no la capa de gel de silicona. Use una pequeña cantidad de solvente para lavar abajo cualquier muestra que puede haber se aferró a los lados de la columna. Este solvente adicional a través de la capa de la arena así como de drenaje.
4. liberador de la muestra a través de la columna
- Muy suavemente con una pipeta, añadir 4 – 5 mL de disolvente de tal manera que no moleste a la capa de arena.
- Colocar un embudo en la parte superior de la columna y muy despacio y suavemente llene el resto de la columna con el disolvente.
- Abrir la llave de paso y deje que el solvente drene a través de la columna.
- Comenzar a colectar la fase móvil como drena de la columna de tubos de ensayo.
- Tubos de ensayo deben colocarse en un bastidor de tubo de ensayo en una manera secuencial.
- Agregar más solvente a la parte superior de la columna como sea necesario hasta que todos los compuestos deseados han eluida de la columna.
5. recuperación de los componentes
- Si los compuestos son coloreados, entonces pueden ser visualmente identificados. Sin embargo, si los compuestos son incoloros, tendrán que identificarse mediante luz ulta-visible (UV) (si los compuestos contienen verbal) o con la tinción apropiada. La pureza de los compuestos puede ser verificada mediante cromatografía en capa fina.
- Identificar los tubos de ensayo que contienen, establecidos de la deseada.
- Combinar todas las fracciones que contienen el deseado aislado, establecidos en un matraz previamente tarado de (RB) de fondo redondo. Hacer esto para cada compuesto se aisló.
- Evaporar el solvente colocando el frasco de RB en el rotavapor.
- Una vez que se ha eliminado todo el disolvente, pesan el RB con el producto seco y restar el peso inicial del RB para obtener un rendimiento.
Iniciar sesión o para acceder al contenido completo. Obtenga más información sobre el acceso de su institución al contenido de JoVE aquí
La cromatografía en columna es un método de purificación versátil que se utiliza para separar compuestos en una solución. Una mezcla de solución es transportada por un solvente a través de una columna que contiene un sólido adsorbente, llamado fase estacionaria. La mezcla combinada de disolvente y muestra se denomina fase móvil.
Las moléculas en la fase móvil viajan a través de la columna a diferentes velocidades en función de sus propiedades químicas y su afinidad por la fase estacionaria. Por lo tanto, cada compuesto sale de la columna en un momento diferente. Una vez que los compuestos han sido separados y purificados, pueden ser procesados posteriormente, o están listos para su distribución. Este video presentará los conceptos básicos de la cromatografía en columna y luego demostrará la técnica con la purificación de compuestos orgánicos.
En la cromatografía en columna, las moléculas se adsorben reversiblemente a la fase estacionaria a medida que fluyen a través de la columna, lo que ralentiza su progreso. Los compuestos que interactúan débilmente con la fase estacionaria son más rápidos para salir de la columna o eluir. Los compuestos que interactúan fuertemente con la fase estacionaria son más lentos para eluir. La fase estacionaria es un polvo o gel adsorbente como el gel de sílice o la alúmina. El gel de sílice y la alúmina son altamente polares, por lo que interactúan fuertemente con compuestos polares y solventes, y débilmente con moléculas no polares. La fase estacionaria se carga en la columna como una suspensión con el solvente y luego se empaqueta haciendo fluir el solvente a través de la fase estacionaria. Cuando se empaqueta correctamente, la fase estacionaria es homogénea de arriba a abajo y no contiene burbujas de aire ni parches secos, ya que el flujo desigual causado por estas irregularidades interfiere con la separación de los compuestos. El disolvente, o eluyente, suele ser un disolvente orgánico suministrado desde un depósito. En general, los disolventes no polares solo eluyen compuestos no polares, mientras que los disolventes polares eluyen compuestos polares y no polares. Si una mezcla contiene compuestos de polaridades significativamente diferentes, se puede utilizar una serie de disolventes cada vez más polares para eluir todos los compuestos de interés. El caudal de la fase móvil generalmente se controla mediante una llave de paso en la parte inferior de la columna. Las pausas en el flujo se mantienen al mínimo para evitar la difusión de los compuestos. La fase móvil que sale de la columna, llamada eluido, se recoge en fracciones para preservar la separación de los compuestos. Ahora que comprende los principios de la cromatografía en columna, repasemos un procedimiento para la purificación de una mezcla de compuestos orgánicos.
Para comenzar el procedimiento, obtenga el equipo como se indica en el texto. Pese un matraz de fondo redondo para cada compuesto que se va a aislar y registre la masa. A continuación, pese la muestra y disuélvala en el volumen mínimo de disolvente necesario. El disolvente adecuado debe determinarse previamente mediante cromatografía en capa fina. El valor de Rf debe estar entre 0,2 y 0,3. A continuación, determine la cantidad de gel de sílice necesaria para la fase estacionaria en función del peso seco de la muestra y la diferencia en la distancia de migración de los compuestos de interés en función del precribado de TLC. Vierta la cantidad adecuada de gel de sílice en un matraz Erlenmeyer. Agregue el solvente al gel de sílice hasta que la suspensión sea translúcida y se mueva libremente cuando se agite el matraz. A continuación, seleccione una columna lo suficientemente grande como para que el gel de sílice la llene hasta la mitad. Si la columna no tiene una frita de vidrio, coloque lana de vidrio en la columna y presiónela firmemente contra el fondo con una varilla larga. Cubra la lana de vidrio con unos 2 cm de arena para evitar que la sílice pase a través de la lana de vidrio. En una campana extractora, sujete la columna a un soporte de anillo, dejando suficiente espacio debajo para acomodar los tubos de ensayo.
Coloque un embudo en la columna y asegúrese de que la llave de paso esté cerrada. Vierta la suspensión en la columna, golpeando suavemente los lados a medida que la suspensión se asienta para excluir las burbujas de aire. Enjuague el embudo, el matraz y las paredes de la columna con solvente para transferir todo el gel a la columna.
Coloque un matraz Erlenmeyer debajo de la columna. Abra la llave de paso y deje que el disolvente se drene en el matraz hasta que el nivel de disolvente esté justo por encima del gel de sílice y, a continuación, cierre la llave de paso. Vierte unos 2 cm de arena sobre el gel. Enjuague suavemente cualquier arena pegada a los lados de la columna con solvente. Drene el solvente según sea necesario para que la arena esté casi seca, pero la sílice permanezca completamente cubierta.
Para iniciar la separación, agregue la muestra a la columna sin alterar la arena. Utilice pequeñas porciones de disolvente para enjuagar cualquier muestra que se adhiera a las paredes de la columna y para enjuagar el recipiente de la muestra. Drene con cuidado el solvente hasta que el nivel esté justo por encima de la sílice. A continuación, con una pipeta, añada suavemente 4,5 mL de disolvente sin alterar la capa de arena. Coloque un embudo en la columna y llénelo lentamente con solvente. Retire el matraz y reemplácelo con un tubo de ensayo etiquetado. Con el primer tubo de ensayo en su lugar, abra la llave de paso y recoja el eluido hasta que el tubo de ensayo esté casi lleno.
Continúe recolectando fracciones hasta que todos los compuestos deseados hayan sido eluidos, procediendo secuencialmente a través de los tubos de ensayo etiquetados. Cuando termine, cierre la llave de paso.
Para cada compuesto aislado, combine las fracciones puras en un matraz de fondo redondo previamente pesado. Retire el disolvente del matraz en un evaporador rotativo y, a continuación, pese el matraz de fondo redondo que contiene el compuesto seco. Para obtener más información, consulte el video de esta colección sobre evaporación rotativa.
Esta muestra contenía una mezcla de tetrafenilporfirina, o TPP, y fluorenona. Primero se eluyó el TPP de color púrpura rojizo oscuro, seguido de la fluorenona amarilla. La pureza de cada compuesto aislado se confirmó mediante espectroscopia de RMN.
La cromatografía en columna se utiliza en la purificación y el análisis en una variedad de campos científicos.
La cromatografía líquida de alta resolución, o HPLC, es una forma de cromatografía en columna que proporciona una excelente separación entre compuestos y puede incorporar detectores especializados, como un detector de radiación para moléculas radiomarcadas. Con el uso de HPLC, un fosfolípido radiomarcado se puede aislar fácilmente de una mezcla de muchos otros, incluso si constituye un pequeño porcentaje de la mezcla. Esta información puede ayudar a dilucidar la producción, la regulación y las funciones de muchas biomoléculas importantes.
La cromatografía flash es una variante de la cromatografía en columna en la que la fase móvil se mueve a través de la columna bajo presión de aire o gas en lugar de solo por flujo de gravedad.
Esto crea un caudal más rápido, minimizando la difusión para una mejor separación. El compuesto deseado se recoge en unas pocas fracciones puras y concentradas, como se muestra con la cromatografía en capa fina, lo que da como resultado un excelente rendimiento y pureza posteriores a la purificación.
El aparato de columna habitual no es apropiado para separar pequeños volúmenes, pero algunas mezclas no son compatibles con técnicas especializadas como la HPLC. La purificación a pequeña escala se realiza con columnas de pipeta de vidrio, con un bulbo de pipeta utilizado para cromatografía flash a pequeña escala. Esto es particularmente útil cuando se prepara una muestra para técnicas de purificación especializadas o como paso final después de la purificación a gran escala.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la cromatografía en columna. Ahora debería estar familiarizado con los principios de la cromatografía en columna, un procedimiento para la cromatografía en columna con gel de sílice y algunas aplicaciones de la técnica.
¡Gracias por mirar!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.